elemeket

absztrakt

A fő

A felnőtt típusú follikuláris limfóma 80% -a BCL2 fehérje expresszió hiányában. Nemrégiben Martin-Guerrero és mtsai. leírta a heterozigozitás visszatérő elvesztését az 1p36-nál és a TNFRSF14 mutációkkal való összefüggést a gyermek follikuláris limfómában szenvedő betegek kis csoportjában. 6.

Összehasonlításképpen, a posztgerminális memóriaközpont B-sejtjeiből eredően a nodális perifériás zónák gyermeki lymphoma hasonló építészeti és immunfenotípusos jellemzőkkel rendelkezik, mint a felnőtt típus; a gyermeki csomópont peremzónájának markáns és jellegzetes limfómája azonban a férfiak túlsúlyát mutatja (kb. 20: 1), és többnyire a fej és a nyak területén lokalizálódik. 7, 8 Ez a limfóma egy 1. stádiumú betegség, kiváló prognózissal és általában alacsony kiújulási gyakorisággal rendelkezik. Genetikai rendellenességekről számoltak be a gyermek nyirokcsomó peremzónájában, a leggyakoribb változás a 18-as triszómia (17%), amely szintén gyakori citogenetikai rendellenesség a felnőtt típusú limfóma-lymphomában. 10, 11 A gyermek típusú follikuláris limfómához hasonlóan a gyermeki nyirokcsomó-limfóma végleges diagnosztizálása a perifériás zónákban és a hasonló morfológiai entitásoktól való elválasztás továbbra is kihívást jelent.

Mivel a follikuláris limfóma gyermekkori típusa és a gyermek nodális peremzónás limfóma között van némi átfedés, és hiányzik a különböző entitások genetikai táját leíró szakirodalom, egész exom mély szekvenálást végeztünk (> 140-szeres lefedettség) 10 esetek. gyermek perifériás zóna nyirokcsomók és gyermek típusú follikuláris limfóma, valamint Sanger szekvencia két másik esetben e ritka daganatok jelentős mutációs jelentőségének jellemzésére, valamint további vezető mutációk és az érintett biológiai útvonalak keresésére. Elemzésünk újszerű, visszatérő szomatikus pontmutációt azonosított a gyermekkori follikuláris limfómában a transzkripciós faktor interferon-szabályozó faktor 8/interferon konszenzust kötő fehérjében (IRF8/ICSBP), c. 197A> G, kódolva a p.Lys66Arg-t. Más szomatikus variánsokat figyeltek meg a gyermek típusú follikuláris limfómában és a gyermek nodalis marginális zóna limfómában, beleértve a transzkripcióban részt vevő gének mutációit, az intracelluláris jelátvitelt és a sejtek szerveződését, bár a nem szinonim mutációk általános előfordulása általában alacsony volt (4,6 mutáció per ügy).

Anyagok és metódusok

Esetválasztás

A Stanford University Medical Center és a Seattle Gyermekkórház Patológiai Osztályának esettanulmányait 1996 és 2015 között vizsgálták marginalis zóna limfómával vagy follikuláris limfómával diagnosztizált esetekben 13, 14 éves betegeknél. Röviden: a formalin-fixált szövetből DNS-t nyertek. paraffin Qiagen DNeasy készletek felhasználásával a gyártó protokolljai szerint. Az Agilent SureSelect Exon V5 céldúsító rendszert használták az 51 Mb-os exoma gazdagításához az Illumina Hiseq 2500 V3 platform szekvenálása után, 100 bp párosított végpárosítással, 200 × nagy kimeneti mód lefedettséggel, 2 × 100 PE olvasási hosszúsággal.

Igazítás, egy nukleotid variáns, másolatszám variáns és Indel elemzés

Sanger IRF8 szekvenálása

Sanger szekvenálást végeztünk az IRF8 jelölt variánsának kimutatására PrimerQuest felhasználásával tervezett primerekkel; a primereket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. Az amplifikált DNS-t szekvenáltuk és 4Peaks segítségével vizualizáltuk. 17.

Több faj összehangolása és hatásának előrejelzése egyetlen nukleotidvariánssal

A MULTIZ gerinces összehasonlító adatokat az UCSC Genome böngészőből nyertük, jelentésazonosító: hg38. Az IRF8 1. és 2. exont tartalmazó transzlált régiókat kivontuk és elemeztük a K66 konzerváltság szempontjából. A fehérje szerkezet homológiájának háromdimenziós modellezését a SWISS-MODEL alkalmazásával hajtottuk végre, a leírtak szerint. 18 PolyPhen-2 és SIFT predikciós algoritmust használtunk a fent leírtak szerint. 19, 20

az eredmény

A teljes komponensű szekvenciák szekvenálása és a gyermek follikuláris limfóma és a gyermek perifériás zóna limfóma adatelemzése

A potenciális meghajtó mutációk azonosítása, valamint a gyermek típusú follikuláris limfóma és a gyermek nodális peremzónás limfóma mutációs tájának jellemzése érdekében teljes példával illusztrált mély szekvenálást (> 140-szeres lefedettséget) hajtottunk végre gyermekkori típusú follikuláris limfóma esetén., egy pár normális daganattal és négy esetben a gyermekkori nodális marginális zóna lymphomával. 18 éves vagy annál fiatalabb betegeknél (tartomány: 12–18 év) a gyermek-típusú follikuláris limfóma és a gyermeki csomó peremzónájának limfatikus eseteit azonosították. Az eseteket megvizsgáltuk, és a morfológiai és immunfenotípusos jellemzők megerősítették a megfelelő diagnózist. A betegek demográfiáját és klinikai tüneteit az 1. táblázat részletezi.

Asztal teljes méretben

Három különböző variáns hívó algoritmusból (Mutect, SNPPET és VarScan) álló analitikai folyamatunk segítségével szomatikus nem szinonim mutációterhelést tapasztaltunk esetenként alacsonyan, esetenként átlagosan 4,6 mutációval (2-13 tartomány). A hamis negatívumok minimalizálása érdekében enyhébb szűrőparamétereket használtunk, ideértve az allél legalább 10% -ának minimális gyakoriságát és a követelményt, hogy lefedjük 10 olvasás/egyetlen nukleotid lefedettséget. Összesen 46 nem szinonim szomatikus mutációt azonosítottak, amelyek 44 különböző gént érintenek, köztük missense mutációkat és nonszensz mutációkat. 3 A gyermekkori follikuláris limfóma esetében 32 egy nukleotid variánst azonosítottunk a transzkripcióban, az intracelluláris szignálban és a sejtproliferációban részt vevő génekben (2. táblázat). Kevesebb mutációt találtak a nodális marginális zónával rendelkező gyermekkori limfómában, 14 nukleotidvariáns figyelhető meg a sejtek tapadásában, a citokin szabályozó elemekben és a sejtek proliferációjában szerepet játszó génekben (3. táblázat).

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Gyermek típusú follikuláris limfóma esetén a c.197A> G visszatérő szomatikus pontmutációt azonosítottuk a p.Lys66Arg-t kódoló transzkripciós faktor interferon faktor regulátor 8/interferon konszenzust kötő fehérjében (IRF8/ICSBP). Ezt az egyedülálló egyetlen nukleotid variánst hat gyermekkori follikuláris limfóma mintából háromban azonosították (2. táblázat). Hiányzott az 1. eset megfelelő normál szövetmintája. Sanger szekvenálás mindhárom esetben megerősítette az egy nukleotid variánsokat. Sanger szekvenálást is végeztünk az IRF8 variáns kimutatására a gyermekkori follikuláris limfóma többi esete, a perifériás zónában lévő összes gyermek nodalis nyirokzóna és 22 felnőtt típusú follikuláris lymphoma esetén; ezek az esetek negatívak voltak a c.197A> G esetében az IRF8-ban (az adatokat nem mutatják). Nem figyeltek meg visszatérő szomatikus mutációkat a gyermek nodalis marginális zóna lymphomájában.

Az IRF8 az IRF transzkripciós faktorok családjának tagja, főleg az immunrendszer sejtjeiben expresszálódik, amely összetett szabályozó hálózatok tagja, amely hozzájárul a hematopoietikus differenciálódáshoz, a sejtciklus szabályozásához és az apoptózishoz. Az IRF8 fehérje egy N-terminális DNS-kötő domént és egy IRF C-terminális asszociációs domént tartalmaz. A p.Lys66Arg változás konzervatív töltéssemleges maradékhelyettesítés az IRF8 DNS-kötő doménjében (1a. És b. Ábra): specifikusan a 2. hurok, amely az alfa-spirál-2 C-terminálisa (1b. Ábra). Bár ez a hosszú hurkú régióba esik, úgy gondolják, hogy ez az IRF4 család egy nagyon homológ tagjától származó extrapoláción és a PU.1/IRF4/DNS komplex kristályszerkezetén alapuló álláspont úgy gondolja, hogy a nagyobb csoport. Ezenkívül az aminosavszekvencia megőrzésének értékelése az IRF8-ban a 66. pozícióban 100% -os szekvencia azonosságot mutatott, összehasonlítva 97 gerinces fajhoz kapcsolódó genomokkal (1c. Ábra és kiegészítő S2. Táblázat). Ezenkívül a PolyPhen2 és a toleráns (SIFT) algoritmusok intoleráns válogatása megjósolja a p.Lys66Arg megváltoztatásának káros hatását.

follikuláris

Ismételt pontmutáció az IRF8 DNS-kötő doménjében. ( a ) Az IRF8 fehérje sematikus rajza a DNS-kötő domén és az IRF asszociációs doménjének meghatározásával. A csillagok jelzik a K66R csere esetek helyét és számát. ( b ) DNS-kötő domén szalagmodellje vizualizált R66 oldallánccal. Beágyazott, sávos modell vad típusú szekvenciával. c ) Az IRF8 többféle fajtájú elrendezése, amely az 1. és 2. exont (1-87. Aminosavak) tartalmaz, fokozottan konzervált lizinnel a 66. pozícióban, több fajon.

Teljes méretű kép

Másolatszámváltozatok és fúziós detektálás

A példányszám és/vagy a szerkezeti variáció gyakran társul a hematolfoid neoplazmákkal. Értékeltük a gyermekkori follikuláris limfóma és a gyermekkori nyirokcsomó nyirokcsomó limfóma párosított végeinek összesített készletét, hogy meghatározzuk a kópiaszám és a genomi fúzió és a töréspontok változását. CNV-seq-t használtunk a DNS-kópiaszám-variációk azonosítására a kontrollhoz képest kétszeres növekedéssel vagy csökkenéssel. Mivel nem minden mintának volt párosulása normál szövet mellett, az összes mintát összehasonlítottuk az 1. eset párosított szövettanilag igazolt, nem detektált nyirokcsomójával (normál szövet). Ebben az elemzésben nem azonosítottunk visszatérő kromoszóma helyet, amely jelezné a genomiális kópiaszám nagy változását. gyermek típusú follikuláris limfómában vagy gyermeki nodális peremzónás limfómában.

A genomi átrendeződések kimutatására a korábban leírt Fusion szoftver eszközt és a Kromoszomális Transzlokáció Számláló Algoritmust használtuk. Ez a rendkívül érzékeny és specifikus módszer páros végű DNS-szekvenálási adatokat használ a transzlokációk, inverziók és nagy deléciók gyors azonosítására. Három szerkezeti eltérést azonosítottak a gyermek típusú follikuláris limfóma három különálló esetében (S3 kiegészítő táblázat): két változat deléció volt, amely az immunglobulin kappa és a variábilis régió csatlakozó régióját tartalmazta (4. és 6. eset), a harmadik pedig az immunoglobulin nehéz lánc variábilis régió (1. eset). Ezek a deléciók valószínűleg az immunglobulin nehézlánc gén és az immunglobulin kappa gén normális átrendeződését jelentették (1. táblázat). Gyermekkori follikuláris limfómában nem azonosítottak génfúziókat. A transzplantációkat, inverziókat vagy deléciókat nem azonosították a gyermek nodalis marginális zóna lymphomájában.

Összehasonlítás a follikuláris limfóma változataival felnőtteknél és a nodális nyirokzóna marginális zónája felnőtteknél

Tekintettel a gyermektípusú follikuláris limfóma és a gyermek nodális peremzónás limfóma hasonló morfológiai és fenotípusos jellemzőire a megfelelő felnőtt típusokkal, arra törekedtünk, hogy összehasonlítsuk az azonosított egyetlen nukleotidvariánsokat a felnőtt típusú és felnőtt follikuláris limfóma változásainak publikált jelentéseivel. nodalis marginális zóna lymphoma. Nem figyeltek meg mutációkat gyermekkori follikuláris limfómában a kromatin szabályozó elemekben (CREBBP, EZH2, KMT2D (MLL2), a TNF család tagjai (TNFRSF14), NF-κB vagy mTORC1 jelátvitelben; 25, 26, 27, 28 azonban A 2. eset, amely mutációt tartalmazott az IRF8-ban, a PAX5 transzkripciós faktor mutációja, p.Gly183Ala. Ezt a mutációt nem figyelték meg párosított normál szövetben, míg ezt a PAX5 mutációt korábban nem publikálták felnőtt típusú follikuláris limfómában. a G183-ban B-limfoblasztos leukémiában szenvedő betegeknél azonosították

vita

Szemben a felnőtt típusú follikuláris limfómával, amely a BCL2 jellegzetes kromoszóma-transzlokációját, valamint más gyakori kromoszóma- és génváltozásokat mutat, a gyermeki típusú follikuláris limfóma kialakulásának genetikai alapját nem határozták meg egyértelműen. 32 Martin - Guerrero és mtsai. A közelmúltban a heterozigozitás ismételt elvesztéséről számoltak be az 1p36-nál, egy olyan helyen, amely általában megváltozott a felnőtt típusú follikuláris limfómában, és amely elsősorban TNFRSF14 mutációkkal társult. 6 EZH2 mutációról is beszámoltak ugyanabban a kohorszban, amely felnőtt formában némi támogatást nyújt a potenciális genetikai mechanizmusokhoz. Az IRF8-ot nemrégiben leírták, hogy egy visszatérően mutált gén a felnőtt típusú follikuláris limfóma eseteinek kis százalékában. A variánsok túlnyomórészt az IRF8 C-terminális doménjében voltak, tisztázatlan funkcionális vonatkozásokkal, és nem számoltak be ismételt nukleotid-változásról. A specifikus p.Lys66Arg szubsztitúció azonosítása a gyermek típusú follikuláris limfóma kohorsz jelentős részében nagyrészt közös és kritikus változást jelez, amely a betegség kialakulásához vezet. Ezenkívül, bár hasonló gén van jelen a felnőtt és a gyermekkori formák között, a DNS-kötő domén ismételt változásai a betegség potenciálisan egyedülálló eredetére utalnak.

Az IRF8 és az IRF4 közötti kölcsönhatásról nemrégiben írtak le, hogy társszabályozó szerepet játszik az Epstein-Barr vírusfertőzésben. Az IRF8 és az IRF4 közvetlenül kölcsönhatásba lépnek az Epstein-Barr vírusantigén antitest 3C N-terminális doménjével, amelyet az Epstein-Barr vírus kódol, és olyan molekuláris komplexet alkot, amely stabilizálja az IRF4-et, és az IRF8 proteaszómától függő lebomlásához vezet. Az IRF8 expresszió és a Fas által közvetített útvonalon keresztüli apoptózissal szembeni rezisztencia közötti inverz kapcsolatot összefüggésnek tekintik az in vitro apoptózissal szembeni fokozott rezisztenciával és metasztatikus potenciállal. Tekintettel az EBV-fertőzés és a megváltozott IRF8-aktivitás összefüggésére számos limfoproliferatív rendellenesség kialakulásával és transzformációjával, érdekes feltételezni, hogy az IRF8 kritikus láncszem számos hematopoietikus rendellenesség limfomagenesisében.

Ezenkívül mutációt azonosítottunk a PAX5/BSAP transzkripciós faktorban, p.Gly183Ala. Ezt a G183 aminosavat fontos mutációként azonosították B-limfoblasztos leukémia eseteiben. Funkcionális vizsgálatok alapján a G183 mutációi befolyásolják a PAX5 transzkripciós aktivitását és megváltoztatják a neoplazia iránti érzékenységet. Ezért nem meglepő, hogy ez a mutáció további hatással lehet a gyermek típusú follikuláris lymphoma progressziójára és genezisére. Ez a mutáció nem volt jelen a megfelelő normál szövetben, és más esetekben sem figyelték meg a gyermek típusú follikuláris limfómát vagy a gyermek nodális peremzónás limfómát.

Csakúgy, mint a gyermek típusú follikuláris limfómában, a csomóperem gyermekkori limfómájának genetikai alapja sem ismert. Rizzo és mtsai. Beszámoltak a perifériás zónákban előforduló gyermekkori nyirokcsomók 21% -áról, amelyek genetikai változásokat tartalmaztak fluoreszcencia in situ hibridizációval és reverz transzkripciós PCR-rel. A vezető rendellenesség a 18-as triszómia (17%) volt, amelyet felnőtt típusú noduláris marginális zóna limfómában írtak le. Kohorszunk nem mutatott változást a kópiaszámban a triszómia alátámasztására. Az AMOTL1 esetében azonban azonosítottunk egy szomatikus változatot a csomó peremzónájú gyermeki lymphomában, amely szintén szerepet játszik a lép peremzónájának limfóma patogenezisében. Ez a megállapítás azt sugallja, hogy bár a gyermeki nodális peremzónás limfóma és a felnőtt típusú nyirokcsomó-margók közös genetikai rendellenességeket mutatnak, kohorszunk genetikailag elkülönül a felnőtt típusú limfóma-limfómától.

A gyermeki follikuláris limfocita kohortunktól eltérően a recidiváló szomatikus mutációt a csomó peremzónájában lévő gyermeki nyirokcsomók esetében a teljes exoma szekvenálásával nem sikerült azonosítani. Mivel a mutációs terhelés viszonylag alacsonyabb volt a limfóma gyermek nodalis marginális sávjában, mint a gyermek típusú follikuláris lymphomában (esetenként 3,25 mutáció, szemben esetenként 4,8 mutáció), ez azt jelezheti, hogy a betegségnek hiányozhat közös és specifikus vezetője. A legújabb kutatások azonban arra utalnak, hogy a nem kódoló régiókban a szomatikus mutációk tartalmazhatnak potenciális mozgató mutációkat, sőt a fehérjét kódoló gének szinonim változása funkcionális szerepet játszhat a tumor fejlődésében. 43, 44, 45 Ezenkívül a felnőttkori follikuláris limfóma epigenetikus tájának módosítása a KMT2D metiltranszferáz (MLL2) mutációival a közelmúltban kimutatták, hogy prolimfomágén; további tanulmányozást igényel annak lehetősége, hogy a nem kódoló DNS-mutációk vagy epigenetikai változások a perifériás zónából származó gyermeki nodális limfómához vezethetnek. 46

Összességében ez az első leírás a gyermek follikuláris limfóma és a gyermek nodalis marginális zóna limfóma széles szomatikus mutációs tájáról. Az adatok a megfelelő felnőtt típusú betegséghez képest eltérő fejlődési mechanizmust támasztanak alá, mivel tipikus mutációs ország nem volt jelen felnőtt típusú nodális peremzónás limfómában és felnőtt típusú follikuláris limfómában. Ezenkívül egyetlen, az IRF8-ban ismétlődő pontmutációt azonosítottak olyan gyermekkori follikuláris limfóma esetek egy részében, amelyekről azt hitték, hogy káros hatást váltanak ki. Tekintettel az IRF8 funkcionális szerepére a B-sejtekben és a transzkripcióban, érdekes feltételezni, hogy ez a mutáció mozgatórugóként szolgálhat a meghajtó fejlődésében.