szempontjából

  • absztrakt
  • A fő
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • A tanulmány résztvevői
  • Vérminták
  • Plazma-aminosav-analízis AAA alkalmazásával
  • Szárított vérfoltokból származó aminosavak elemzése HPLC-vel, fluorometriás kimutatással
  • Szárított vérfoltokból származó aminosavak elemzése MS/MS tandem segítségével
  • Diéta besorolás
  • Statisztikai analízis
  • AZ EREDMÉNYEK
  • VITA

absztrakt

Cél: A fenilalanin monitorozása a vérben kulcsfontosságú a fenilketonuria kezelésében. A vér fenilalanin-koncentrációjának mérésére három módszert hasonlítottunk össze: aminosav-analizátor, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia fluorometrikus detektálással és tandem tömegspektrometria.

Módszerek: 22 fenilketonuriában szenvedő 12-48 éves beteget vizsgáltunk, akik részt vettek anyagcseretáborunkban. A vért heparinált csövekbe vettük (aminosav-analizátorral végzett elemzéshez) vagy szűrőpapírra (nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás analízishez fluorometrikus detektálással és tandem tömegspektrometriával).

Eredmények: Az aminosav-analizátorral mért plazma fenilalanin-koncentráció a vérben szignifikánsan magasabb volt, mint a teljes vérből szűrőpapíron nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (különbség: 102 μM; 95% konfidencia intervallum: 23, 181) és tandem eredményeként kapott koncentráció tömegspektrometria (különbség: 137 μM 95% konfidencia intervallum: 58, 216). A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás és tandem tömegspektrometriás fenilalanin-koncentrációk nem különböztek szignifikánsan (P = 0,5).

Következtetések: A fenilalanin vérszintjének az élelmiszer-tapadás ellenőrzése során az orvosoknak tisztában kell lenniük az alkalmazott módszerrel; a szűrőpapíron végzett teljes vérvizsgálatok következetesen körülbelül 15% -kal alacsonyabbak voltak, mint a plazmaelemzések.

A fő

A fenilketonuria (PKU) egy veleszületett anyagcsere-hiba, amely recesszív genetikai mutációból ered, általában a fenilalanin-hidroxilázt (a fenilalanin (Phe) aminosav (Phe) tirozinná (Tyr) hidroxilezéséért felelős enzim) kódoló génben, amely fontos köztitermék a neurotranszmitterek. Kezelés nélkül a Phe PKU metabolitjai felhalmozódnak és a neurotranszmitterek csökkennek, ami mentális retardációhoz, viselkedési rendellenességekhez és görcsrohamokhoz vezet. Ez a negatív hatás azonban diétás kezeléssel sikeresen megakadályozható, ha az élet első néhány napján elkezdődik, így most minden állam felveszi a PKU-t újszülött szűrőpaneljeibe.

Bár nincsenek univerzális irányelvek, a PKU kezelésének általánosan elfogadott megközelítése egy szigorú étrend, amely tartalmazza a vér Phe-koncentrációjának fenntartásához szükséges intakt fehérje mennyiséget a kezelési tartományban, és Phe-mentes metabolikus képlettel (azaz orvosi diéta). ), hogy a vér Phe-koncentrációja legalább 6 éves korban ne haladja meg a 360 μM-t (6 mg/dl; μM-ről mg/dl-re történő átszámításakor osztva 60-mal). 1 Az alacsonyabb Phe-koncentrációt normál kognitív képességekkel társították serdülőknél és felnőtteknél, ami azt sugallja, hogy optimális eredmények érhetők el, ha a Phe-szintet 12 évig 120-360 μM és 120-900 μM értéken tartják. 2 A vér Phe-szintjének szigorú ellenőrzése szintén kritikus a terhesség alatt; az anyától született csecsemő, akinek PKU-ja nincs metabolikus kontroll alatt, mentális retardációban, mikrokefáliában és veleszületett szívelégtelenségben szenvedhet. 3

Az egész életen át tartó étkezési szokásokra való törekvés kritikus szükségletet jelent a vér Phe szintjének egyszerű, gyors és pontos módszereire. Az újszülött PKU egyszerű szűrési módszerét, a Guthrie4 baktérium gátlási tesztet több mint négy évtizede alkalmazzák. Azóta számos új módszert fejlesztettek ki, köztük aminosav-analizátort (AAA), fluorometriát, 5 nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC), 6, 7 és tandem tömegspektrometriát (MS/MS). 8., 9. Ezek az új technikák létfontosságúak az újszülöttek szűrésének elvégzésének pontosságának és sebességének javításához, 10, 11, de kevés tanulmány vizsgálta ezen módszerek érvényességét az abszolút vér Phe-koncentrációk kvantitatív elemzéséhez. figyelemmel kíséri a betegeket.

A PKU-ban szenvedő betegek különböznek az aktív enzim mennyisége, a gyógyászati ​​ételek ízpreferenciái és az előírt étrend követésére való hajlandóságuk tekintetében. Mindezek a tényezők a kezelést nagyon egyénivé és a monitorozás kritikussá teszik. Az Emory Egyetem Orvosi Genetikai Osztályán rendszeresen találkozunk PKU-ban szenvedő betegekkel az anyagcsere klinikákon és az éves nyári táborban, ahol az AAA segítségével vért gyűjtünk és elemzünk. E látogatások között a betegek ujjlenyomatot vesznek otthon, vért alkalmaznak a szűrőpapírhoz, és elküldik a mintát klinikánkra, ahol azt HPLC-vel vagy később MS/MS elemzi. Mivel valószínűleg ugyanannak a betegnek a vérét elemzik AAA-val és akár HPLC-vel, akár MS/MS-vel, vagy valószínűleg mind a három módszerrel, amelyet laboratóriumainkban jelenleg használnak, arra voltunk kíváncsiak, hogy összehasonlítsuk az e három módszerrel kapott vér Phe-koncentrációkat. Ezért az volt a célunk, hogy elemezzük, hogy a három módszer (AAA plazma és HPLC, valamint teljes vérszűrő papírok MS/MS) hogyan hasonlítható össze a vér Phe koncentrációjának monitorozásával.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A tanulmány résztvevői

Az Emory Egyetem lányainak anyagcseretáborát 1994-ben hozták létre azon serdülők igényeinek kielégítésére, akiknek meg kell birkózniuk a korlátozó étrend és a vérben a szükséges Phe-koncentráció fenntartásával. A legfontosabb 12 serdülő lány megcélzása volt, mivel a gyenge anyagcsere-ellenőrzés utódaikra gyakorolt ​​potenciálisan káros hatásai voltak; újabb táboraink minden korosztályú nőkkel bővültek. A táborlakók egy hetet töltenek a campus házában kutatók és anyagcsere-táplálkozási szakemberek mellett, akik "tábori tanácsadóként" szolgálnak. A táborok tevékenységei magukban foglalják a PKU és az étrendoktatást, a főzőtanfolyamokat, az orvosi ételek elkészítését, az új kiegészítők mintavételét és a szociális utakat. Az elemzés adatait a 2004-es heti tábor résztvevőitől kaptuk: 25 12–48 éves lány és nő.

Vérminták

A tábor első és utolsó reggelén a résztvevők ellátogattak az Emory Egyetem Általános Klinikai Kutatóközpontjába (GCRC), ahol megmérték magasságukat és súlyukat. A vért (2-3 ml) egy heparinizált csőbe gyűjtöttük AAA-analízishez, és közvetlenül a vérgyűjtő csövekből származó szűrőpapírra HPLC-analízishez fluorometrikus detektálással, rúd MS/MS. A szülők (ha a táborozó 18 évnél fiatalabb volt) vagy a táborozók a tábor megkezdése előtt tájékozott beleegyezést adtak, és minden adatgyűjtést az Emory Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete jóváhagyott.

Plazma-aminosav-elemzés AAA alkalmazásával

Az aminosav-elemzéshez AAA Beckman 6300 AAA-t használtunk, egy soros kolorimetriás detektorral felszerelve, a korábbiakban leírtak szerint, 13 kisebb módosításokkal. A plazmamintákat azonos térfogatú, 6% -os szulfosalicilsavval kivontuk, és az elemzés előtt 400 μl felülúszót összekevertünk 500 μl lítium-B pufferrel és 100 μl 0,25 mM S-amino-etil-ciszteinnel (SAEC). A mintát Beckman nagy hatásfokú kationcserélő oszlopra (10 x 0,4 cm) injektáltuk, és a szabad aminosavakat Beckman Coulter A, D, E és F lítium pufferek (pH 2,9-3,9 között) kombinációjával elválasztottuk. változó ioncserélő program.erő és hőmérséklet. Ezután az aminosavakat kolorimetriásan mértük 570 és 440 nm-en, az oszlop utáni derivatizálását követően ninhidrinnel. Kalibrátorként standard Beckman-keveréket használtunk. Beckman System Gold szoftvert használtak a mintában jelenlévő aminosavak azonosítására és mennyiségi meghatározására, azok retenciós ideje és abszorbanciaértékei alapján.

Szárított vérfoltokból származó aminosavak elemzése HPLC-vel, fluorometriás kimutatással

Szárított vérfoltokból származó aminosavak elemzése MS/MS tandem segítségével

A vérmintát tartalmazó szűrőpapírból 3 mm átmérőjű kört lyukasztunk ki, és ultrahangos kezeléssel 20 percig extrahálunk 100 μl metanollal, amely stabil izotóppal jelzett belső aminosav-standardokat tartalmaz. Az oldószer lepárlása után az aminosavakat 3 N butanol-HCl-oldattal 15 percig 65 ° C hőmérsékleten butilezzük. Szárazra párologtatás után a mintákat 100 μl mozgófázisban (80% acetonitril) oldjuk fel. Az MS/MS elemzéshez Waters 2795 HPLC rendszerű Micromass Quattro mikrotandem tömegspektrométert használtunk. Az LC áramlási sebességet 0,15 ml/perc kezdeti áramlási sebességgel, 0,12 perc = 0,04 ml/perc, 1,1 perc = 0,6 ml/perc és 1,2 perc = 0,15 ml/perc kezdeti áramlási sebességgel programoztuk, majd 0,8 perc egyensúlyt kezdeti áramlás a következő injekcióhoz. A semleges 102 veszteség a pozitív elektrospray ionizációs sémában kimutatta az L-Phe-t és az L-Tyr-t. A tömegspektrométer paraméterei a kapillárisfeszültség 3,5 kV-on, a kúpfeszültség 35 V-nál, az ütközési energia pedig 25 V. Az ütközési gáz argon volt. Az L-Phe és az L-Tyr intenzitását összehasonlítottuk belső standardokkal jelzett stabil izotópjaikkal. Az adatok elemzéséhez a NeoLynx szoftvert használták.

Diéta besorolás

A táborlakók közvetlenül a tábor első napja előtt 3 napig teljesítették a 3 napos étkezési nyilvántartást, amelyet a Ross AAA szoftverprogram segítségével elemeztünk (3.1 verzió, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzéshez SAS-t (9.1 verzió, SAS Institute, Cary, NC) használtunk. Három táborozót kizártunk hiányos adatok miatt (kora reggeli repüléseik voltak, és elhagyták a helyszínt, mielőtt meglátogatták volna a GCRC-t vérméréshez és -gyűjtéshez), hogy a végső mintanagyság n = 22 legyen. E három módszer mindegyikéhez az összes mintát másolat és használt.átlag. Ennek a három módszernek az összehasonlításához kiszámoltuk a legkisebb négyzetek átlagának különbségét (PROC MIXED a SAS-ban) és létrehoztunk Bland-Altman különbségi grafikonokat. 15 P

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének Bland-Altman-diagramja (aminosav-analizátor - nagy teljesítményű folyadékkromatográfia) az e két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentrációhoz képest. Az átlagos százalékos különbséget egy folytonos vonal, a 95% -ot pedig a határok szaggatott vonallal jelzik.

Teljes méretű kép

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének (aminosav-analizátor - tandem tömegspektrometria) Bland-Altman diagramja az e két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentrációhoz viszonyítva. Az átlagos százalékos különbséget egy folytonos vonal, a 95% -ot pedig a határok szaggatott vonallal jelzik.

Teljes méretű kép

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének Bland-Altman-diagramja (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia - tandem tömegspektrometria) és a két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentráció aránya. Az átlagos százalékos különbséget egy folytonos vonal, a 95% -ot pedig a határok szaggatott vonallal jelzik.

Teljes méretű kép

VITA

Jelentős különbségeket találtunk a vér Phe koncentrációiban, amelyet AAA, HPLC és MS/MS mértünk. Az AAA plazma-analízis a vér Phe-koncentrációjának legnagyobb értékét adta; A HPLC és az MS/MS, amelyek szűrőpapírból vett vérmintákat használtak, statisztikailag nem különböztek egymástól, és a Phe-koncentrációk következetesen körülbelül 12% -kal alacsonyabbak a HPLC-nél és 19% -kal alacsonyabbak az MS/MS-nél az AAA-hoz képest. Az e három módszerrel kapott vér Phe vérkoncentrációk eléggé különböznek ahhoz, hogy valódi klinikai hatást gyakorolhassanak, mivel az eltérő értékek valószínűleg a diéta vagy az anyagcsere-élelmiszerek markáns kiigazítását eredményezik a klinikus vagy az anyagcsere-dietetikus részéről, különösen magasabb Phe-koncentrációk esetén.

Ebben az elemzésben három módszert hasonlítottunk össze vérminták (plazma vagy szűrőpapír) felhasználásával, amelyeket előkészítettünk és elemeztünk, a laboratóriumaink Phe-koncentrációjának nyomon követése céljából; összehasonlítottuk a plazma és a teljes vér elemzését szűrőpapíron ugyanazon módszerrel. Továbbá a szűrőpapírból származó vérmintáinkat minden lakókocsiból vett vénás vérmintából, nem pedig ujjlenyomatból figyeltük meg; ezért ezek a minták nem teljesen reprezentatívak azokhoz, amelyeket rutinellenőrzés céljából küldnének nekünk. Úgy döntöttünk, hogy csak vénás mintákat használunk, hogy elkerüljük táborosaink felesleges stresszét a fennmaradó kalapácsok miatt, valamint hogy biztosítsuk a szűrőpapír teljes és következetes vérrel való telítettségét.

Elemzésünket megerősítette a PKU-ban szenvedő lányok és nők viszonylag nagy mintája, akiktől éhomi vérmintákat vettek, és két időpontban a phlebotomistákat közvetlenül szűrőpapíron képezték ki az Általános Klinikai Kutatóközpontban. Eredményeink hangsúlyozzák annak szükségességét, hogy a Phe-koncentrációk monitorozásában részt vevők ismerjék a kapott eredményekként alkalmazott módszertant. További kutatásokra van szükség a plazma Phe-koncentrációk és a teljes vér mennyiségi meghatározásának összehasonlítására szűrőpapíron ezen különböző módszerek alkalmazásával; A Phe monitorozására szolgáló analitikai módszerek különbségeinek jobb megértése elengedhetetlen a PKU-ban szenvedő betegekkel foglalkozó orvosok és metabolikus táplálkozási szakemberek iránymutatásainak kidolgozásához.