absztrakt

A fő

Számos erős aromatáz-gátlót vezettek be a hormonfüggő melldaganatokban szenvedő, posztmenopauzás nőknél történő alkalmazásra (Miller, 1999). Míg fejlődésük jelentős előrelépést jelent az emlőrákban szenvedő nők kezelésére rendelkezésre álló terápiákban, a másodlagos kezelésként alkalmazott teljes és részleges válaszarány viszonylag alacsony (10–20%) marad a daganat progressziójáig. viszonylag rövid (3-6 hónap) (Santen és Harvey, 1999). Egy nemrégiben végzett vizsgálat során azonban az aromatáz gátló adjuváns alkalmazásával a tamoxifen ellen, önmagában vagy kombinációban, a betegségektől mentes túlélés szignifikánsan hosszabb volt az aromatáz gátló terápiában részesülő egyéneknél (ATAC Trialist Group, 2002). Ezenkívül számos káros mellékhatás, beleértve a gyomor-bélrendszeri problémákat, a szédülést és az émelygést, egyes inhibitorok alkalmazásával jár (Buzdar és mtsai, 1997). Az aromatázinhibitorok alkalmazása posztmenopauzás emlőrákos nőknél szintén káros hatással volt a szérum lipidprofiljára (Elisaf és mtsai, 2001). Ezért új módszereket kell kifejleszteni az aromatáz aktivitás gátlására, amelyek specifikusan működhetnek a mellben, de más ösztrogénérzékeny szöveteket helyettesítenek.

A normális vagy rosszindulatú emlőszövetekből származó fibroblasztokat használták modellként az aromatáz aktivitás vizsgálatára, mivel ezeknek a sejteknek sokkal magasabb az aktivitási szintje, mint az epitheliális sejteknek (Singh és mtsai, 1999). Az ilyen fibroblasztok felhasználásával számos citokint azonosítottak, köztük az interleukin 6-ot (IL-6) és a tumor nekrózis faktorát (TNFα), mint a fibroblaszt aromatáz aktivitásának fontos szabályozóit (Reed et al., 1992; Macdiarmid et al., 1994). Idős és elhízott egyéneknél fokozódik a perifériás aromatáz aktivitás (Grodin és mtsai, 1973; Hemsell és mtsai, 1974), és az IL-6 termelés is megnövekszik ilyen körülmények között (Wei és mtsai, 1992; Mohamed-Ali és mtsai., 1997),

Az IL-6 azon képességét, hogy stimulálja az aromatáz aktivitást a tenyésztett fibroblasztokban, jelentősen (akár 21-szeresére) erősíti oldható receptora, az IL-6sR (Singh és mtsai., 1995; Zhao és mtsai., 1995a, 1995b). Az IL-6-ot normál és rosszindulatú mellszövetekből származó fibroblasztok termelik, míg az IL-6sR-t csak rosszindulatú fibroblasztokból nyert kondicionált közegben mutatták ki (Singh és mtsai, 1995). Számos emlődaganatba a makrofágok és a limfociták beszűrődnek, és bizonyítékok vannak arra, hogy ezek a sejtek olyan tényezők fő forrása lehetnek, amelyek képesek stimulálni az aromatáz aktivitását a mellben (Purohit et al., 1995; Reed és Purohit, 1997).

A többi citokinhez hasonlóan az IL-6 is úgy hat, hogy a membránt átfogó receptorhoz kötődik. Az IL-6R komplex egy ligandumkötő alegységből áll, amelynek molekulatömege 80 kDa (gp80) és 130 kDa (gp130) szignál transzdukciós fehérje (Taga et al., 1989; Kishimoto et al., 1995). A gp80 alegység, amely oldható formában is létezhet (Rose-John és Heinrich, 1994), alacsony affinitással kötődik az IL-6-hoz, és a nagyobb affinitású kötéshez és szignáltranszdukcióhoz nagyobb gp130-mal kell társulnia. Míg az IL-6 monoklonális antitesteket (Mabs) alkalmazták az IL-6 hatásainak megszüntetésére, ezek csak részben hatékonyak (Klein és mtsai, 1991). A mabok komplexet alkotnak az IL-6-mal, ami csökkent citokin-clearance-hez vezet.

Az IL-6 hatásának blokkolásának alternatív módjaként Ciliberto és munkatársai számos IL-6 receptor antagonistát fejlesztettek ki, amelyek az IL-6 mutált formái olyanok, amelyek képesek kötődni az IL-6R-hez, de inaktív konfigurációban blokkolják ( Demartis és mtsai., 1996). Ez gátolja annak képességét, hogy kölcsönhatásba lépjen a gp130 szignál transzdukciós fehérjével. A Sant 7 IL-6 variánsát azonosították a legerősebb szuperantagonistaként, és képes volt gátolni számos különböző típusú rosszindulatú sejt IL-6 által stimulált növekedését. Mivel az IL-6 + IL-6sR fontos szerepet játszik az aromatáz aktivitás szabályozásában, a Sant7 képességét a citokin-stimulált aromatáz aktivitás blokkolására vizsgálták. A Sant 7-et további információk megszerzésére is alkalmazták arról a folyamatról, amelynek során a PGE2 szabályozza az aromatáz aktivitást az emlőszövetből származó fibroblasztokban.

Anyagok és metódusok

Fibroblaszt tenyészet

Emlő zsírszövet mintákat vettek olyan nőktől, akik redukciós mammoplasztikán estek át. Ezenkívül lumpectomián vagy mastectomián átesett nőkből mintát vettek az emlődaganatok (azaz a "nem részt vevő" szövetek) és az emlődaganatok közelében lévő zsírszövetre.

A reszkált szöveteket szikékkel őröltük és Eagles-féle módosított minimális esszenciális táptalajban (EMEM) inkubáltuk 18-24 órán át 37 ° C-on, kollagenázzal (200 μg ml-1). A diszpergált sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és kétszer mostuk kollagenáz eltávolító közeggel. A diszpergált sejteket 25 cm2 -es tenyészlombikba oltottuk, és hagytuk őket tapadni. A sejteket összefolyásig növesztettük EMEM-ben, amely HEPES puffert (20 mmol-1), 10% borjúmagzati szérumot (FCS) és kiegészítőket tartalmazott (Reed et al., 1992). A sejteket rutinszerűen kétszer-háromszor passzáltuk, majd 25 cm2 -es tenyésztőlombikkal beoltottuk és 70-80% -os összefolyásig növesztettük. A táptalajt 2% -os c-vel helyettesítettük. Ebben a táptalajban dexametazont (100 nM) adtunk hozzá dexametazon (100 nM) jelenlétében 48 órán át, és tartalmazta: IL-6 + IL-6sR (50 és 100 ng ml-1, kutatás és fejlesztés). Systems Ltd, Abingdon, Oxon, Egyesült Királyság) és PGE2 (10 μM, Sigma, Poole, Dorset, Egyesült Királyság).

Sant 7

Az IL-6R Sant 7 szuperantagonistát a Sigma-Tau-tól (Róma, Olaszország) szereztük be, és a fent leírtak szerint szintetizáltuk (Salvati et al., 1995). A Sant 7-et feloldottuk a táptalajban, mielőtt a sejtekhez adtuk.

Aromatáz teszt

Az aromatáz aktivitást intakt fibroblaszt egyrétegekben mértük (1β - 3H) androszténdion (15-30 Ci mmol - 1, NEN - Du Pont, Stevenage, Herts, Egyesült Királyság) alkalmazásával 3 - 20 órán át (Reed et al., 1992). Röviden: a fibroblaszt egyrétegeket egyszer Earle kiegyensúlyozott sóoldatával (2,5 ml) mostuk, hacsak másképp nem jelezzük. Minden lombikba 3H androsztendionot (0,25 μCi) adunk, hogy a végső szubsztrátkoncentráció 3-4 nM legyen. A fibroblaszt egyrétegeket szubsztráttal 3-20 órán át inkubáltuk 37 ° C-on, a sejtekben lévő bazális aromatáz aktivitástól függően. Sejt nélküli lombikokat szintén szubsztráttal és szérummentes táptalajjal inkubáltunk. Inkubálás után a tápközeg egy alikvot részét (2 ml) eltávolítottuk az egyes lombikokból, és az alikvot részeket kétszer extraháltuk 5 ml dietil-éterrel, amelyet eldobtunk. A visszamaradó vizes fázist azonos térfogatú aktív szenet (5,0%) és dextránt (0,5%) tartalmazó oldattal kezeltük, centrifugáltuk, és a felülúszó (1 ml) alikvot részét vettük radioaktív tartalmának folyadék szcintillációs spektrometriás meghatározására. A mai napig a fibroblasztokban mért aromatáz aktivitás lineárisnak bizonyult a 24 óráig terjedő idő tekintetében (Macdiarmid et al., 1994).

statisztika

A kezelt és a kontroll sejtekben az aromatáz aktivitás különbségeinek jelentőségét Student t-tesztjével értékeltük. Reprezentatív példákat adunk olyan kísérletekre, amelyeket 2-3 alkalommal ismételtek meg.

az eredmény

A Sant7 citokin-stimulált aromatáz-aktivitás gátló képességét kezdetben a redukciós mammoplasztikán átesett alany mellének zsírszövetéből származó fibroblasztokban vizsgálták (1. ábra). Ezekben a fibroblasztokban az IL-6 önmagában (50 ng ml-1 koncentrációban) 27% -kal növelte az aromatáz aktivitást. Az IL-6sR hozzáadása az IL-6-mal kombinálva azonban jelentősen javította az aromatáz aktivitást stimuláló képességét (7,7-szeres a kontrollokhoz képest). A Sant 7 okozta jelentősen (P 1 (3. ábra).

il-6

Az IL-6, Sant7 receptor szuperantagonista hatása az IL-6, IL-6sR vagy IL-6 + IL-6sR által stimulált aromatáz aktivitásra a mammoplasztikus zsírszövet redukciójából származó fibroblasztokban. A fibroblasztokat 2% -os lecsupaszított FCS-ben tenyésztettük, fenolpiros nélküli EMEM-ben, és ebben a táptalajban 48 órán keresztül hozzáadtuk dexametazon (100 nM) jelenlétében. Az aromatáz aktivitást intakt fibroblaszt egyrétegekben mértük, szubsztrátként [3H-ip] androszténdiont használva. A kezelt és kontroll sejtek közötti különbségek szignifikanciáját Student t-tesztjével értékeltük (a, P

( A ) A Sant7 hatása az IL-6, IL-6sR vagy IL-6 + IL-6sR által stimulált aromatáz aktivitásra a melldaganat proximális szövetéből származó fibroblasztokban. A fibroblasztokat 2% -os lecsupaszított FCS-ben tenyésztettük, fenolpiros nélküli EMEM-ben, és ebben a táptalajban 48 órán át hozzáadtuk dexametazon (100 nM) jelenlétében. Az aromatáz aktivitást intakt egyrétegekben mértük, szubsztrátként [3H-1β] androszténdiont használva. Az egyik sejtkészletet (előkezelés) 3 órán át előinkubáltuk a Sant 7-gyel az IL-6 + IL-6sR hozzáadása előtt, míg a másik készlethez (előkezelés nélkül) a Sant 7-et az IL-6 + IL-vel egyidejűleg adtuk. -6. 6sR (a, P

Dózisreakció a Sant7 IL-6 + IL-6sR-stimulált aromatáz-gátló képességére a fibroblasztokban, amelyek a proximális emlődaganatból származnak. A Sant 7 60 ng ml-1 IC50-vel gátolta a stimulált aromatáz aktivitást (vagyis három olyan mérést, amelyben a variációs együtthatók

A Sant7 azon képessége, hogy gátolja az aromatáz aktivitás IL-6 + IL-6 sR stimulációját mammoplasztikus redukáló szövetből származó fibroblasztokban. A sejteket 48 órán át IL-6-tal (50 ng ml-1), IL-6sR-vel (100 ng ml-1) vagy Sant7-vel (10 ug ml-1) kezeltük, vagy az ábrán bemutatott kombinációkban, dexametazon hiányában vagy jelenlétében. (Dex, 100 nM). A kontroll sejtekben az aromatáz aktivitás 1370 ± 15 fmol 20 h-1 106 sejt -1 és 639 ± 35 fmol 20 h – 106 sejt -1 volt a dexametazon hiányában vagy jelenlétében tenyésztett fibroblasztok esetében (átlag ± sd, n = 3) a, P

( A ) A Sant 7 hatása a PGE2-stimulált aromatázra a proximális fibroblasztokban. Az IL-6 (50 ng ml-1) + IL-6sR (100 ng ml-1) nagyobb mértékben stimulálta az aromatáz aktivitást, mint a PGE2 (10 μM). A Sant7, amely blokkolja az IL-6 + IL-6sR által stimulált aromatáz aktivitást, jelentősen csökkentette a PEG2 azon képességét, hogy stimulálja az aromatáz aktivitást ezekben a fibroblasztokban. Annak megállapítására, hogy a Sant 7 hatásai reverzibilisek-e (Rev), a fibroblasztok egy sorozatát (IL-6 + IL-6sR (Rev)) 12 órán át előinkubáltuk a Sant 7-gyel, majd a sejteket foszfáttal mostuk. . - pufferolt sóoldat. Az IL-6 + IL-6sR stimulálta az aromatáz aktivitást ezekben a sejtekben, miután hasonló tartományban fibroblasztokat mosott, amelyek nem voltak kitéve a Sant 7-nek, jelezve, hogy a Sant 7 nem működik visszafordíthatatlanul. (a, P