elemeket

absztrakt

Jellemző, hogy a prosztatarák (PCa) sejtekben az intracelluláris cink jelentős csökkenést mutat; A felelős mechanizmust azonban nem értjük egyértelműen. A HOXB13 részt vesz a PCa progressziójában, és a kasztrálásnak ellenálló PCa-ban túlexpresszálódik. Az LNCaP Pca sejtmikroszkóppák DNS-elemzése azt mutatta, hogy a ZnT cinkkibocsátó transzporterek szembetűnően felülszabályozódtak az androgéntől független HOXB13 célgének között. Ezenkívül az exogén HOXB13 az intracelluláris cink koncentrációjának csökkenését okozta a PCa sejtekben, stimulálta az NF-KB által közvetített jelátvitelt az NF-KB alfa-gátló (IκBα) redukciójával és javította a RelA/p65 nukleáris transzlokációt. Az emberi prosztata daganatok szintén erős inverz korrelációt mutattak a HOXB13 és az IκBa fehérje expresszió között. Következésképpen a HOXB13 stimulálta a PCa sejtek invázióját, amelyet a ZnT4 szuppresszió gátolt. Ezenkívül a PCa metasztázisok PC3 ortotóp egér modelljén végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a HOXB13 erős metasztatikus stimulátor. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HOXB13 elősegíti a PCa invázióját és metasztázisát az intracelluláris cinkszint csökkentésével, ezáltal stimulálva az NF-κB jeleket, és arra utal, hogy a HOXB13 az intracelluláris cinkszint modulátoraként működik, amely elősegíti a PCa rosszindulatú tulajdonságait.

Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a HOXB13 szerepét az NF-κB jelátvitel cink által közvetített szabályozásában, hogy jobban megértsük a HOXB13 szerepét a PCa CRPC-re való progressziójában. A normális emberi prosztata magasabb cinkszintet halmoz fel, mint bármely más lágy szövet, ezért a cinket az egészséges prosztata nélkülözhetetlen alkotóelemének tekintik. A cink szintje azonban nagymértékben csökken a prosztata hámdaganataiban, és az androgéntől független növekedés felé történő progresszió során tovább csökken. Ebben a tanulmányban komplementer DNS mikroarray elemzést végeztünk androgénhiányos körülmények között tenyésztett LNCaP sejtekben a HOXB13-at megcélzó androgéntől független gének profilozása céljából. Ezen célgének egyikét, a ZnT4 cink kimeneti hordozót részletesen elemeztük, hogy azonosítsuk a HOXB13 és a biomolekulák cink által közvetített kaszkádjai közötti összefüggéseket. Ezt a vizsgálatot annak megállapítására végezték, hogy a prosztata sejtek hogyan alkalmazkodnak a túléléshez a tumorgenezissel és a CRPC sejtekhez való progresszióval.

az eredmény

A ZnT4 (cink kimeneti transzporter) a HOXB13 célpontja

hoxb13

A ZnT4, egy cink kimeneti transzporter, a HOXB13 célpontja. ( a ) Az LNCaP sejtekben differenciáltan expresszált gének hierarchikus klaszteranalízise hormonhiányos körülmények között. A HOXB13 célgének vizsgálatához a DNS mikroarray elemzését olyan fiziológiai állapotban végeztük, amelyben a HOXB13 (B1-B3) minimálisan túlexpresszálódott az LNCaP-ban a kontrollokhoz (G1G3) képest. Ez a kép piros és zöld színben mutatja a szabályozatlan és szabályozatlan átiratokat. A HOXB13-szabályozott gének relatív expressziós szintjének ezen áttekintése azokat a célgéneket mutatja, amelyek expressziója legalább kétszer megváltoztatta a kontroll átlagos bőségét. ( b ) Cink transzporter mRNS expressziója LNCaP sejtekben (felső panel). A HOXB13 expresszióját adenovírus szabályozta. A megjelenített génexpresszió három független valós idejű RT-PCR elemzés eszköze és átlag ± sd (alsó panel) formájában jelenik meg. ( c ) A ZnT4 fehérje expressziója Western blot alkalmazásával. A HEK293 sejteket homoaminnal transzfektáltuk a pFLAG-HOXB13, pFLAG vagy pFLAG-HOXB13 törzsből.

Teljes méretű kép

A HOXB13 csökkentette az intracelluláris cink szintjét és stimulálta az NF-κB jelátvitelt a PCa sejtekben

A HOXB13 csökkenti az intracelluláris cink szintjét és stimulálja az NF-κB jelátvitelt a PCa sejtekben. Az LNCaP-S4 sejteket androgénhiányos körülmények között növesztettük 3 napig, és így kényszerítettük őket a HOXB13 expressziójára. Az LNCaP-shHOXB13 HOXB13 által elnyomott sejtek. A PC3 sejteket Flag-HOXB13-mal transzfektáltuk. LNCaP-S4 sejtek ( a ) vagy Tet-on kontroll sejtek ( b ) Dox-tal kezeltük a HOXB13 indukálására. HOXB13-elnyomott sejteket (1-3, 4-1) is alkalmaztunk, és összehasonlítottuk a kevert sejtekkel ( c ). A sejteket intracelluláris cinktartalomra elemeztük. A PC3 sejtek tenyésztése után ( d ) vagy LNCaP-S4 sejtek ( e ) TNF-α-t adtunk hozzá 24 óra alatt az NF-κB aktivitás stimulálása érdekében. LNCaP-S4 sejtek ( f ) vagy az shHOXB13-LNCaP ( g ) cinkkel és/vagy piritionnal 30 percig előinkubáltuk, majd 2 órán át TNF-a-val inkubáltuk. A sejteket luciferáz vizsgálatokkal értékeltük. A diagram *** szignifikáns különbségeket mutat a két csoport között, amelyet egy kétfarkú Student t-tesztje határoz meg (P

Az NF-κB HOXB13 általi aktiválását az IκB közvetíti. ( a ) A HOXB13 expressziót LNCaP-S4 sejtekben indukáltuk Dox-tal, a megfelelő lizátumokat összegyűjtöttük és Western blot-ot kaptunk (bal oldali panel, teljes lizátumok; jobb oldali panel, nukleáris kivonatok). ( b ) A HOXB13-mal elnyomott sejteket (1-3 és 4-1) és a kevert kontroll sejteket megvizsgáltuk a pNF-KB fehérje expresszió szempontjából (bal oldali panel, teljes lizátum, jobb oldali panel, nukleáris kivonatok).

Teljes méretű kép

A HOXB13 expresszió közvetve korrelált az IκBα expresszióval a prosztatarákban

Mivel a HOXB13 szabályozta az NF-κB aktivitást az IκBα aktivitás csökkentésével a PCa-sejtekben, a HOXB13 és IκBα szöveti expresszióját értékeltük 9 CRPC-ben és 12 androgén-függő PCázban (ADPC). Mivel azonban a PCa heterogén volt, csak az androgénreceptorra (AR) pozitív hatást gyakorló PCa-sejteket értékeltük. Az 5A. Ábra mutatja a HOXB13 és az IKBα expresszióját, és hogy a HOXB13 túlexpresszáló daganatok nem expresszálták az IκBα (a-d) -t. Különösen a CRPC-k esetében volt ez így, mivel csak a HOXB13-t túlzottan expresszáló CRPC-k nem expresszálták IκBα-t. Számos HOXB13-t túlzott mértékben expresszáló ADPC expresszálta az IκBα-t (e-h), míg egyes tumorsejtek és jóindulatú prosztata-hiperpláziából származó sejtek alacsony HOXB13-expressziót és magas IκBα-t (i-1) mutattak. Amikor a magas és alacsony feltételeket önkényesen 2-3 vagy 0-1 pontszámmal látták el, a HOXB13 és IκBα tagok fordítottan korreláltak (χ 2 = 4, 888, P

A HOXB13 expresszió közvetetten korrelál az IκBα-val a prosztatarákban. ( A ) Az immunfestést különböző prosztata szövetekben soros metszetek alkalmazásával végeztük. AR-t használtunk belső kontrollként. A skála 100 μm. A betéteket 40-szeres nagyításként jelenítettük meg. ( B ) Oszlopdiagram, amely a HOXB13-túlexpresszált és expresszált PC-k HOXB13-pontszámát mutatja. Értékelték a tumorokban a HOXB13 és IκBa expressziót (0, hiányzott, 1, gyenge, 2, mérsékelt és 3 erős). A csillagok P-t jelölnek

A HOXB13 növeli a PCa-sejtek invazív potenciálját. ( a ) A sejtinváziót matrigel transzwell segítségével mértük. A HOXB13-szuppresszált sejteket (1-3 és 4-1) és a kevert sejteket 2 napon át androgénhiányos körülmények között növesztettük. Az alsó kamrákba fibronektint tartalmazó táptalajt adtak. 24 óra elteltével a sejteket festettük, és képeket rögzítettünk. ( b ) A sejteket véletlenszerűen kiválasztott öt mezőben számoltuk meg, 200-szoros nagyítással; az eredményeket oszlopdiagramként mutatjuk be. ( c A Dox által indukált HOXB13 S4 sejteket szélesztettük, majd si-ZnT4-gyel (50 nM) vagy si-kontrolltal transzfektáltuk, és a transzfektált sejteket a fent leírtak szerint alkalmaztuk inváziós vizsgálatokhoz. A teszteket három példányban hajtottuk végre; az oszlopok az átlagot ± sd ( d ) shHOXB13-LNCaP sejteket androgénhiányos körülmények között növesztettünk 2 napig. Ezután a sejteket kivontuk, és a lizátumokat Western-blottolással értékeltük. ( e ) Az LNCaP-shHOXB13 sejtek (bal oldali panel) vagy az LNCaP-S4 (jobb oldali panel) kondicionált táptalaját zselatin-szimográfiás vizsgálatnak vetettük alá. Az MMP-9 és az MMP-2 formái láthatók.

Teljes méretű kép

A HOXB13 stimulálta a PCa sejt nyirokcsomó áttéteket

A PC3-HOXB13 tumorok metasztázisai para-aorta nyirokcsomókba. ( A ) A stabilan transzfektált PC3 sejteket immunblotoltuk a FLAG számára. ( B ) A paraorta nyirokcsomókat felosztották az áttétek kimutatására, és megszámolták az áttétek számát. Az áttétek gyakorisága az egér nyirokcsomóiban 75,0% volt (nyolc daganatos egérből hat) a PC3-HOXB13 csoportban és 14,3% (a hét daganatos egér egyike) a PC3-modell csoportban. ( C ) A kiválasztott lokális (a - c) és metasztatikus (d - f) PC3-HOXB13 tumorokat mutatjuk be. Az „a” és „d” mezők kibővülnek „b” és „e” betűkkel. A „b” és „e” szekciókat immunjelöltük a FLAG (c, f) számára.

Teljes méretű kép

vita

Eredményeink arra utalnak, hogy a HOXB13 végső soron stimulálja a PCa-sejtek invazív tulajdonságait azáltal, hogy csökkenti az intracelluláris cinkszintet, különösen androgénhiányos körülmények között. Javaslunk egy hipotetikus modellt a HOXB13 hatásmechanizmusára a PCa invázió során (8. ábra): (1) A HOXB13 uregegulálja a cink kiáramló csatornákat, beleértve a ZnT4-et is, androgénhiányos körülmények között. (2) A ZnT4 megkönnyíti a cink kiáramlását a sejtekből. (3) Az intracelluláris cink csökkent szintje stimulálja az IKKα expresszióját, amely tovább foszforilálja és lebontja az IκBα-t. (4) A felszabadult stimuláló NF-κB, például a p65 és a p50, transzlokálódik a sejtmagba, és aktiválja a tumorsejtek inváziójában és metasztázisában részt vevő gének expresszióját.

A HOXB13 által közvetített PCa invázió hipotetikus modellje. Amikor a HOXB13 túlzottan expresszálódik abláció-rezisztens prosztatarákban, azt javasoljuk, hogy a HOXB13 a következőképpen működjön a rákos sejtek inváziójának elősegítésében: (1) A HOXB13 androgénhiányos körülmények között szabályozza a cink kiáramló csatornákat, beleértve a Znt4-et is. (2) A ZnT4 elősegíti az intracelluláris cink kiáramlását. (3) A csökkent intracelluláris cinkszint stimulálja az IKKα expresszióját, amely foszforilálja és lebontja az IκBα-t. (4) A felszabadult stimuláló NF-κB, beleértve a p65-et és a p50-t is, transzlokálódik a sejtmagba, és aktiválja a tumorsejtek inváziójában részt vevő gének expresszióját.