megvédi

  • absztrakt
  • A fő
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • Az állatok kezelése
  • CIH indukció
  • Leptin pótlás
  • Az alanin-aminotranszferáz mérése
  • szövettan
  • TUNNEL színezés
  • Olajvörös O festék
  • A plazma citokinek elemzése
  • RNS extrakció és reverz transzkripció
  • Valós idejű PCR
  • Immunblot elemzés
  • Az elektroforetikus mobilitás meghatározása
  • Statisztikai analízis
  • AZ EREDMÉNYEK
  • A ConA kezelés fokozza a zsír felhalmozódását a májban
  • Az SCD1 hiány megvédi az egereket a CIH-tól
  • Az SCD1 hiány elnyomja a gyulladásos molekulákat a CIH patogenezisében
  • Az SCD1 hiány elnyomja az NF-kB B és a STAT1 transzkripciós utakat
  • A leptinszint csökkenése közvetíti a CIH-rezisztenciát az SCD1-hiányos egerekben
  • VITA

absztrakt

Az immunitás és az anyagcsere szorosan összefügg. A máj fontos anyagcsere-szerv a szervezetben. A hepatociták és az immunrendszer közötti kölcsönhatásokat azonban még nem ismerjük. Azok az egerek, amelyeknél konkanavalin A (ConA) (CIH) által kiváltott hepatitis alakult ki, kiterjedt lipidfelhalmozódást találtak a hepatocitákban. A zsírszintézisben szerepet játszó kritikus enzimet, például a sztearoil-CoA deszaturáz 1-et (SCD1) szabályozták. Amikor ConA-t injektáltunk SCD1-hiányos egerekbe, azt tapasztaltuk, hogy ezek az egerek nagyon ellenállóak a CIH-val szemben. Az SCD1-hiány védőhatásának mechanizmusai azoknak az egereknek a csökkent leptinszinteknek tulajdoníthatók, amelyek kritikus citokineket és jelátviteli utakat moduláltak a CIH patogenezisében. Összefoglalva, tanulmányunk azt sugallja, hogy az SCD1 hiány megvédi az egereket a leptin-függő májkárosodástól.

A fő

A felhalmozott bizonyítékok arra utalnak, hogy az immun- és az energia-anyagcsere szorosan összefügg. Az éhezés és az alultápláltság elnyomhatja az immunválaszokat és növelheti a fertőzésekre való hajlamot, míg az elhízás rendellenes immunaktivitás állapotával és a gyulladásos megbetegedések fokozott kockázatával jár. 1 A máj a test legnagyobb és legfontosabb anyagcsere-szerve. Feldolgozza a tápanyagok fő kategóriáit, miután felszívódtak az emésztőrendszerből, és glikogént, zsírokat és vitaminokat tárol. Az elmúlt években egyre inkább felismerték a máj, mint fő immunszerv szerepét. 2

Az immunsejtek, beleértve a Kupffer-sejteket és a limfocitákat, a normál máj összes nem hepatocita sejtjének körülbelül 45% -át teszik ki. 3 Ezek a sejtek döntő szerepet játszanak az immunrendszer védekezésében a behatoló kórokozókkal szemben. A magas zsírtartalmú étrend által kiváltott máj steatosisban szenvedő egereknél a májban a természetes gyilkos T-sejtek (NKT-sejtek) aránya csökken, és hajlamosak a lipopoliszacharid (LPS) által kiváltott májkárosodásra. 4, 5 Ezenkívül azoknál a hepatosteatotikus egereknél, amelyeknél konkanavalin A (ConA) (CIH) által kiváltott hepatitis alakul ki, a T-sejtek differenciálódása jelentősen elmozdul a Th1 profil felé. Ezenkívül súlyos májkárosodást és magas gyulladásgátló citokinek, köztük a tumor nekrózisfaktor α (TNF-α) és interferon-γ (IFN-γ) magas termelését figyelték meg hepatosteatotikus egerekben. Metabolikus szindrómákat javasoltak tehát az immunmediált gyulladás és a májkárosodás rizikófaktoraként. Azt azonban, hogy a gyulladás hogyan befolyásolja a máj lipidanyagcseréjét, valamint az immunsejtek és a hepatociták közötti kölcsönhatásokat, még mindig kevéssé ismert.

Az egereken végzett CIH-vizsgálat során a lipidek kiterjedt felhalmozódását figyeltük meg a májsejtekben. A zsírszintézisben szerepet játszó kritikus enzimet, a sztearoil-CoA deszaturáz 1-et (SCD1) jelentősen szabályozták. SCD1-hiányos egerekben a CIH indukálására tett kísérlet során azt tapasztaltuk, hogy ezek az egerek nagyon ellenállóak a CIH-val szemben. Ezután az SCD1-hiányos egerekben tisztázták a CIH-rezisztenciához vezető mechanizmusokat. Eredményeink további közvetlen bizonyítékokkal szolgálnak arra vonatkozóan, hogy a hepatosteatosis jelentősen befolyásolja a máj immunválaszát. Ezért javasoljuk a zsíranyagcsere modulációjának további vizsgálatát, mint potenciális stratégiát a gyulladásos májbetegségek beavatkozására és kezelésére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Az állatok kezelése

8-10 hetes hím C57BL/6 egereket a Shanghai SLAC Laboratory Animal CO LTD-től (Shanghai, Kína) vásároltak. A spontán SCD1 diszfunkcióval rendelkező Ab Xyk egereket (Balb/c egerekhez keresztezve, F2 generáció) korábban leírtak. 7 Az egereket a Kínai Tudományos Akadémia Sanghaji Biológiai Tudományok Intézetének állattartó létesítményeiben kórokozóktól mentes körülmények között helyezték el, az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság irányelveinek megfelelően. Az egereket ad libitum-mal etettük az SLAC Laboratory Animal CO LTD.

CIH indukció

Az egereknek egyetlen vénát (15 mg/testtömeg-kg) injektáltunk ConA farokvénával, hogy létrehozzunk egy CIH-modellt.

Leptin pótlás

Az Ab Xyk/ab Xyk egerek 1 mg/kg rekombináns egérleptint (R&D Systems, MN, USA) vagy PBS-t kaptak intraperitoneális injekcióval, naponta kétszer, 5 napig. Ezt követően minden egérbe ConA-t injektáltunk.

Az alanin-aminotranszferáz mérése

A plazmát körülbelül 17 órával a ConA injekció után kaptuk. Az alanin-aminotranszferáz (ALT) szintjét egy ALT-detektáló készlettel (Shanghai Yihua Medical Science & Technology, Shanghai, Kína) határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően.

szövettan

A májat PBS-sel végzett perfúzió után eltávolítottuk, 4% foszfáttal pufferolt paraformaldehiddel rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. Szövetmetszeteket (5 μm) készítettünk, hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettünk és fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Összesen 10 szövetmetszetet elemeztünk minden állat esetében.

TUNNEL színezés

A DNS-fragmentációt elemeztük paraffinba ágyazott májszövetekben terminális deoxinukleotidil-transzferáz-közvetített dUTP-biotin-nikkel végjelölő reakció (TUNEL) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Ezután a metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Összesen 10 szövetmetszetet elemeztünk minden állat esetében.

Olajvörös O festék

A fagyasztott májszakaszokat (8 μm) Oil Red O-val (Sigma, MO, USA) 10 percig festettük, majd 45 másodpercig ellenfestettük hematoxilinnal. Ezután a metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Összesen 10 szövetmetszetet elemeztünk minden állat esetében.

A plazma citokinek elemzése

A TNF-α, IFN-γ és leptin plazmakoncentrációit specifikus enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készletekkel (R&D Systems) határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően.

RNS extrakció és reverz transzkripció

Az összes RNS-t izoláltuk a sejtpelletekből és a májszövetekből az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával. A genomi DNS-t a teljes RNS-ből eltávolítottuk a cDNS-szintézis előtt, RNáz-mentes DNáz-készlettel az DNR hasításához az RNS-tisztítás során (Qiagen). Az RNS-t -80 ° C-on tároltuk. Az első szál cDNS-szintézisét minden RNS-mintán elvégeztük Sensiscript RT Kit (Qiagen) alkalmazásával. Véletlenszerű hexamereket használtunk a cDNS-szintézis előállításához.

Valós idejű PCR

Indukálható nitrogén-oxid-szintáz (iNOS), interferon-indukált protein 10 (IP-10), monocita kemotaktikus protein-1 (MCP-1), makrofág gyulladásos fehérje-1a (MIP-1a), SCD1 és leptin mRNS gén expresszióját hajtottuk végre PCR-rel valós időben, SYBR Green master mix segítségével (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A hőciklusos körülmények között a kezdeti tartási periódus 50 ° C-on 2 percig, majd 95 ° C-on 10 percig tartott. Ezt egy kétlépéses PCR-program követte, amely 95 ° C-on 15 másodpercig és 60 ° C-on 60 másodpercig tartott 40 cikluson keresztül. Az adatokat összegyűjtöttük és kvantitatívan elemeztük egy ABI Prism 7900 szekvencia detektáló rendszerrel (Applied Biosystems). A Β-aktint használtuk endogén kontrollként, hogy normalizáljuk az egyes minták összes RNS-mennyiségének különbségeit. Az összes mennyiséget a p-aktin expresszióhoz viszonyított sokszorosában fejeztük ki. β-aktin:

Immunblot elemzés

Az immunblot-analízist teljes májsejt-kivonat-minták alkalmazásával, elektroforézissel elválasztva, 10% -os SDS-poliakrilamid gélen, PVDF-membránra visszük. A STAT1-et, a foszfo-STAT1-et (Thr-701), a STAT3-ot és a foszfo-STAT3-t (Tyr-705) a BD Bioscience (CA, USA) antitestje segítségével tettük láthatóvá.

Az elektroforetikus mobilitás meghatározása

A májszövetekből kivonatokat készítettünk a fent leírtak szerint. A 8 NF-κB kötő konszenzus egyszálú oligonukleotidot (5'-AGTTGAGGGGGACTTTCCCAGGC-3 ') először hibridizáltuk komplement oligonukleotiddal (5'-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3'). A megolvasztott DNS-fragmenst [y-32P] dATP-vel (Amersham, Piscataway, NJ, USA) jelöltük T4 polinukleotid kináz (Promega, Madison, WI, USA) felhasználásával. A nukleáris fehérjéket (15 μg) inkubáltuk 2,5 ng32P-vel jelölt kétszálú oligonukleotid próbákkal 30 percig szobahőmérsékleten. Az elegyet elektroforézissel szétválasztottuk 4% poliakrilamid gélen, 0,5x trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferrel 4 ° C-on.

Statisztikai analízis

Valamennyi eredményt átlag ± sd-ként fejeztük ki. A két csoport statisztikai összehasonlítását Student-féle t-teszttel végeztük a varianciaanalízis után. A szignifikancia szintet a = 0,05 értékre állítottuk, az összes teszt kétoldalas volt.

AZ EREDMÉNYEK

A ConA kezelés fokozza a zsír felhalmozódását a májban

A CIH az immun által közvetített májkárosodás széles körben alkalmazott állatmodellje, amelyet ConA egerek intravénás injekciójával indukálhatunk. Megállapítottuk, hogy a hepatocitákban a zsír felhalmozódását már 2 órával a ConA injekció beadása után megfigyelték, amint azt az olajvörös O festés mutatja (1a. Ábra). Eközben a zsírszintézisben szerepet játszó kritikus enzimet, az SCD1-t szabályozták (1b. Ábra). Azt is tapasztaltuk, hogy más kulcsfontosságú lipogén gének, köztük a zsírsavszintáz, az acetil-CoA karboxiláz 1 és az Elov16, hasonló expressziós mintázatot mutattak, mint az SCD1 (1b. Ábra). Így a CIH indukció kezdeti szakaszában a szövetkárosító immunválaszok kialakulásával összefüggésben fokozott zsírszintézis és felhalmozódás következett be.

Lipid felhalmozódás CIH-ban. A C57BL/6 egerek négy csoportja (n = 5) ConA injekciót (15 mg/kg) kapott a farokvénán keresztül. a ) A májszakaszok olajvörös színezését bemutató reprezentatív fotómikrográfok láthatók. A hepatociták zsírtartalmának növekedése (vörös) 2 - 24 órával a ConA injekció után a pihenéshez (0 óra) képest. ( b ) SCD1, FAS, ACC1 és Elov16 expressziója a máj mRNS-ben. Az eredményeket átlag ± sd-ként jelentjük. Az adatok öt kísérletre vonatkoznak.

Teljes méretű kép

Az SCD1 hiány megvédi az egereket a CIH-tól

Az SCD1 kulcsszerepet játszik a lipid anyagcserében. 9, 10 Az SCD1-hiányos egerek a koleszterin és a trigliceridek hibás szintézisét mutatják a májban, 11, 12, így csökkent májsteatózist mutatnak. Az Ab Xyk 7 egerek újonnan jellemzett aszbium egerek, az SCD1 génmutáció spontán diszfunkciójával. Ezeket az egereket használtuk CIH indukálására. Normál fenotípusú almaikat (Xyk egerek +/+ vagy +/ab, +/a-ként mutatva) kontrollként használtuk.

Négy órával a CIH indukció után szignifikánsan alacsonyabb hepatosteatózist figyeltek meg az ab Xyk/ab Xyk egerekben a +/a-val összehasonlítva. egerek (2a. ábra). A szérumot a ConA beadása után 17 órával gyűjtötték az ALT mérésére, hogy ellenőrizzék a májkárosodás súlyosságát. Megállapítottuk, hogy a szérum ALT drámaian megnőtt a CIH indukciója után a +/-? egerek (9183 ± 1629, U/L), ami súlyos májkárosodást jelez ezeknél az egereknél. Azonban ab Xyk/ab Xyk egereknél a ConA-indukálta szérum ALT növekedés szignifikánsan blokkolt (88 ± 50, U/L; P néhány ab Xyk/ab Xyk egérben csak néhány gyulladásos vagy nekrotikus elváltozást figyeltek meg) (2c. Ábra) Az SCD1-hiányos egerek nagyon ellenállóak voltak a CIH-val szemben.

Az SCD1-hiányos egerek rezisztensek a ConA által kiváltott hepatitisre. Az SCD1-hiányos egerek (ab Xyk/ab Xyk) és az alom kontroll egerei (+/a) (n = 5) ConA injekciót (15 mg/kg) kaptak a farokvénán keresztül. A máj részeinek olajvörös O festése 4 órával a ConA injekció után ( a ). Tizenhét órával a ConA injekció után plazmát nyertek és megmérték az ALT-szintet ( b ). Ugyanakkor a májat eltávolítottuk és 4% paraformaldehidben rögzítettük. H&E májfestést végeztünk ( c ) és a TUNEL ( d ) és az eredményeket fénymikroszkóppal vizsgáltuk (nagyítás × 200). Az eredményeket átlag ± sd-ként jelentjük. Az adatok öt kísérletre vonatkoznak. ** P Xyk/ab Xyk nagyon gyengült (3a. És b. Ábra). Több fő gyulladásos mediátor, köztük az iNOS, IP-10, MCP-1, MIP-1α expresszióját is vizsgálták, amelyekről azt mondják, hogy fontosak a CIH patogenezisében. Mindezen gyulladásos mediátorok expresszióját szignifikánsan alacsonyabbnak találtuk ab Xyk/ab Xyk egerekben, mint +/a esetén. egerek CIH indukció után (3c-f ábra).

A lipidfelhalmozódással együtt megnövekedett SCD1 expressziót találtunk a CIH egerek májában. Az SCD1 egy központi lipogén enzim, amely hosszú láncú telített zsírsavakat egyszeresen telítetlen zsírsavakká (MUFA) alakít át. Ezután megkérdeztük, hogy a CIH hogyan fog megnyilvánulni az SCD1-hiányos egerekben. Ahogy az várható volt, az SCD1-hiányos egerek nagyon ellenállóak voltak a CIH-val szemben, amint azt a szérum ALT-mérés és a máj szövettani vizsgálata is megmutatta. Bár egy nemrégiben közzétett jelentés kimutatta, hogy az SCD1-hiányos egerek fokozott súlyosságot mutattak a nátrium-dextrán-szulfát által kiváltott akut vastagbélgyulladás modelljében. Az SCD1-hiány hatása az immun által közvetített májkárosodásra nem volt ismert. Eredményeink arra utalnak, hogy az SCD1, a zsíranyagcserében részt vevő kulcsfontosságú enzim részt vesz az immun által közvetített májkárosodásban. Ezután folytattuk az alapvető mechanizmus feltárását.

Kíváncsiak vagyunk arra, hogy az SCD1, a MUFA bioszintézisének enzime, hogyan befolyásolhatja a gyulladást. Megjegyeztük Ntambi és munkatársai jelentését, miszerint a leptin termelését elnyomták az SCD1-hiányos egerek étrendjein és magas zsírtartalmú étrendeken. A leptinről ismert, hogy kritikus kapcsolat az energia-anyagcsere és az immunitás között. A leptin számos immunutat érint közvetlen vagy közvetett módon. A CIH legfontosabb patogén immunsejtjei, mint például a T-sejtek és az NKT-sejtek, aktiválhatók a leptinnel. A leptin emellett elősegíti a gyulladásgátló citokinek, például a TNF-a és az IFN-y termelését, amelyek döntő fontosságúak a CIH patogenezisében. 13, 38 Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a CIH iránti érzékenység növelhető a leptinnel a máj NKT-sejtjeinek magas számának fenntartásával, valamint a T-sejt aktiváció és a citokin termelés közvetítésével. Az elhízás és a metabolikus szindróma tehát a májat fokozhatja az immun által közvetített károsodás kockázatának egy leptin-függő mechanizmus révén. A leptinhiány csökkenti a CIH modell súlyosságát. Itt SCD1-hiányos egerekben megfigyeltük a csökkent szérum leptinszintet és a leptin mRNS expresszióját a zsírszövetben. A szubsztitúciós kísérlet azt is megerősítette, hogy a leptinszint csökkenése jelentősen hozzájárult az SCD1 hiány protektív szerepéhez a CIH indukciójában.

A zsír oxidációját serkentő lipid-anyagcsere számos ismert szabályozójának, köztük a metforminnak és az omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavaknak, hepatoprotektív aktivitással rendelkeznek immunimmunált májkárosodás ellen. 40, 41 Ebben a tanulmányban egyértelműen kimutattuk, hogy az SCD1, a lipid anyagcsere kulcsszabályozójának inaktiválása megvédi az egereket a CIH-tól. Hasonló védőhatásokat figyeltünk meg az egerek metformin AMPK aktivátorral történő előkezelése után (publikálatlan adataink). Eredményeink közvetlen bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy az energia-anyagcsere szabályozása megváltoztathatja a máj immunválaszát. Ez új megközelítést javasol az energia-anyagcsere és a máj immunrendszere közötti áthallás megértésének és esetleges ellenőrzésének. Egy ilyen megközelítés elősegítheti és javíthatja a májbetegségek kezelését a jövőben.