sejtek

  • elemeket
  • absztrakt
  • BEVEZETÉS
  • AZ EREDMÉNYEK
  • A PTPN2 T-sejt-specifikus vesztesége súlyosbítja a bélgyulladást
  • A PTPN2 elvesztése megváltozott jelátalakítókhoz és transzkripciós (STAT) foszforiláció és T-sejt transzkripciós faktor expresszió aktivátoraihoz vezet.
  • A Th1 és Th17 sejtek emelkedett szintje a vastagbélben, az MLN és a PTPN2-hiányos egerek lépében
  • A PTPN2 elvesztése a T-sejtekben a T-limfociták beszivárgásához vezet a bélen kívüli szervekbe és autoimmun reakciókhoz vezet.
  • A PTPN2 elvesztése bél dysbiosist idéz elő
  • A PTPN2 CD-asszociált változatának jelenléte fokozott Th1 és Th17 gén expressziót eredményez IBD betegek bélbiopsziáiban.
  • VITA
  • mód
  • Egerek és vastagbélgyulladás indukciója
  • A vastagbélgyulladás súlyosságának és szövettani pontszámának értékelése
  • In vitro Th-sejt differenciálódás
  • Mikrobiota elemzés
  • Betegminták
  • Statisztikai analízis
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További képek
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő ábrák és módszerek

elemeket

  • Crohn-betegség
  • dysbiosis
  • Nyálkahártya immunológia
  • T-sejtek

absztrakt

A segítő T-sejtek (Th) effektor T-sejtpopulációkba történő differenciálódásának szabályozása elengedhetetlen az önantigének, valamint az ártalmatlan nem önantigének toleranciájának fenntartásához, mint például a bélben és a bélben lévő élelmiszer-részecskékből vagy kommenzális baktériumokból származó bőr, 1, 2 A Crohn-kórban (CD) a krónikus bélgyulladás egyik formáját, a klasszikus Th1-citokin IFN-γ, valamint az IL-17A/F és IL-22 Th17-citokinek emelkedett szintjét írták le. a bélben. biopszia és szérum, 3, 4, 5, 6, ami a Th-sejtek egyenetlen proliferációját sugallja a betegség kezelésének mechanizmusaként. Specifikus citokinek szekréciójával a Th-sejtek megszervezik az immunválaszt (pl. Az IgM-ből az IgG/IgA/7-be történő átmenet a bél B-sejtjeiben vagy az antimikrobiális peptidek fokozott szekréciója a bél hámsejtjeiből) a kommenzális és patogén baktériumok felé, ezáltal befolyásolva bélflóra. A mikrobiotikus összetétel változásai összefüggenek a bélbetegséggel. 8.

AZ EREDMÉNYEK

A PTPN2 T-sejt-specifikus vesztesége súlyosbítja a bélgyulladást

A PTPN2 elvesztése megváltozott jelátalakítókhoz és transzkripciós (STAT) foszforiláció és T-sejt transzkripciós faktor expresszió aktivátoraihoz vezet.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A Th1 és Th17 sejtek szintjének emelkedése a vastagbélben, az MLN és a PTPN2-hiányos egerek lépében

A megnövekedett limfoid sejt infiltráció és fokozott vastagbélgyulladás, valamint a fokozott STAT1/STAT3 aktiváció vezetett minket a megoldáshoz, ha a T-sejtekben a PTPN2 elvesztése megváltozott Th-sejt differenciálódáshoz vezet. Nem találtunk különbséget a CD8 + vs. CD4 + T-sejtek PTPN2 fl/fl és PTPN2 fl/fl xCD4Cre egerek között (az adatok nem láthatók).

Naiv CD4 + T sejtek RAG -/- egerekbe történő injektálása az IFN-γ +, valamint az IL-17 + sejtek robusztus indukcióját eredményezte a CD4 + T sejtek bélcsoportjában. Míg az IFN-γ + sejtek indukciója enyhe volt, és az IL-17 + sejtek indukciója alacsony volt PTPN2-kompetens T-sejteket kapó egereknél, a naiv PTPN2-hiányos T-sejtek injekciója masszív IFN-γ + -szintet és IFN-indukciót eredményezett . -y/IL-17 kettős pozitív CD4 + T sejtek (3a. ábra). Ezzel szemben a FoxP3 +/CD25 erősen szabályozó T-sejteket (Treg) erősen indukálták azokban az egerekben, amelyek PTPN2-kompetens T-sejteket kaptak, de csak kis mértékben azokban az egerekben, amelyek PTPN2-hiányos T-sejteket kaptak (3b. Ábra).

A Th-sejtek fejlődésében megfigyelt változások nem korlátozódnak a vastagbélrétegre, mivel hasonló változásokat találtunk az IFN-γ + és az IFN-γ +/IL17 + CD4 + és a Treg populációkban az MLN-ben és a lépben, akár PTPN2 fl/fl-ből. xCD4Cre állatok vagy PTPN2-hiányos T-sejteket kapó Rag2 -/- egerek (3a. ábra, további 7a. és b. ábra). Ezek a megfigyelések egy gyulladáscsökkentő T-sejt fenotípus indukcióját mutatják egy egyén gyulladását elősegítő PTPN2 diszfunkcióban.

A PTPN2 elvesztése a T-sejtekben a T-limfociták beszivárgásához vezet a bélen kívüli szervekbe és autoimmun reakciókhoz vezet.

Ez azt mutatja, hogy a PTPN2 T-sejtekben történő elvesztése befolyásolja a bél mikrobiota összetételét a mikrobiotikus dysbiosis felé, amely hasonló az emberi krónikus bélgyulladáshoz, pl. CD. A gyulladás során a bél dysbiosis súlyosbodni látszik a PTPN2 fl/fl xCD4Cre egerekben, és hozzájárulhat a vastagbélgyulladás általános fokozott súlyosságához ezeknél az állatoknál. Mivel azonban csoportonként korlátozott számú hat egeret elemeztek, tanulmányaink megerősítenék a további vizsgálatokat.

A PTPN2 CD-asszociált változatának jelenléte fokozott Th1 és Th17 gén expressziót eredményez IBD betegek bélbiopsziáiban.

Az egereknél megfigyelt változások megfelelnek a nem funkcionális SNP variáns rs1893217 C homozigóta CD-ben szenvedő betegek helyzetének. Ezekben a betegeknél emelkedett Th1 és Th17 gének szintjét észleltük, de csökkentük a szabályozó és Th2 asszociált gén transzkriptumokat. gyulladt területekről származó biopsziák. A betegmintákban azonban a Th17-asszociált gén/citokin változások kifejezettebbek voltak, mint egereknél. A PTPN2 fontos szerepet játszik a hámsejtek integritásában, 33 és a citokinek szekréciójában az antigént bemutató sejtekből (APC); Így a betegeknél a hangsúlyosabb Th17 fenotípus tükrözheti a diszfunkcionális PTPN2-t nemcsak a T-sejtekben, hanem a bélben jelenlévő összes sejttípusban is. Megállapítottuk az IL-13 és IL-10 expresszió megnövekedett szintjét a WT CD-ben szenvedő betegeknél. Ezek a citokinek a Th2 és Treg sejtek megemelkedett szintjéhez kapcsolódnak; a sejtek alcsoportjait nem tekintik a CD gyulladásának okainak. A CD-ben megfigyelt bélgyulladás azonban általában elősegíti a Th-sejtek felhalmozódását, ami megmagyarázhatja ennek a két citokinnek a megfigyelt növekedését.

Úgy tűnik, hogy a PTPN2-hiányos TTP-sejtek megnövekedett potenciálja nem korlátozódik a bélre, mivel azok az egerek, amelyekben a T-sejtekben nincs PTPN2, gyulladásos beszivárgást mutatnak a májba, később pedig a vesékbe és a bőrbe. Noha számos gyulladásos betegségben érintett, a PTPN2-variánsok és a bőrbetegségek között összefüggést nem jelentettek. Ami a CD-t illeti, ezek a spontán gyulladásos beszivárgások nagyon érdekesek, mivel az extraintesztinális betegség megnyilvánulásai a CD-ben gyakori szövődmények. 35 A PTPN2 variánsok és a bél megnyilvánulásai közötti lehetséges összefüggéssel azonban még nem foglalkoztak. Adataink azt sugallják, hogy a bőr és a vesék elváltozásai a T-sejt-specifikus PTPN2 elvesztésével szembeni általános toleranciavesztés következményei. Ez rámutat a PTPN2 fontosságára a T-sejt homeosztázis szabályozásában számos T-sejt által közvetített autoimmun és gyulladásos rendellenesség miatt. Mivel korábban kimutattuk, hogy a PTPN2 aktiválása elegendő az akut DSS által kiváltott vastagbélgyulladás enyhítésére, 36 eredményeink utat nyithatnak számos krónikus gyulladásos és autoimmun betegség, például CD, rheumatoid arthritis, 1-es típusú, teljesen új kezelési lehetőség előtt. cukorbetegség, cöliákia, pikkelysömör vagy szisztémás lupus erythematosus.

Összességében bemutatjuk, hogy a T-sejtekben a PTPN2 elvesztése a patogén T-helper sejtek halmazának elősegítését eredményezi, ami fokozott érzékenységet eredményez a bélgyulladásra. Ezenkívül a PTPN2 elvesztése általános toleranciavesztést eredményez az idősebb, általában nem autoimmun hajlamú B6/C57 egereknél, ami sok szervben gyulladásos infiltrátumokat eredményez. Egerekben elért eredményeink hasonlítanak a CD-vel társított génvariánssal rendelkező CD-s betegeknél, és egérmodelljeinkben a bél dysbiosis szorosan korrelál a CD-s betegeknél megfigyeltekkel. Ezek a megfigyelések támogatják a PTPN2 döntő szerepét a krónikus gyulladásos betegségek és különösen a CD patogenezisében, és arra utalnak, hogy a PTPN2 diszfunkciója lehet a krónikus gyulladás és az autoimmunitás egyik mozgatórugója az emberben.

mód

Egerek és vastagbélgyulladás indukciója

A B6/C57 háttérrel rendelkező CD4Cre egereket a Taconic-tól (Köln, Németország), a RAG2 -/- egereket Janvier-től (Saint-Bellevin Cedex, Franciaország), a PTPN2 fl/fl-t az EUCOMM-től szereztük be. A T-sejtekben PTPN2 hiányzó egereket úgy állítottuk elő, hogy a PTPN2 fl/fl egereket kereszteztük CD4Cre állatokkal. A kísérletekhez használt összes egér nőstény volt, és egy adott kórokozótól mentes létesítményben tartották őket, és a kísérleteket a helyi állatjóléti hatóság, nevezetesen a svájci Zürich kanton állatorvosi hivatalának jóváhagyásával hajtották végre. Transzfert vastagbélgyulladás esetén a naiv T-sejteket izoláltuk Miltenyi-naiv T-sejtek izolációs készlet II-vel (Miltenyi, Gladbach, Németország), és 2,5 × 105 sejtet injektáltunk ip-be a RAG2 -/- gazdákba. A naiv T-sejtek (CD4 +/CD62L magas/CD44 alacsony/CD25 - sejtekként definiált) tisztasága> 94% volt áramlási citometriával elemezve. Az akut DSS vastagbélgyulladást 2,5% DSS (MP Biomedicals, Carlsbad, Kalifornia) adagolása indukálta az ivóvízben 7 napig. Az egereket a 10. napon leöltük. A krónikus DSS vastagbélgyulladást négy ciklus adagolásával indukáltuk, amely 7 napos 2% DSS-t tartalmazott, majd 10 napos normál ivóvizet. Az egereket 4 héttel az utolsó DSS-ciklus után leöltük. Minden kísérlethez alomtárs-kontrollokat használtunk.

A vastagbélgyulladás súlyosságának és szövettani pontszámának értékelése

Az állatokat ip-ban altattuk 90–120 mg/kg testsúly-ketaminnal (Vétoquinol, Bern, Svájc) és 8 mg/kg testtömegű xilazinnal (Bayer, Lyssach, Svájc). Az állatokat a korábban leírtak szerint vizsgáltuk. 44 A felvételt a Karl Storz Tele Pack Pal 20043020 (Karl Storz Endoscope, Tuttlingen, Németország) segítségével végeztük. A kolonoszkópiát az egér endoszkópos vastagbélgyulladás-súlyossági indexének (MEICS) pontozási rendszerével értékeltük, a korábban leírtak szerint 44, a következő öt paraméter felhasználásával: (i) a vastagbél átlátszósága, (ii) az érrendszer változásai, (iii) a fibrin látható, ( iv) a nyálkahártya felületének szemcséssége és (v) a széklet konzisztenciája. A gyulladásos infiltráció és a hámsejtek károsodásának szövettani pontozását az egér vastagbélének legtávolabbi 1 cm-es hematoxilinnal és eozinnal festett szakaszán végeztük. 44, 45

In vitro Th-sejt differenciálás

A naiv T-sejteket Miltenyi-naiv T-sejt II készlet alkalmazásával izoláltuk. A tisztaság áramlási citometriával elemezve> 97% volt. A Th differenciálódáshoz 0,5 × 106 sejtet/ml stimuláltunk 1 μg ml -1 lemezhez kötött anti-CD3-mal és 1 μg ml -1 oldható anti-CD28-al Th1-ferdeség alatt (10 ng ml -1 IL-12, 10 ng ml −1 IFN-γ plusz 10 μg ml −1 anti-IL-4), Th2 ferdeség (10 ng ml −1 IL-4, 10 μg ml −1 anti-IFN-γ plusz 10 μg ml −1 anti -IL-12), Th17-ferdeség (1 ng ml -1 TGFβ1, 10 ng ml -1 IL-6, 10 μg ml -1 anti-IL-4, 10 μg ml -1 anti-IFN-γ plusz 10 μg ml −1 anti-IL-12), vagy Treg torzulás (3 ng ml −1 TGFβ1, 20 ng ml −1 IL-2, 10 μg ml −1 anti-IL-4, 10 ng ml −1 anti-IFN -γ plusz 20 μg ml −1 anti-IL-12) körülmények között RPMI 1640 táptalajon (Life Technology, Carlsbad, CA) 2% magzati borjúszérummal és penicillin-sztreptomicinnel kiegészítve (Sigma, Buchs, Svájc).

Mikrobiota elemzés

Nagy áteresztőképességű szekvenálást végeztünk a vakbél DNS-en, 454 Life Sciences rendszert használva titán kémia kombinációjával (Roche AG, Basel, Svájc). A szekvenálást és elemzéseket a Microsynth-ben (Balgach, Svájc) végeztük. A V3 - V5 hipervariábilis 16S rRNS régiót céloztuk meg. Az amplikonokat Quant-iT PicoGreen dsDNA assay kit (Life Technologies) segítségével számszerűsítettük. A taxonómiai osztályozást minden egyes olvasáshoz Mothur alkalmazásával, Bayes-módszer alapján végeztük, 46 8 bp-os kmer-méretet és 1 000 iterációt alkalmazva. Referencia adatbázisként a Greengenes referencia taxonómiát (frissítve: 2013. június) 47 és a Silva referencia rendszertant 48 használták. A 70% -os határérték alatti bootstrap értékeket osztályozatlannak jelöltük.

Betegminták

A bélszöveti mintákat endoszkópiával vettük CD-ben szenvedő betegek makroszkóposan gyulladt, valamint nem terminális ileumának, vastagbélének vagy végbélének nem gyulladt régióiból (vad típusú (TT): n = 15, korosztály: 27–66, átlag: 47,4 ± 13,5 év; variáns (CC): n = 8, életkortartomány: 28–69, átlag: 43,8 ± 18,3 év), és nem IBD kontroll kontrollos betegeknél (n = 8, korosztály: 37–61, átlag: 49,1 ± 9,5). A kontroll betegek tünetmentesek voltak, és vastagbélrák szűrésre kerültek. A mintagyűjtés és a tanulmányok helyi etikai bizottság általi jóváhagyása előtt írásbeli beleegyező nyilatkozatot kaptak. A betegeket életkor, nem és betegség aktivitás szerint hasonlítottuk össze. A CD-hez kapcsolódó SNP rs1893217 PTPN2 genotípusát TaqMan technológiával (Life Technologies) határoztuk meg, az előzőekben leírtak szerint. 31

Statisztikai analízis

Eltérő rendelkezés hiányában az adatok reprezentatívak a két független kísérlet egyikére, mindegyik n ismétléssel, az adatok átlagként és az átlag standard hibájaként vannak feltüntetve. A statisztikai szignifikanciát Wilcoxon-Mann Whitney teszttel határoztuk meg.

További információ

PDF fájlok

További képek

Word dokumentumok

Kiegészítő ábrák és módszerek

A szerző közleményei

Az MRS kísérleteket végzett, elemezte az adatokat és megírta a kézirat első vázlatát; SK, CG, TR, IF, SL és KA kísérleteket hajtott végre, és részt vettek az adatok elemzésében; Az FM és a BB részt vett az áramlási citometriában; CC és CL végzett mikrobiotanalízist; SRV, MF, GR és MS részt vettek a betegminták gyűjtésében; A tagállamok megtervezték, megtervezték és felügyelték a vizsgálatot. Minden szerző megírta, javította és jóváhagyta a kéziratot.