elemeket

absztrakt

Az emlőrák kialakulásának megértése szempontjából fontos az emlő hámsejtek hierarchiájának (MEC) jellemzése és szabályozása a felnőttkori fejlődés során. Itt beszámolunk az egysejtű RNS szekvenálás használatáról a MEC gén expressziós profiljának meghatározásához négy fejlődési szakaszban; semleges, középső terhesség, szoptatás és utóinvolúció. 23 184 sejt elemzésével 15 klasztert azonosítottunk, amelyek közül többet egyetlen marker gén jellemezhetett teljes mértékben. Ehelyett azzal érvelünk, hogy a hámsejteket - különösen a luminális rekeszben - inkább konceptualizálni kell, mint egy folyamatos differenciálódási spektrum részét. Ezenkívül adataink alátámasztják egy közös luminalis progenitor sejt létezését, amely átmeneti, korlátozott alveoláris és hormon progenitorokhoz vezet. Ez a luminális progenitor rekesz transzkripciós változásokon megy keresztül a teljes terhesség, a laktáció és az involúció hatására. Összefoglalva: eredményeink globális, elfogulatlan képet nyújtanak a felnőtt emlőmirigyek fejlődéséről.

Itt egysejtű RNS szekvenálást (scRNAseq) használtunk az emlő hámsejtjeinek sejtdinamikájának feltérképezésére négy felnőttkori fejlődési szakaszban; semleges, mérsékelt terhesség, szoptatás és elválasztás (teljes természetes involúció). 23 184 egyedi sejtből származó adataink 15 különböző sejtpopulációt azonosítanak a mirigyben, és lehetővé teszik hierarchikus felépítésüket a fejlődési időpontokban.

az eredmény

Az egysejtű RNS-szekvenálás a mell hámsejtjeinek 15 klaszterét azonosítja

segítségével

Az egysejtű RNS-szekvenálás a mell hámsejtjeinek 15 klaszterét azonosítja. Vázlatos diagram, amely kiemeli az egyes sejtek RNS-izolálásának és szekvenálásának kísérleti beállítását 10x krómrendszerrel. b A 23, 184 sejt t-SNE grafikonja az adatok általános szerkezetét jeleníti meg. A sejteket négy fejlődési időpont szerint festjük az alábbiak szerint: rózsaszín = NP, sötétzöld = G, világoszöld = L, lila = PI. c Ugyanaz, mint a b, de a sejteket fürtökkel festjük. d a Kr-bazális marker és a Krt18 luminalis marker normalizált log-transzformált expressziójával festett t-SNE

Teljes méretű kép

A klaszterek további jellemzéséhez az ismert markerek alapján azonosítottuk a differenciálisan expresszált géneket és a feltételezett azonosságokat (2a., B. Ábra). Amint az 1. táblázat mutatja, több sejtcsoportot rendeltek ugyanahhoz a feltételezett sejttípushoz. Megállapítottuk, hogy ezekben az esetekben a sejtek nagy hasonlóságot mutatnak és ugyanazokat a marker géneket expresszálják, de különböző fejlődési stádiumokból származnak (lásd az NP, G, L vagy PI utótagot a 2a. Ábrán), ami arra utal, hogy a mirigy szakaszának specifikus hatása van a transzkripciós országra. bizonyos sejttípusok.

Az emlő hámsejtcsoportjainak feltételezett azonosságai. Fürt dendrogram 15 fürt log-transzformált átlagos expressziós értéke alapján. A fát Spearman korrelációja alapján számolták Ward kapcsolatával. b t-SNE a klaszter-specifikus gének átfedő expressziójával. c Hőtérkép, amely kiemeli azon kulcsmarkerek génjeit, amelyeket feltételezett azonosságok levezetésére használtak. A színskála logaritmikusan átalakított és normalizált számokat képvisel, soronként legfeljebb 1-re csökkentve. A felső oszlopok a fürt hozzárendelését és az egyes cellák mértékét mutatják. Megjelenítés céljából csak 100 véletlenszerűen kiválasztott cellát jelenítettek meg nagy fürtöknél

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

Két nagyobb alcsoportot találtunk a luminális térben (2a. Ábra). A C1 - C5 hormonérzékelő sejtek (Hs) jellemzőit mutatta, például magas szintű hormonreceptor-expressziót (Pgr, Esr1, Prlr) (2b. Ábra, c). A feltételezett Hs sejtekből azt találtuk, hogy a C1/C2 expresszált progenitor markerek (pl. Aldh1a3, Cd14, Kit) 18, ami korlátozott progenitor funkcióra utal (Hsp) (2b. Ábra, c), míg a C3/4/5 differenciáltabb (Hsd) (2b., C. Ábra; 1. táblázat). A luminalis rekesz második alcsoportja (C6 - C11) csak alacsony szintű hormonreceptort expresszált. A C6/7 magas szintű progenitor markereket expresszált, összhangban a luminalis progenitor (Lp) fenotípussal (2b. Ábra, c). Ezzel szemben a C8 - C11 tejfehérjéket expresszáltak (pl. Wap, Csn2), és kizárólag vemhességből és laktációból származó sejtekből álltak, alátámasztva azt a hipotézist, hogy szekréciós alveoláris (Av) sejtek (2b., C. Ábra; 1. táblázat). Feltételezett alveoláris sejtekből azt találtuk, hogy a C10/C11 korlátozott alveoláris progenitor funkcióval (Avp) összefüggő géneket expresszált, míg a C8/C9 differenciáltabb alveoláris állapotban (Avd) tűnt (2b. Ábra, c).

A bazális rekeszben azt találtuk, hogy a C14 sejtek myoepithelialis sejtjellemzőkkel rendelkeznek, például magas Acta2, Oxtr és Krt15 szintekkel (2b. Ábra, c). Ezenkívül a bazális rekesz tartalmazott egy sejtklasztert, a C15-et is, amely magas Procr, Gng11 és Zeb2 szintet expresszált, ami arra utal, hogy ezek a korábban azonosított Procr + bazális sejteket képviselik, amelyekről kimutatták, hogy dúsítottak az emlőmirigy újratelepítési egységei számára 19. (2b., C. Ábra).

A luminalis differenciálódás hierarchiájának rekonstrukciója

Összpontosítottunk az NP és G időpontról származó sejtekre, hogy meghatározzuk a mell hámdifferenciálódásának állapotát. Ezeket a differenciálási állapotokat és a köztük lévő átmeneteket számítási szempontból rekonstruálni lehet 20 diffúziós térképek segítségével. Röviden, ez a módszer alacsony dimenziós térben tartalmaz adatokat, ahol a sejtek közötti távolság fokozatos, de sztochasztikus folyamatot jelent, például differenciálódást. Az összes hámsejtből készített diffúziós térképeken világos szegregációt figyeltünk meg a luminalis és a bazális klaszterek között, gyakorlatilag nem volt tranziens a két csoport között (3a. Ábra). Ez alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a normál szöveti homoeostasis során a két vonal nagyrészt önfenntartó, összhangban a legtöbb 21., 22., 23. utóvizsgálattal. Ezzel szemben a luminális elválasztás eltérő struktúrát mutatott, fokozatos átmenettel a különböző klaszterek és közös eredetű sejtek között (3b. Ábra). Megerősítettük ennek a bifurkációnak a robusztusságát annak igazolásával, hogy az különféle tulajdonságválasztási módszerek, pálya levezetés és lefelé mintavételezési algoritmusok alkalmazásakor volt jelen (5. ábra).

Az emlőmirigy differenciálódási folyamatainak számítási rekonstrukciója. A hámsejtek diffúziós térképe az NP és G időpontokból, bemutatva az első három diffúziós komponenst. b A luminális rekesz differenciálódásának pályái az első két diffúziós komponens alapján. c Ugyanaz a grafikon, mint a b, különböző gének normalizált és csökkent expressziós szintjeivel festettük

Teljes méretű kép

Megállapítottuk, hogy az Aldh1a3 progenitor marker expressziója fokozatosan csökkent, amikor a sejtek eltávolodtak közös eredetüktől (3c. Ábra), amelyet nagyrészt C6 (Lp) sejtek alkottak. Megjegyeztük továbbá, hogy a differenciálódási pálya bal oldala C8-nál (Avd) ér véget, és a Csn2 és a Glycam1 megnövekedett expresszióját mutatja (3c. Ábra), összhangban a szekréciós fenotípussal. A C6 és C8 között olyan sejteket találtunk, amelyek főleg C10-ből származtak (Avp, 3b. Ábra). A differenciálódási pálya jobb karján a sejtek C6-ról C2-re és C4/5-re (Hsp és Hsd) haladtak át, amelynek során az Esr1 és Pgr expressziója növekedett, ami arra utal, hogy ez az ág a hormonérzékelő luminalis sejtek felé mutat differenciálódást (1. ábra). (3c). ).

Az álidő elrendezés azonosítja a luminalis differenciálódáshoz kapcsolódó géneket. A hormonérzékelés és a szekréciós differenciálódás ágának meghatározása. A sejteket pszeudotim útján történő progresszióval festjük, ahol az alacsony értékek differenciálatlan sejteket képviselnek. b - d Példák pszeudotim-függő expresszióval rendelkező transzkripciós faktorokra, ugyanazon általános tendenciával mindkét ágban ( b ) vagy ágazatspecifikus trendek ( c, d ). e, f Az összes, ágfüggő expressziójú gén hőtérképe, a hormonérzékelési vonal függvényében pszeudotime ( e ) vagy szekréciós vonal ( f ). Az álidőt és a fürtkiosztást hő fölött jegyzik. A hőtérkép értékei a z-skálával csökkentett, spline-simított értékeket képviselik. A hőtérképek génjeit hierarchikus klaszterezéssel, dinamikus fa vágással csoportosítottuk

Teljes méretű kép

A paritás felkészíti a luminalis progenitorokat az alveoláris sors felé

A paritás hatása a luminalis progenitor rekesz transzkriptikus tájára. A C6 vs. luminális rekesz és redő változások a C7-hez képest a luminális sejtekhez képest. A gének képviselik a top 500 különböző módon expresszált gént a C6 és a luminalis sejtek között. b A C6 és C7 közötti differenciál expressziót bemutató vulkanikus grafikon, a színes pontok fontos gének, amelyek ismert funkcióval rendelkeznek a laktációban és az immunitásban, a szaggatott vonalak kiemelik a P-küszöbérték 0, 01 értékét és az 1-es log-szeres változást. írta Benjamini - Hochberg. c, d A laktációval kapcsolatos gének expressziójának különbségének megjelenítése ( c ) vagy mentesség ( d ) hat luminális klaszterhez NP-ben és PI-ben. A kifejezési értékek megfelelnek az UMI-k normalizált számának. e Az NP és a G pontok diffúziós térképére vetített PI sejtek, az NP és G sejtek szürke színűek

Teljes méretű kép

vita

Röviden, adataink elfogulatlan képet nyújtanak az emlőmirigy fejlődéséről. Ez a megközelítés segít alátámasztani néhány korábban kidolgozott hipotézist az emlőmirigyben, és leírja a differenciálódás folyamatait nagy sejtfelbontás mellett. Az adatkészlet hasznos forrás lesz a jövőbeni tanulmányok során, hogy megértsék a mirigy különböző sejttípusai közötti kapcsolatot, valamint az emlőrák kialakulását és előrehaladását.

mód

Az állatokon végzett összes kísérleti munkát az Egyesült Királyságbeli Animal Procedures Act 1986-os törvénynek megfelelően hajtották végre, amelyet a Sanger Intézet Etikai Bizottsága hagyott jóvá. A C57BL/6N egereket egyedileg szellőztetett ketrecekben helyeztük el 12:12 órás világos-sötét ciklusban, vízzel és élelemmel ad libitum rendelkezésre állva. A kísérletet úgy alakítottuk ki, hogy lehetővé tegye az összes fejlesztési időpont összegyűjtését és a szövetek feldolgozását egyidejűleg. Az egereket végső érzéstelenítéssel feláldoztuk. A nőstények párosodtak a csapokkal és kidobták őket. A szöveteket ezután a terhesség 14.5 (G), a laktáció 6. (L) és a természetes elválasztást követő 11. napon (PI) gyűjtöttük be. Az NP nőstények szövetét 8 hetes korban gyűjtötték be. Fejlesztési időnként két külön egeret alkalmaztunk a vizsgálatban. Az állatok északi ciklusának szakaszát az NP és PI időponttól hüvelyi kenet segítségével határoztuk meg (8. kiegészítő ábra).

Az emlőmirigy disszociációja egysejtű sejtek szuszpenziójáig

Az emlőmirigyektől megfosztott nyirokcsomókat (a nyaki pár kivételével) elválasztották az egerektől és mechanikusan disszociáltak. A finomra őrölt szövetet DMEM/F12 (Gibco) + 10 mM HEPES (Gibco) + kollagenáz (Roche) + 200 U ml - 1 hialuronidáz (Sigma) + gentamicin (Gibco) keverékből 3 órán át 37 ° C-on állítottuk fel. ° C hőmérsékleten, és 30 percenként kavargott. A vörösvértestek NH4Cl-ban történő lízise után a sejteket rövid ideig emésztettük 0,05% meleg tripszin-EDTA-val (Gibco), 5 mg ml-1 diszpázzal (Sigma) és 1 mg ml-1 DNázzal (Sigma) és a sejtszűrővel. (BD Biosciences) szűrtük.

Sejtjelölés, majd áramlási citometria és válogatás

Könyvtár előkészítése és szekvenálása

A könyvtár előkészítését a 10x egysejtű készlet utasításainak megfelelően hajtottuk végre. Ezután a könyvtárakat összegyűjtöttük és hat sávban szekvenáltuk a HiSeq2500-on.

RNS-seq adatfeldolgozás

Az olvasás feldolgozását egy 10X Genomics munkafolyamat 17 segítségével végeztük. Röviden: a Cell Ranger Single-Cell Software Suite-ot (//software.10xgenomics.com/single-cell/overview/welcome) használták demultiplexeléshez, vonalkód-hozzárendeléshez és UMI-számszerűsítéshez. A leolvasásokat az mm10 referenciagenomhoz igazítottuk, előre elkészített annotációs csomag segítségével, amelyet a 10X Genomics weboldaláról szereztünk be. A mintán lévő összes sáv feldolgozása a "cellarangszámolás" funkcióval történt. A különböző útvonalak kimenetét ezután összesítettük a „cellranger aggr” és a „normal” értékre állítva.

Minőségellenőrzés és előfeldolgozás

csoportosulás

A $ config [ads_text16] nem található

Differenciál expressziós elemzés

A differenciál gén expressziós elemzést a edgeR 46 segítségével végeztük. A klaszterek páronkénti összehasonlításához 0,1 g alatti átlagos expressziós szinttel rendelkező géneket távolítottunk el az elemzésből. Negatív binomiális, általánosított log-lineáris modellt illesztettünk a többi génhez, a klaszterkihelyezés kovariátusként. A „glmTreat” függvényt olyan gének azonosítására használtuk, amelyek logaritmusának változása szignifikánsan nagyobb, mint 1, 0,01 FDR mellett. Ábrán vizualizált marker gének. 2-et a 'findMarkers' függvény segítségével azonosítottunk a szkennelés során, alapértelmezett beállításokkal azon gének esetében, amelyek medián expressziója 1 volt legalább egy fürtben .

Diffúziós térképek és álidejű következtetések

A differenciálódási pálya következtetésére diffúziós térképeket használtunk. Először az összes cellát kiválasztottuk az NP és G időpontról (3a. Ábra), és a fent leírt módon detektáltuk a HVG-ket. Ezután a log-transzformált (log2 (szám + 1)) génszámlálást használtuk a diffúziós komponensek kiszámításához a „DiffusionMap” függvény segítségével (alapértelmezett paraméterek, mint a 47. sorsban). Ábrán. A 3b. Ábrán látható módon a luminális rekeszre összpontosítottunk, és a diffúziós térképet csak a luminális sejtek alapján számítottuk ki, a fent említett eljárással. Nevezetesen, a diffúziós térkép algoritmus által levezetett struktúra robusztus volt a jellemzők megválasztására és a sejtek alacsonyabb mintavételére (Kiegészítő 5b. Ábra). A közös eredet és a két ág szerkezetére a 48 standard beállítással rendelkező Monocle segítségével is ki lehet következtetni (Kiegészítő 5a. Ábra). Az elágazások és a pszeudotime-sorrend következtetésére a következő három tippet határoztuk meg, a második sajátvektor legnagyobb értékű celláját (amelyet gyökérként állítottunk be), és azokat a sejteket, amelyek legnagyobb és legkisebb értékekkel rendelkeznek az első sajátvektorhoz (összehasonlítva (4a).

Pseudotime-függő kifejezés

Géndúsítási elemzés

Génkészlet-dúsítási elemzést végeztek gén-ontológiai (GO) kifejezéseken alapulva, hogy az elemzés során különféle géncsoportokat jellemezhessenek. Az érdeklődésre számot tartó géneket összehasonlítottuk az összes olyan génnel, amelyek differenciál expresszióját tesztelték topGO alkalmazással alapértelmezett beállításokkal 49 .

Az adatok elérhetősége

A szerzők kijelentik, hogy a tanulmány megállapításait alátámasztó összes adat elérhető a cikkben és annak kiegészítő információs fájljaiban, vagy ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől. Az RNS szekvenálási adatokat a Gene Expression Omnibus (GEO) adatbázisban GSE106273 csatlakozási kód alatt raktuk le. Az adatok a //marionilab.cruk.cam.ac.uk/mammaryGland címen is feltárhatók. Az összes számítási elemzést R-ben (3.4.1 verzió) végeztük standard függvények alkalmazásával, hacsak másként nem jelezzük. A kód online elérhető a //github.com/MarioniLab/MammaryGland címen.

köszönöm

Köszönjük a Sanger Intézet, a Kutatási Szolgáltató Intézet (RSF) segítségét. Köszönöm Dr. Aaron T. Lun (CRUK CI) a kézirattal kapcsolatos hasznos beszélgetésekért és megjegyzésekért. A KB-t a Cambridge Cancer Center finanszírozza. A DA finanszírozza a CRUK-ot és a Wellcome Trust-ot. Az SP-t a CRUK finanszírozza. A JCM finanszírozza a CRUK-ot és az EMBL-t. A WTK-t a CRUK Karrier Díj (C47525/A17348) finanszírozza, a Cambridge-i Egyetem és a Magdalene College, Cambridge.