programozás

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az inzulin szignalizációjának hatóanyagai a bal kamrai szövetben
  • A bal kamrai hipertrófia (LVH) és a stressz mediátorai
  • Szteroid receptor expresszió
  • Szövettani eredmények
  • vita
  • Anyag és módszerek
  • Az RNS és a polimeráz láncreakció izolálása valós időben
  • Western Blot
  • Szövettani elemzés
  • hisztomorfometria
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Kardiovaszkuláris biológia
  • Betegségmodell

absztrakt

A 23, 24-es szívhipertrófiában számos, az inzulin szignálozásában szerepet játszó molekuláris mediátor érintett, például foszfatidil-inozit-3-kináz (PI3K)/protein-kináz B (AKT)/emlősök a rapamicin komplex 1. jelátviteli útján (mTORC1). In vitro vizsgálatokból származó bizonyítékok 25 arra utalnak, hogy a T kiváltja a szív hipertrófiáját az mTORC1 útvonal aktiválásával. Mivel a prenatális T funkcionális hiperandrogenizmust és inzulinrezisztenciát vált ki a 4, 18 juhban, megváltoztatja az inzulin jelátvitelt a májban és az izmokban 26, és mind a T, mind az inzulin képes megváltoztatni a szívműködést, feltételeztük, hogy a prenatális T felesleg is megzavarja az inzulin jelátvitelt és növeli az inzulint inzulinszabályozás. a szív hipertrófiájának molekuláris markerei, amelyek káros szív átalakuláshoz vezetnek.

az eredmény

A testtömeg (kg; átlag ± SEM) nem különbözött a kontroll és a T-kezelt juhoktól a gyűjtés időpontjában (T-vel kezelt 69, 4 ± 5, 4 szemben a kontroll 63, 09 ± 4, 9 p = 0,40, kohézió d = 0, 44). Az éhomi inzulinszint (NE/ml; átlag ± SEM) a prenatális T-vel kezelt nőknél általában magasabb volt (T-vel kezelt 15, 7 ± 4, 7, szemben a kontroll 9, 23 ± 2, 12, p = 0,26), Cohens-szel az elemzés enyhe növekedést mutatott ki (d) = 0,65). Az éhomi glükózszint (mg/dl; átlag ± SEM) átlagosan 58 ± 3, 9 és 52 ± 1,7 volt a T-vel kezelt nőknél és a kontrolloknál (p = 0,28), a Cohens-elemzés kismértékű eltérést tárt fel. d = 0,67)., Az inzulin/glükóz arány szintén magasabb volt a T-kezelt csoportban (0,25 ± 0,06), mint a kontrollcsoportban (0,17 ± 0,04), Cohen elemzései enyhe növekedést mutattak (d = 0,60) . A T-vel kezelt nők bal kamrai súlya általában nagyobb volt, de statisztikailag nem különbözött a kontroll juhoktól (T-vel kezelt 164, 9 ± 9, 9 gramm, szemben a kontroll 152 ± 7,2 grammal, p = 0,30, kohézió d = 0, 54).

Az inzulin szignalizációjának hatóanyagai a bal kamrai szövetben

A prenatális T-vel kezelt nőknél a bal kamrában szignifikáns növekedést tapasztaltak az inzulin szignálútban részt vevő fehérjék génexpressziójában a kontrollokhoz képest. A prenatális T felesleg 6,4-szeresére növelte az IRS-1 (p = 0,027), a PI3K 8,5-szeresére (p = 0,04) és az AKT expressziós szintjét 27-szeresére (p = 0,06) a kontrollhoz képest (1. ábra).

Két farkú t-próbát alkalmaztunk a T-kezelt és a kontroll csoport közötti különbségek tesztelésére, és * p-t 0,06-os ap-értékkel jelöltük meg. Cohen-féle hatásmérési elemzés nagy különbségeket tárt fel a T-kezelt és a kontroll csoportok között az inzulinszignálban résztvevő gének tekintetében sávok (Cohen d: AKT = 1,11, IRS-1 = 1,33, PI3K = 1,29, GSK3b = 0,452). Rövidítések: IRS-1 inzulin receptor 1. szubsztrát, PI3K foszfoinozidid 3-kináz, Akt protein kináz B, GSK3B Glikogén szintáz kináz 3 béta.

Teljes méretű kép

Kiindulási körülmények között a PI3K fehérje expressziója (p85 alegység) a bal kamrában szignifikánsan különbözött (p = 0,01) a prenatálisan kezelt T (0,023 ± 0, 0) és a kontroll nők (0, 019 ± 0,001) között; és a pPI3K szintén növekedett (p = 0,008) a prenatálisan kezelt T-ben (0,01 ± 0,005) a kontrollhoz képest (0,008 ± 0,006). A pPI3K/PI3K arány statisztikailag nem volt szignifikáns a csoportok között (prenatális kezelés T: 0,5 ± 0,03 vs kontroll: 0,45 ± 0,05, p = 0,55). Összes AKT (prenatális T: 0, 40 ± 0, 03 vs 0, 26 ± 0, 02; p = 0, 007) és pAKT (prenatális T: 0, 26 ± 0, 03 vs kontroll: 0, 18 ± 0, 02; p = 0,028) szignifikánsan nőtt a prenatálisan T-kezelt nőknél a kontrollhoz képest. A pAKT/AKT arány (prenatális T-vel kezelt: 0,65 ± 0,05; vs. kontroll: 0,69 ± 0,04) statisztikailag nem különbözött a két csoport között (p = 0,57). Nem láttunk különbséget a glükóz transzporter 4 (GLUT 4) fehérje szintjeiben a prenatális T-vel kezelt és a kontroll között (p = 0,33, 2. ábra).

Kettős Student-féle t-próbát alkalmaztunk a T-kezelt és a kontrollminta közötti különbség tesztelésére, és * p-t 25, 27-hez rendeltünk in vitro, amelyet a bal kamrában találtunk prenatálisan T-vel kezelt nőknél a kontrollhoz képest (p = 0,002 ) (3. ábra) és fehérje-expressziója a bal kamrában is növekedett (teljes mTOR: prenatális T 0, 16 ± 0,02 vs kontroll 0,11 ± 0,01, p = 0,04; p mTOR: prenatális T: 0,09 ± 0,008 vs 0,056 kontroll ± 0,004; p = 0,01) (4. ábra). A GSK3β, az AKT fontos downstream célpontja a szívben, amely hozzájárul a hipertrófiás növekedés elnyomásához 28, különbözött a két csoport között. A teljes GSK3 béta szignifikánsan megnőtt (p = 0,04) a prenatálisan kezelt nőknél (6,1 ± 0,57) a kontrollhoz képest (4,5 ± 0,4); míg a p-GSK3 béta nem különbözött (p = 0,16) a prenatálisan kezelt T (1,99 ± 0,22) és a kontroll (1,56 ± 0,15) csoportok között. A p-GSK 3 béta/GSK3beta arány szignifikánsan alacsonyabb volt (p = 0,002) azoknál a nőknél, akiket prenatálisan T-vel kezeltek (0,32 ± 0,008), összehasonlítva a kontrollokkal (0,35 ± 0,05) (4. ábra).

A T-kezelt és a kontroll csoport közötti különbség teszteléséhez két farkú t-tesztet alkalmaztunk a * p-nál (p 0,06). Cohen-féle hatásméret mérsékelt vagy nagy különbségeket tárt fel a T-kezelt és a kontroll csoportok között a jelátviteli utak: inzulin (Cohen d: mTORC1 = 1,89, aMHC = 1, 20, ßMHC = 0,89, mTORC1 = 1,89, BNP = 1,34, ANP = 0,61, NFATc3 = 1,46). Rövidítések: mTORC1 rapamicin-1 komplex emlős célpontja, MHC miozin nehézlánc, BNP agy naturetikus peptid, ANP pitvari naturetikus peptid, NFATc3 nukleáris faktorral aktivált T sejtek.

Teljes méretű kép

A T-kezelt és a kontrollminta közötti különbség teszteléséhez kettős Student-féle t-tesztet alkalmaztunk, és p 29 értéket rendeltünk hozzá. A prenatális T 3,5-szeresére növelte az NFATc3 génexpressziót a kontrollhoz képest (p = 0,02, 3. ábra). A BNP és az ANP, a szívfal-törzsre válaszul felszabaduló markerek a szív hipertrófiájában, azt mutatták, hogy a prenatálisan T-kezelt csoportban a BNP 8,2-szeresére nőtt a kontrollokhoz képest (p = 0,01, 3. ábra), míg az ANP szintek nem különbözött a csoportok között (1-szeres változás, 64: p = 0,28).

Az aMHC, egy domináns rágcsáló miofilamentum fehérje, amelyről kimutatták, hogy a szív hipertrófia 30, 31, 32 rágcsáló modelljeiben megváltozott, a prenatális T-vel kezelt csoportban 2-3-szorosára nőtt a kontrollokhoz képest (p = 0,046) ( 3)., A ßMHC-vel ellentétben a felnőtt emberi bal 33 kamrában a domináns miofilamentum fehérje nem különbözött szignifikánsan (2-szeres változás, p = 0, 10) a két csoport között.

Szteroid receptor expresszió

Bár az androgén és az ösztrogén receptorok a bal kamrai juhszövetben expresszálódtak, a prenatális T kezelés nem változtatta meg szignifikánsan az androgén receptor vagy az ösztrogén receptor béta vagy az alfa gén expresszióját (AR-változás 0,88 p = 0,40, ER béta-változás 2,2: 2: p = 0, 17, ER alfa többszörös változás 1, 5: p = 0, 64, 5. ábra).

A Cohen-hatás nagysága kicsi különbségeket talált a T-kezelt és a kontroll csoportok között az androgén és ösztrogén receptorok génexpressziójában (AR = 0, 2, ER alfa 0, 26 és ER béta 0, 77) Rövidítések: AR androgén receptor, ER ösztrogén receptor.

Teljes méretű kép

Szövettani eredmények

A 8 prenatális T-vel kezelt nő közül 5-nél fokozatos miokardiális rendellenesség volt a bal kamrában H&E és Masson festés esetén, összehasonlítva a kontrollokkal, amelyeknek nem voltak bizonyítékai a miokardiális diszfunkcióra (6a ábra). A prenatális T kezelés megnövelte a kardiomiocita méretét a kontrollhoz képest (T kezelt 15,1 ± 0,4 μm vs. 13,6 ± 0,4 μm, p = 0,02) (6b. Ábra).

( A ) A T (A) és a kontroll (B) kezelt kétéves prenatális juhok bal kamrai szövetéből származó H&E metszetek reprezentatív szövettani metszetei. ( B ) A prenatális T kezelés hatása a kardiomiocita átlag átlagára. * 18, 22 p-értéket jelöl. Ezek a molekuláris jelátviteli rendellenességek fokozott érzékenységhez vezethetnek a szívkárosodásra.

Az mTORC1 a fehérjeszintézis egyik legfontosabb szabályozója a kardiomiocitákban, és aktivációja a szív hipertrófiájához vezet 41, 42. Növekedési faktorok által aktiválható, beleértve az inzulint a jelátviteli útvonalán keresztül, valamint a T 25, 43-on keresztül. A fehérje aktiválása az inzulinreceptor után (PI3K/AKT/mTORC1) a szív "fiziológiás hipertrófiájával" jár, de bizonyítékok vannak "patológiás" hipertrófiára is ezen út krónikus aktiválásával 44, 45, 46, 47, 48, ami a koordinált szövetnövekedés és az angiogenezis megzavarásához vezet. Ennek a vizsgálatnak az eredményei, amelyek az mTORC1, PI3K és AKT fokozott expresszióját mutatják, arra utalnak, hogy a prenatális felesleges T lehet a szív inzulin jelátviteli útjának aktiválásának alapja, ami az mTORC1 aktivációjához vezet, ami végül szív hipertrófiához vezet. A BNP és az NFATc3 fokozott génexpressziója, a patológiás hipertrófia mindkét markere, maladaptív hipertrófiát jelez.

Mivel a prenatális T felesleg anya hiperinsulinémiájához 49 és posztnatális inzulinrezisztenciájához 18 vezet az utódokban, valószínű, hogy az anyai hiperinsulinémia a prenatális T által kiváltott szív hipertrófiájának programozásában is fontos szerepet játszhat az utódokban. Például a PI3K/AKT/mTORC1 jelátvitel növekedése figyelhető meg veleszületett hiperinsulinémiában szenvedő újszülöttekben 50, 51. Hasonlóképpen, az anyai elhízás miatti magzati hiperinsulinémia kimutatta, hogy az utódokban szívprogramozási rendellenességekhez vezet a bal kamrai hipertrófia megnövekedett markereivel és az AKT, valamint az mTOR 52 növekedésével. .

Míg a T a hiperinsulinemia programozásával közvetetten a szív hipertrófiájához vezethet, az androgén kardiális hipertrófiára gyakorolt ​​közvetlen hatásának lehetőségét nem lehet figyelmen kívül hagyni. Ezek az állatok funkcionálisan hiperandrogének és megnövekedett AR-expressziót mutatnak a hipotalamusz 53, az agyalapi mirigy (Cordoso és Padmanabhan, nem publikált) és a petefészkek 54 szintjén. Kardiomiopátiát figyeltek meg veleszületett mellékvese hiperpláziában 55 szenvedő újszülötteknél, olyan állapotban, amelyben a magzat túlzott endogén androgénnek van kitéve. Az androgén és az ösztrogén receptorok mind a citoszolban, mind a 19 sejtmagban jelen vannak a szívszövetben. Kimutatták, hogy a nemi hormonok receptorokhoz való kötődése genomikus és nem genomikus hatásokat eredményez a szívre, és az egyik mechanizmus a PI3K/AKT 19 út aktiválása, amely az mTORC1 downstream aktivációjához vezet, ami fokozott fehérjeszintézishez vezet. és végső soron a szív hipertrófiája 24. Míg az androgén receptorok a bal kamrában expresszálódnak a T közvetlen hatásainak megkönnyítése érdekében, az AR expresszió változásának hiánya a prenatális T-vel kezelt nőknél arra utal, hogy a T bármely közvetlen hatását a ligandum növekedése (T kezelés), nem pedig a receptor közvetítheti.

Megállapították, hogy a T növeli a kardiomiocita glükózfelvételt a GLUT456 transzlokációjának növelésével, és bár a bal kamrában bazális körülmények között nem észleltek növekedést a GLUT4 fehérje expressziójában, az inzulinszignál fehérjék, köztük az IRS-1, PI3K és AKT fokozott expressziója a bal kamrai glükóz növekedését sugallja anyagcsere. A szabad zsírsavak az elsődleges tüzelőanyagok a szívszövetben történő energiatermeléshez, de a magzati élet és a stressz során a szív visszatér a glükózhoz, mint elsődleges üzemanyagforrás 57. A prenatális T nőstényeknél a glükózfelvételben szerepet játszó fehérjék fokozott génexpressziója adaptív választ jelezhet a szív megnövekedett metabolikus igényére, mivel a BNP fokozott expresszióját is látjuk, amely a szívstressz egyik markere. A megnövekedett mTORC1 expresszió azt sugallja, hogy a T az mTORC1 növekedésével a szív hipertrófiájához vezethet, amint azt már 25 .

Transzlációs szempontból ezek a megállapítások relevánsak lehetnek a PCOS-ban szenvedő nők utódai szempontjából. Kimutatták, hogy az androgén és az inzulin szintje emelkedett a PCOS 67, 68 terhes nőknél, és bizonyítékok vannak arra, hogy a spanyol kohorszok csökkent születési súlyú gyermekeket szülnek 69. A PCOS anyák női utódainak korai anyagcserezavarai vannak 70, hasonlóan a prenatális T18 modellünkhöz, ami arra utal, hogy a prenatális T-juh modellhez hasonlóan a hiperandrogenizmus jelenléte PCOS-ban szenvedő nőknél számos szervrendszert hátrányosan programozhat, beleértve a szív- és érrendszert is. utódaikban.

Röviden, e vizsgálat eredményei bizonyítékot szolgáltatnak a szív újraprogramozására a PCOS juhmodelljében. Az ilyen változások funkcionális következményeit tisztázó további tanulmányok létfontosságúak, és javítják a prenatális felesleges T szív hatására gyakorolt ​​hatásának megértését, és új kezelési stratégiák kidolgozásában segítenek megelőzni a szív érzékenységét a prenatális sértésekre.

Anyag és módszerek

Körülbelül 2 éves korban, az endogén szteroidok különböző szintjeinek hatásainak elkerülése érdekében minden állatot petefészek-eltávolítással és 1 cm hosszú SILASTIC kapszulával ültettek be (belső átmérője 3,35 mm, külső átmérője 4,65 mm; Dow Corning Corp., Midland, MI) ) 17β ösztradiollal (ösztradiol; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) töltve. Körülbelül egy hónappal később két belső gyógyszer-felszabadító progeszteron implantátumot (InterAG, Hamilton, Waikato, Új-Zéland) szubkután injektáltunk minden állatba. A progeszteron implantátumokat 14 nappal később eltávolítottuk, és minden állat további négy, 3 cm hosszú ösztradiol implantátumot kapott a késői follikuláris fázisban észlelt petefészek szteroid szint elérése érdekében. Az állatokat feláldoztuk

20 órával az ösztradiol implantátumok behelyezése után a ciklus várható késői follikuláris fázisában barbiturát túladagolással (Fatal Plus, Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). A szíveket összegyűjtöttük, és a jobb és a bal kamra egy részét lefagyasztottuk, és -80 ° C-on tároltuk, amíg a feldolgozás vagy a formalin stabilizálódott a szövettani feldolgozáshoz. A plazma inzulint és a glükózt 48 órás éhezés után az eutanázia előtt mértük. Az inzulin koncentrációkat radioimmun vizsgálattal (Insulin RIA Kit, MP Biomedicals) határoztuk meg. Az inzulin teszt érzékenysége 3,0 μU/l volt. A glükózkoncentrációkat glükóz-oxidáz módszerrel határoztuk meg (Pointe Scientific Inc.). Az inzulin- és glükózvizsgálatok inter- és intra-teszt CV-i 90% -ban hatékonyak voltak. A génspecifikus láncindítókat láncindító szelekciós szoftver alkalmazásával terveztük meg, és részletesen leírjuk az 1. táblázat kiegészítő anyagában.

A valós idejű SYBR Green PCR vizsgálatot a keletkezett cDNS felhasználásával hajtottuk végre. Fordított transzkriptáz negatív kontrollt hajtottunk végre minden mintán, hogy kizárjuk az izolált RNS genomi DNS-sel való szennyeződését. A kvantitatív RT PCR reakciókat Applied Biosystem 7200 Real Time PCR eszközön hajtottuk végre, és három példányban hajtottuk végre őket. A vizsgálati eredményeket az egyes minták küszöbérték-ciklusának (CT) értékeivel számszerűsítettük. Az egyes érdekes gének CT-értékeit összehasonlítottuk a háztartási gén, a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) értékeivel. Csak a 35-nél kisebb értékeket tekintették pozitívnak. Az egyes tesztek eredményeit a második teszt eredményeinek megismétlésével ellenőriztük.

Western Blot

Szövettani elemzés

A bal kamrai szöveteket formaldehidben rögzítettük PBS-ben (pH 7, 4). A szövetet ezután soros alkoholokkal dehidratáltuk, xilolokban megtisztítottuk és paraffinba ágyazottuk. 5 μm vastag paraffin metszeteket vágtunk és festettünk hematoxilinnal és eozinnal (H&E) a durva megjelenés elemzéséhez. Kontrasztfestéssel festett hematoxylin (PAS-H) perjodátot használtunk a kardiomiocita méretének számszerűsítésének megkönnyítésére a Michigan State University szövettani kutató laboratóriumunk segítségével. A szövettani metszeteket véletlenszerű sorrendben vizsgálta két független állatorvosi patológus, akik megvakultak a kezelési csoportok előtt.

hisztomorfometria

A korábban kialakított protokollok szerint 73, 74 átlagos bal kamrai kardiomiocita átmérőt határoztak meg úgy, hogy 100 kardiomiocita rövid tengelyét nukleáris keresztmetszetben, majdnem körkörös kapilláris profilban, 10 véletlenszerűen kiválasztott mikroszkópos mezőben 400-szoros nagyítással mérték. A méréseket CellSens szoftverrel végeztük.

Statisztikai analízis

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Vyas, AK és mtsai. Prenatális programozás: nem kívánt szívprogramozás a túlzott terhességi tesztoszteron miatt. Sci. ismétlés. 6., 28335; doi: 10, 1038/srep28335 (2016).

További információ

Word dokumentumok

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.