anyatejjel

  • elemeket
  • absztrakt
  • a cél:
  • Dizájnt tanulni:
  • az eredmény:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • mód
  • Népességi tanulmány
  • A minta előkészítése
  • Klinikai adatok gyűjtése
  • szerológia
  • Valós idejű kvantitatív PCR elemzés
  • UL144 amplifikáció gének és DNS-szekvenálás
  • Statisztikai elemzések
  • az eredmény
  • vita

elemeket

  • gyermekgyógyászat
  • Vírusos fertőzés
  • Vírusfertőzés

absztrakt

Prospektív módon értékeltük a posztnatális citomegalovírus (CMV) anyatejjel történő átvitelének sebességét rendkívül koraszülötteknél, hogy kezeljük a CMV-fertőzés koraszülöttekre gyakorolt ​​hatását laktáció alatt.

Dizájnt tanulni:

Összesen 25 anyát és 27 gyermeket (két ikerkészlet), születési súlya 1 volt. A veleszületett CMV-fertőzés jelentős hosszú távú következményekkel jár, mint például a szenzorineurális halláskárosodás és a mentális retardáció. 2, 3 A veleszületett fertőzésekkel ellentétben kevesebb hangsúlyt fektetnek a posztnatális CMV megszerzésének hatásaira, valószínűleg azért, mert ez gyakran tünetmentes és úgy gondolják, hogy alacsony morbiditáshoz vezet. 4 Azonban a legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a koraszülöttek posztnatális CMV-fertőzései súlyos klinikai tüneteket okoznak, ideértve a légzési kompromisszumokat, a neutropeniát, a trombocitopéniát, a hepatomegalia és a szeptikus szindrómákat, ismét felkeltették az érdeklődést ennek a kórokozónak a hatása a közvetlen posztnatális időszakban. 5, 6, 7

mód

Népességi tanulmány

Ez a prospektív vizsgálat magában foglalta a szoptatott koraszülötteket és anyáikat, akik 2003. április 1-től 2004. szeptember 30-ig kerültek a Nagoya Egyetemi Kórházba, a Nagoya Első Vöröskereszt Kórházba és az Ogaki Városi Kórházba. A vizsgálat 2500 g terhességi korú koraszülöttet tartalmazott. Az egyes intézmények etikai bizottsága jóváhagyta a vizsgálatot, és minden szülő vagy gondviselő írásos tájékoztatott beleegyezést kapott a beiratkozás előtt.

A minta előkészítése

Vérmintákat vettünk minden anyától CMV antitestvizsgálatra a szülés utáni első héten; a kolosztrumot eltávolították; és az anyatejmintákat kéthetente vették a csecsemők szabadon engedéséig. Vér- és vizeletmintákat vettünk minden csecsemőtől a születés után 1 hétig a veleszületett CMV-fertőzések szűrésére; ezután kéthetente vér- és vizeletmintákat vettek a kibocsátásig; a kibocsátáskor újabb vérmintát vettek CMV antitest tesztelés céljából. Amikor a donortejet gyermekeknek adományozták, a donortej mintákat kéthetente vették a szűréshez. Azokban az esetekben, amikor a csecsemők vértranszfúziót kaptak, a vérkészítmény egy részét tesztelés céljából összegyűjtötték. Valamennyi transzfúzióban lévő vérkészítményt leukóval töltötték meg szűrőkkel. A kolosztrumot, az anyatejet, a donortejet, a transzfúzióhoz szükséges vérkészítményeket, a szérum- és vizeletmintákat felhasználás előtt -20 ° C-on tárolták.

Klinikai adatgyűjtés

Az olyan klinikai eredményeket, mint az élelmiszer-intolerancia, a hasi feszültség, a hepatomegalia, a petechia, az apnoe és a hipotenzió, a megfelelő kezelőorvos értékelte és rögzítette. A csecsemőktől minden héten vérmintákat vettek laboratóriumi rendellenességek, például neutropenia, thrombocytopenia, megemelkedett májenzimszintek és hyperbilirubinemia szűrésére. A kezelőorvosokat vakon vizsgálták az anyatejben végzett PCR-vizsgálatok eredményei és az anyai CMV szerológiai állapota miatt.

szerológia

Az anti-CMV immunglobulin (Ig) G és IgM antitesteket enzim immunvizsgálatok segítségével azonosítottuk (Denka Seiken, Tokió, Japán).

Kvantitatív valós idejű PCR elemzés

A QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával 200 μl csecsemőszérumból, vérkészítményből és frakcionálatlan anyatejből DNS-t extraháltunk, és 100 μl desztillált vízben eluáltunk. A QIAamp Viral RNS kit (Qiagen) felhasználásával 140 μl csecsemő vizeletmintából DNS-t extraháltunk, és 100 μl desztillált vízben eluáltuk.

Valós idejű PCR-t hajtottunk végre minden kivont DNS-mintáról a CMV DNS kópiaszámának számszerűsítése céljából. Az ebben a vizsgálatban használt PCR primereket és próbákat úgy terveztük meg, hogy a közvetlen korai CMV gént célozzák meg. 13 valós idejű PCR-t hajtottunk végre a TaqMan PCR Kit és a Model 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével a fent leírtak szerint. 9., 14., 15. A vizsgálat kimutatási határa 100 példány ml-1 volt .

UL144 gén amplifikáció és DNS szekvenálás

Amikor CMV DNS-t detektáltak vizelet- vagy szérummintákból, UL144 génszekvenálást végeztek. Az UL144 gént egymásba ágyazott PCR-rel amplifikáltuk. A következő PCR-primereket használtuk: külső előreindító (5'-TCGTATTACAAACCGCGGAGAGGAT-3 '), külső fordított primer (5'-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3'), belső előreindító (5'-CTTCCGGTAGGCATGAA-3 ') és belső fordított -GACTTATG -3 '). A PCR termékeket közvetlenül szekvenáltuk a BigDye Terminator Cycle Sequence Kit és az ABI PRISM 3100 Automated Sequencer (Applied Biosystems) segítségével.

Statisztikai elemzések

A kategorikus változók közötti különbségeket a test 2 teszt segítségével elemeztük; Az átlagértékek különbségeit Mann-Whitney U-teszttel elemeztük. A statisztikai elemzéseket a Statview 5.0 kezeléssel (SAS Institute, Berkeley, CA, USA) rendeltetésszerűen végeztük.

az eredmény

A vizsgálati időszak alatt 25 anya és 27 gyermekük (két ikercsoport) teljesítette a belépési kritériumokat. A medián terhességi életkor 26,4 hét volt (23, 7 és 32, 6 hét között), az átlagos születési súly pedig 802 g volt (512–1108 g). A medián megfigyelési idő 99 nap volt (70 és 154 nap közötti tartomány). Összesen 14 gyermek, fiú és 13 lány volt. Hét gyermeket hüvelyi úton, 20-at császármetszéssel szültek.

Az 1. ábra bemutatja a CMV anyák seroprevalenciáját kohorszunkban és a CMV átvitelének gyakoriságát. A 25 anyából összesen 21 (84%) volt szeropozitív a CMV-re. CMV DNS-t mutattak ki az anyatejben minden szeropozitív anyánál. A vizsgálati időszak alatt a szeronegatív anyák anyatejében CMV DNS-t nem detektáltak. A 2. ábra a CMV DNS kópiaszámát mutatja az anyatejben, valós idejű PCR-rel elemezve. A 20 kolosztrummintából összesen 7 (35%) tartalmaz CMV DNS-t. 2 héttel a szülés után a CMV DNS kópiák száma nőtt, és elérte a csúcsot a szülés utáni 4-6 hétben. A CMV DNS felszabadulása az anyatejben a szülés után 8 hétig folytatódott. 10 héttel a szülés után csak egy mintában detektáltak CMV DNS-t; 12 héttel a szülés után nem detektáltak CMV DNS-t az anyatejben.

Anyai szeroprevalencia és citomegalovírus (CMV) átvitel. Az anyák szeroprevalenciáját, a CMV DNS-laktációs sebességét és a CMV átviteli sebességét mutatjuk be. A CMV átvitel csak egy betegnél fordult elő.

Teljes méretű kép

A citomegalovírus (CMV) DNS kópiaszámának kinetikája az anyatejben. Az összes kolosztrummintában megadják az átlagos CMV DNS kópiaszámokat, valamint 21 CMV szeropozitív anya anyatejét. A CMV DNS kópiaszámát valós idejű PCR-rel mértük. A kolosztrum DNS kópiaszámát 0 hetes korban adják meg. Az átlagos CMV DNS kópiaszámokat fekete pontok jelzik; a hibasávok 95% -os megbízhatósági intervallumokat jeleznek. A szaggatott vonal mutatja a teszt kimutatási határát.

Teljes méretű kép

A 27 gyermekből mind a 15-ben legalább egyszer donortejet etettek. A donortejet egy beteg adta egy donor. Összesen 23 donor tejmintán végeztünk PCR-t, a CMV DNS-t 23-ból 13-ban (57%) detektáltuk. Ennek eredményeként 15 csecsemőből 10 (67%) CMV DNS-pozitív donortejet kapott. Az egyik gyermeknek, akinek az anyja szeronegatív volt, donortejet etettek, de a gyermek által kapott donortejben CMV DNS-t nem detektáltak.

27 gyermekből összesen 20-nak volt szüksége vörösvérsejt-transzfúzióra. A vörösvérsejt transzfúziók medián száma 2 volt (1-8-szoros tartomány). 27 gyermekből egynek vérlemezke-transzfúzióra volt szüksége. A transzfúzióhoz használt vérminták egyikében sem találtak CMV DNS-t.

A vizsgált populációban az anti-CMV IgM negatív volt a kibocsátás során, egy gyermek kivételével. A 21 csecsemő közül, akiknek anyja pozitív anti-CMV IgG-tesztet mutatott, 4 gyermek pozitív volt CMV IgG-re a kisülés után, de 17 negatív volt. 4 pozitív csecsemőnél vérmintákat vettek CMV antitestvizsgálatra átlagosan 77 nappal (70 és 84 nap között) a szülés után, lényegesen korábban, mint 17 negatív csecsemőben, akiknek vérmintája átlagosan 98 nap volt. (70 és 154 nap közötti tartomány) (P = 0,02). Ezek az adatok arra utalnak, hogy négy pozitív gyermek megtartotta passzívan továbbított anti-CMV IgG-t anyjuktól. Mind az öt gyermek, akinek az anyja negatív volt az anti-CMV IgG szempontjából, negatív anti-CMV IgG volt a kibocsátáskor.

vita

Diosi és mtsai. 17 először izolált CMV-t 1967-ben az anyatejből. Későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy a frakcionált tejben a virolaktáció aránya 9 és 32% között mozog. 18, 19, 20 Nemrégiben az anyai CMV-k reaktivációját laktáció alatt PCR-rel elemezték. 9, 10, 11, 12, 21, 22, 23 Ezekben a vizsgálatokban a CMV DNS-laktáció aránya 87,5–97,3% között mozgott. Vizsgálatunk során minden szeropozitív anyának CMV DNS-je volt az anyatejben. Ezek a megállapítások alátámasztják azt az elképzelést, hogy a CMV reaktiváció a laktáció alatt a legtöbb szeropozitív anyában megtörténik. Valós idejű PCR-rel számszerűsítettük az anyatejben lévő CMV DNS kópiaszámát, és leírtuk a CMV reaktiváció hosszanti kinetikáját. Korábbi vizsgálatunkban, amelyben a populáció szignifikánsan idősebb volt, mint ebben a vizsgálatban (átlagos terhességi életkor, 31 vs. 26 hét; P 9 2 héttel a szülés után, a CMV DNS-t magas szinten mutatták ki az anyatejben, és elérte a maximum 4-6 hetet a szülés után ebben a vizsgálatban a CMV reaktivációjának kinetikája közel azonos volt, ami arra utal, hogy az anyai CMV reaktivációja független a terhesség korától a szüléskor, és hogy a CMV reaktiváció a szoptatás alatt 1-2 héttel a szülés után kezdődik és 10 héttel a szülés után véget ér.

CMV DNS-t detektáltunk egy gyermekben, aki CMV-pozitív tejet kapott. A transzmissziós út megerősítéséhez molekuláris epidemiológiai vizsgálatot végeztünk. Az emberi CMV variáns törzsének leggyakoribb génje a B glikoprotein. 24 Tavaly azonban jelentős figyelmet fordítottak a CMV UL144 génre. Az UL144 a herpeszvírus belépési mediátorának homológját kódolja, amely a tumor nekrózis faktor 1 receptor szupercsalád tagja, és genetikai marker lehet az emberi CMV patogenezisében. 25 Lurain és mtsai. A 26. számolt be arról, hogy az UL144 szignifikáns törzs-specifikus szekvencia-variabilitással rendelkezik, ezért a törzs azonosítására összpontosítottuk. Az anya anyatejében azonosított összes szekvencia pontosan megegyezett a csecsemő vizeletmintáinak szekvenciáival. A szülés utáni CMV úgy érhető el, hogy a méhnyakot kiválasztják a szülőcsatornában, a transzfúziós vért és az anyatejet. Egy fertőzött gyermekünk császármetszéssel született, de kétszer vérátömlesztést kapott. Valamennyi vérkészítményt leukodeplatálták, így nagyrészt kiküszöbölte a CMV-t; valójában CMV DNS-t egyik vérmintában sem mutattak ki. Az anya-gyermek pár molekuláris jellemzésével megerősítettük, hogy a CMV átvitel anyatejjel történt.

A pasztörizálás inaktiválhatja a CMV-t az anyatejben. 20, 32 Hamprecht és mtsai. A 34. cikk három módszerrel számolt be az anyatej CMV fertőzőképességének csökkenéséről: fagyasztás és felolvasztás, tartó pasztőrözés és rövid ideig tartó, 5 másodpercig tartó hőkezelés 72 ° C-on. A CMV-fertőzőséget a tej fagyasztásával 10 mintából csak 1-ben szüntették meg, de teljesen Holder pasztőrözéssel és rövid távú melegítéssel kiküszöbölhető. A fűtési folyamatoknak azonban számos problémája van: a fűtés negatívan befolyásolhatja az anyatej minőségét, a folyamatok speciális felszerelést igényelnek, az anyatej előkészítése időigényes a tulajdonos pasztőrözésével és a műanyag palackokból eluálódó veszélyes anyagok lehetőségével. a fűtés nem zárható ki. Kurath és mtsai. 7 nem javasol általános megközelítést sem az anyatej elkerülésével, sem pasztörizálásával, amely alacsony tüneti tüneteken alapul, még a magas kockázatú koraszülötteknél is. Ehelyett a súlyos fertőzés megelőzésére a koraszülöttek egészségi állapota alapján CMV IgG-pozitív anyák esetében algoritmust javasoltak koraszülött csecsemők számára. 36

Összegzésképpen elmondható, hogy a CMV DNS anyatejben való kinetikai kinetikája szerint a CMV reaktivációja a szülés után 1-2 héttel kezdődik és a szülés után 10 héttel ér véget. Még a nagyon koraszülött csecsemőknél is alacsony volt a CMV-átvitel aránya, és a CMV-t továbbító gyermekek közül egyiknek sem alakultak ki súlyos tünetek főleg fagyasztott tejüzemekben. A fagyasztott és felengedett anyatej csökkentheti a vertikális CMV-fertőzés és a súlyos betegségek arányát, bár ritka esetekben ez a módszer nem képes teljesen megakadályozni a súlyos szepszis-szerű tüneteket és a nekrotizáló enterocolitist. 5.