tumorsejtekben

  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • Az oxigénhiány indukálja az LC3 feldolgozását
  • A hipoxia autofagosómák kialakulását indukálja
  • A hipoxia által kiváltott tumorsejt-autofágia független a HIF-1-től és annak célgéntermékeitől, a BNIP3-tól és a BNIP3L-től.
  • Az AMPK aktivitása elősegíti a hipoxia által kiváltott autofágia kialakulását
  • Az ATG5 elengedhetetlen a hipoxia okozta autofágia szempontjából
  • Az autofághiányos MEF-ek inkább tumorigének in vivo
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • Sejtvonalak és vegyszerek
  • plazmidok
  • Western blottolás
  • immunfluoreszcencia
  • AO festés
  • Oxigénfogyasztás mérése
  • 2DG felvétel
  • Transzmissziós elektronmikroszkópia
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További képek
  • További képmondák
  • szójegyzék

absztrakt

A fő

Az alacsony oxigén stressz számos patofiziológiai állapot, köztük a rák közös jellemzője. A szolid tumorok hipoxiája a sugárterápiával szembeni rezisztenciával és a rossz prognózissal jár. 1 A tumor hypoxia egyik következménye a sejthalál lehet. 2, 3 Számos csoport kimutatta azonban, hogy a tumorsejtek általában jól alkalmazkodnak az enyhe hipoxiához, feltéve, hogy nem jelentkeznek további stresszek, például glükózmegvonás. A szélsőséges hipoxia azonban hipoxiától indukálható faktor-1 (HIF-1) -függő folyamaton keresztül képes aktiválni az apoptózist. 4, 5, 6 Érdekes módon a BNIP3 HIF-1 célgén erőltetett normoxikus expressziója (Bcl-2 adenovírus E1a, tizenkilenc kilodalton interakcióban lévő fehérje 3) mitokondriális diszfunkciót és sejthalált okozott néhány, de nem az összes kísérleti környezetben. 5, 7, 8 A legújabb vizsgálatokat a BNIP3-ban is bevonták ceramid és arzén által kiváltott autofágia 9, 10 és egy ischaemia/reperfúziós sejthalál modellben. 11.

Az 5'-AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) az energia homeosztázis egyik fő szabályozója. 12 Az AMP/ATP arány növekedése az AMPK aktiválásához vezet, amely viszont támogatja az energiatermelő katabolikus folyamatokat és enyhíti az energiaigényes anabolikus folyamatokat. Ennek a hatásnak az egyik legfőbb útja a tuberous sclerosis complex (TSC) és a rapamicin emlős célpontja (mTOR). A hipoxia az AMPK erős ingere, amely független a HIF aktivitásától, és előfordulhat még az intracelluláris ATP szint kimutatható csökkenése előtt. 15, 16 A legfrissebb jelentések azt sugallják, hogy az AMPK szerepe a normál glikolitikus és oxidatív anyagcsere szabályozásán túlmenően a sejtenergia homeosztázisát is szabályozhatja az intracelluláris komponensek autofág újrafeldolgozása révén. 17, 18

A makroautofágia (a továbbiakban autofágia) egy katabolikus folyamat, amely magában foglalja a sejtes makromolekulák, sőt az egész organellumok szabályozott emésztését. 19 Az autofág során a citoplazma egy része kettős membránú vezikulákban elkülönül, amelyeket autofagoszómáknak neveznek, amelyek aztán vakuolokkal vagy lizoszómákkal olvadnak össze, ahol a tartalom vagy a rakomány hidrolízise történik. Az autofágia az élesztőben először a túlélési mechanizmusként volt azonosítva, amikor a tápanyagok csökkentek. 21 Később kiderült, hogy az autofágia elengedhetetlen a metazoanok különböző fiziológiai folyamataihoz, például a termékeny testek fejlődéséhez a Dictyostelium discoideumban, a növényi anyagcsere kulcsfontosságú folyamataihoz, a dauer-képződéshez a Caenorhabditis elegans-ban, valamint az embrionális fejlődéshez és az újszülöttek túléléséhez emlősöknél.

Az autofágok előfordulását szilárd daganatokban dokumentálták; Nem világos azonban, hogy ez a folyamat hogyan járul hozzá a tumorbiológiához. A Beclin-1, az élesztő autofágia ATG6 gén emlős homológja, haploinnal elégséges tumorszuppresszor. Megállapították, hogy a BECN1 gén heterozigóta deléciója csökkenti az autofágiát, növeli a spontán rosszindulatú daganatok előfordulását és felgyorsítja a HBV által kiváltott neoplazia kialakulását. 23 A beclin-1 méhen kívüli újrafel expressziója az emberi emlőrák sejtjeiben fokozta az autofágia és csökkent a tumorigenicitást. Kimutatták, hogy az autofágia védi az emlőssejteket a metabolikus stressztől: például IL-3-függő vérképző sejtekben, valamint immortalizált vese- és emlősejtekben. 26, 27, 28 Van azonban bizonyíték arra is, hogy az autofágia elnyomhatja a tumorigenicitást egy programozott sejthalál megindításával. 29, 30

A daganatos sejtekben autofág mechanizmusokat összefogó és aktiváló jelátviteli kaszkádok rosszul vannak megértve. Ebben a tanulmányban megmutattuk, hogy a hipoxia képes az autofágia aktiválására tápanyagok és növekedési faktorok jelenlétében is az apoptózisra képes sejtekben. Ezenkívül ez az autofág válasz független a HIF szignalizációtól, ATG5 expressziót igényel, és az AMPK aktivitása elősegíti. Az autofághiányos (MEF) hiányos egér embrionális fibroblasztok csökkent mitokondriális aktivitást, fokozott glükózfelvételt és kissé gyorsabb növekedést mutattak in vivo. Javasoljuk, hogy az autofághiányos sejtek ezen metabolikus tulajdonságai hozzájáruljanak megnövekedett tumorigenicitásukhoz.

az eredmény

Az oxigénhiány indukálja az LC3 feldolgozását

AVO termelés anoxia alatt. a ) Az AO-festett SiHa minták reprezentatív grafikonjai. A sejteket 21 vagy ** P-ben inkubáltuk

Ennek az elemzésnek a BNIP3 és BNIP3L kiterjesztésére RKO sejteket használtunk a funkcióelemzés teljes elvesztésének elvégzésére. Ebben az autofágikusan kompetens sejtvonalban, BNIP3 expresszió nélkül, a BNIP3L leütése egy olyan sejtvonalat eredményezne, amely hiányos mindkét szorosan kapcsolódó fehérjében. Erre a célra az RKO sejteket stabilan transzfektáltuk hülyeség (kontroll) vagy BNIP3L ellen irányított shRNS-sel. A gyógyszerrezisztens klónok telepeit egyesítettük, és 24 órán át kezeletlenül vagy hipoxiának tettük ki őket. Katepszin inhibitorokat adtak hozzá, amelyek segítenek feltárni az LC3 forgalom finom különbségeit. Kivonatokat gyűjtöttünk a Western blot-hoz (3c. Ábra). Megállapítottuk, hogy az shBNIP3L-t tartalmazó RKO sejtek 90% -kal csökkent BNIP3L expressziót mutatnak a BNIP3 expresszió mellett. Ezeket a készleteket ezután tesztelték, és jó AVO termelést mutattak. Sem a BNIP3, sem a BNIP3L expresszióra nincs szükség (vagy elegendő) az autofágok aktiválására a hipoxiára reagálva (3c. Ábra, középső panel).

Feltételeztük, hogy a BNIP3 expressziójának újrakezdése ebben a sejtvonalban megváltoztathatja annak hipoxiára adott metabolikus válaszát a mitokondriális szám/funkció megváltozása révén. A mitokondriális oxigénfogyasztás szempontjából a BNIP3 vagy BNIP3L leütéses sejteket túlexpresszáló sejtek elemzése kimutatta, hogy a PDK1 által közvetített hipoxiában nem volt különbség a mitokondriális aktivitás korábban jelzett csökkenésében (3c. Ábra, jobb oldali panel). 37

A legújabb jelentések szerint a retikulum endoplazmatikus stressz (ER stressz; lebomlott fehérje válasz (UPR)) aktiválhatja az autofágia kialakulását. 38 A súlyos oxigénhiány az UPR egyik fő ingere; ezért megvizsgáltuk, hogy ennek a folyamatnak a csillapítása befolyásolhatja-e a hipoxia által kiváltott autofágiát. A MeFalizált vad típusú MEF-eket, az ir-1-t és -/- és a PERK -/--t hipoxiának tették ki 24 vagy 48 órán keresztül, ami elegendő az ER/UPR kiváltásához. 39 LC3-feldolgozást detektáltunk minden mintában, tekintet nélkül Írország-1a és PERK állapotukra (S3. Ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy a súlyos hipoxia által kiváltott autofágia nem függ az UPR-re adott teljes stresszválasztól.

Az AMPK aktivitása elősegíti a hipoxia által kiváltott autofágia kialakulását

Az AMPK az energia homeosztázis fő szabályozója. 12 Számos stressz aktiválja, beleértve a hipoxiát is. Ezért megvizsgáltuk az AMPK lehetséges szerepét a hipoxia által kiváltott autofágia során, vad típusú vagy AMPK α1 és α2 knockout embriókból származó immortalizált MEF-ek felhasználásával. Az a-alegységek, amelyek AMPK katalitikus aktivitást biztosítanak, hiányoztak ezekben a knockout sejtvonalakban, Western-blot meghatározással (4a. Ábra). Ahogy az várható volt, az AMPK út dózisfüggő aktiválása és az acetil-CoA karboxiláz foszforilezése hipoxiás stressz alatt csak a vad típusú MEF-ben fordult elő (4a. Ábra). A vad típusú sejtek 3 órán át tartó inkubálása az EBSS-ben az ACC1/2 enyhe foszforilációját is okozta. A vad típusú sejtek 0, 5, ill.

Annak eldöntésére, hogy ezeknek az ATG5 által szabályozott folyamatoknak volt-e sejtes hatása, vad típusú sejteket és kiütéses ATG5 sejteket teszteltünk a hatékonyság mérsékelt vagy súlyos hipoxiában. Az egysejtű szuszpenziókat 10 napig 2 vagy 0,5% oxigénnel tenyésztettük, és a túlélő telepeket megszámoltuk. A vad típusú sejtek szignifikáns csökkenést mutattak a hipoxia plating hatékonyságában a knockout sejtekhez képest (5c. Ábra, bal oldali panel). A súlyos hipoxiára adott válasz tesztelésére egysejtű szuszpenziókat helyeztek a lemezekre és oxigénnek tették ki.

Az ATG5 elvesztése kissé növeli a modelldaganatok növekedését. a ) A halhatatlanná tett vad típusú (WT) MEF-et és ATG5-kiütést (KO) Ras-szal transzformáltuk, és szubkután injekcióztuk a nőstény meztelen egerek szárnyaiba. A daganat méretét 3 naponta mértük féknyergekkel. ( b ) Ras-transzformált MEF tumor növekedési görbék, amelyekben az ATG5 expresszióját a doxiciklin elnyomja. Doxiciklint adtak az ivóvízhez. c ) Az in vivo LC3 feldolgozásához ATG5 szükséges. Ezeknek a genotípusoknak a tumorait izoláltuk, és frissen készített fehérje-lizátumokat használtunk az ATG5 és LC3 immundetektálására. Az LC3 membránhoz kötött formáját (törött nyilak) csak az ATG5-et expresszáló tumorlizátumokban detektálják.

Teljes méretű kép

vita

Az autofágia aktiválásának képességéről egyre több (pat) fiziológiai állapot és kémiai vegyület ismert. A genetikai megközelítések segítettek felismerni az autofág készülék jelentőségét a normális fejlődés során, és felkeltették az érdeklődést a dereguláció biológiai következményei iránt a betegségekben, beleértve a rákot is. A hipoxia, a tápanyaghiány és a növekedési faktor kimerülése olyan stresszt jelentenek a tumor mikrokörnyezetében, amely hatékonyan aktiválhatja az autofágia működését. Eredményeink azt mutatják, hogy az oxigénhiány további stressz, például glükózmegvonás vagy szérum megvonás hiányában autofágiát indukálhat az emberi tumorsejtekben.

Eredményeink rámutattak az AMPK jelátviteli út pozitív szerepére az autofágia indukciójában hipoxia alatt. Egyre több bizonyíték támasztja alá az AMPK konzervált szerepét más ingerek által kiváltott autofágiában, például az élesztő stacionárius fázisába való belépés és a p53-aktiváló vagy Ca 2+ -mobilizáló szerekkel történő kezelés. Az AMPK aktiválása a hipoxiának való kitettség után ismert, a HIF-től függetlenül. 15, 16 Ezenkívül az a megállapítás, hogy a TSC2 null MEF-ek rezisztensek a hipoxia által kiváltott autofágia ellen is, arra utal, hogy az AMPK a TSC2 előtt és az mTOR-on keresztül dolgozik a folyamat szabályozásában. 41 Az a tény, hogy az AMPK α nullizigóta MEF-ek nem voltak teljes mértékben rezisztensek az autofágia ellen, felveti annak lehetőségét, hogy további autópályák konvergáljanak a mag autofág gépeinél.

Anyagok és metódusok

Sejtvonalak és vegyszerek

A HIF-1 α kiesés és az egyező vad típusú SV40-ben megörökített MEF-ek R Johnson (Kaliforniai Egyetem, San Diego) ajándékai voltak. 44 AMPK kiütéses MEF-et írtak le másutt. 15 A TSC2 +/+ p53 -/- és a TSC2 -/- p53 -/- halhatatlan MEF-eket DJ Kwiatkowski (Harvard, Boston) ajándékozta. SiHa méhnyak- és RKO vastagbélrák sejteket az ATCC-től vásároltunk. A vese tiszta sejtes karcinóma 786-0 és 786-0/VHL sejtek az A Giaccia (Stanfordi Egyetem) ajándékai voltak. A BH3 fehérjéket túlexpresszáló HeLa sejt klónokat máshol írták le. 5 Ire-1 és PERK knockout sejt volt A Koong (Stanfordi Egyetem) ajándéka. Az ATG5 kiütés, az indukálható ATG5 MEF és az LC3 antitest az N Mizushima (Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem) kedves ajándéka volt. Valamennyi sejtvonalat DMEM-ben tenyésztettük 10% marha-magzati szérummal és 20 mM HEPES-sel. A tumorigén klónokat immortalizált ATG5 vad típusú és knockout MEF-ekből nyertük, stabil transzfekcióval onkogén Ha-ras-kódoló expressziós plazmiddal.

Hypoxia kezelésekhez a sejteket nedvesített hipoxiás munkaállomáson (Invivo 2, Ruskinn Inc., Cincinnati, OH, USA) vagy anaerob munkaállomáson inkubáltuk palládium katalizátorral (Sheldon Corp., Cornelius, OR, USA). A végső oxigénkoncentrációt Clark típusú polarográfiai elektróddal (Animas, Frazer, PA, USA) igazoltuk. A lizoszomális degradáció gátlásával járó kísérletek során a 12 üreges tenyészlemezekre terített sejteket 21 vagy 5, 37

Western blottolás

A sejteket RIPA pufferben lizáltuk, ultrahanggal kezeltük, és a fehérje koncentrációkat a BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) számította ki. A fehérjéket (10–20 μg) Tris-Tricine gélekben szétválasztottuk és Hybond-P membránokra vezettük (Amersham, Piscataway, NJ, USA). Az alkalmazott antitestek egér anti-HIF-1 α (BD Transduction Laboratories, San Diego, CA, USA), anti-LC3 nyúl poliklonális (MBL International, Woburn, MA, USA), egér anti-beclin-1 (BD Transduction Laboratories) voltak. ), egér anti-ATG5 (Abnova), csirke anti-ATG5 (Abcam, Cambridge, MA, USA), egér tubulint gátló (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA), nyúl anti-Glut1 (Neomarkers, Freemont, CA, USA), egér anti-GAPDH (Research Diagnostics, Concord, MA, USA) és kecske anti-LDH A (Santa Cruz Biotechnology). Nyúl anti-AMPK, anti-ACC és anti-foszfo-ACC antitesteket a Cell Signaling-től (Danvers, MA, USA) szereztünk be. A BNIP3 és BNIP3L elleni nyúl poliklonális antitesteket máshol írták le. 5 Másodlagos alkalikus foszfatázzal konjugált antitest a Vector Laboratories Inc.-től származik. (Burlingame, Kalifornia, USA). Az immunblot szignálokat ECF szubsztráttal (Amersham) vizualizáltuk, és Storm Imager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) segítségével detektáltuk.

immunfluoreszcencia

A nyolckamrás tárgylemezekre (Nunc) borított sejteket GFP-LC3 expressziós plazmiddal transzfektáltuk Lipofectamine2000 alkalmazásával (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A sejteket 4% paraformaldehiddel rögzítettük, és a sejtmagokat 10 μg/ml Hoechst 33342-vel ellenfestettük. A sejteket Spot RT Slider CCD digitális kamerával felszerelt Nikon Eclipse E800 mikroszkópon (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA) tettük láthatóvá.

AO festés

Az intracelluláris savas rekeszekben bekövetkezett változásokat a Klionsky 20 szerint határoztuk meg, kisebb módosításokkal. Röviden, a kezelést követően a sejteket 15 percig 2,5 μg/ml AO-val festettük, tripszineztük, újraszuszpendáltuk PBS-ben, és azonnal elemeztük egy FACSCalibur áramlási citométerben (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). A zöld és a vörös fluoreszcenciákat lineáris skálán mértük, az FL1 és FL3 csatornákat használva.

Oxigénfogyasztás mérése

A 100 mm-es szövettenyésztő lemezekre borított sejteket 0,5 vagy 6 sejt/ml koncentrációban inkubáltuk, és az oxigénfogyasztást Oxytherm elektródaegységgel (Hansatech, Norfolk, Egyesült Királyság) mértük.

2DG felvétel

2- [1,2,3-H (N)] - Dezoxi-D-glükózt a PerkinElmer-től (Boston, MA, USA) vásároltunk. A hatlyukú lemezeken lévő sejteket 37 ° C-on inkubáltuk 21% -os hőmérsékleten, vagy további 3 percig 3H-jelölt 2DG-t adtunk hozzá. A sejteket ezután kétszer mossuk hideg PBS-sel, és 0,2 M NaOH/0,1% SDS-sel lizáljuk. A radioaktivitást folyékony szcintillációs számlálóval mértük. Azonos mintasorozatokat RIPA pufferben lizáltuk a fehérje koncentrációk mérésére.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A sejtrétegeket 2% glutáraldehid pufferban rögzítettük. A metszeteket uranil-acetáttal és ólom-citráttal festettük, és Jeoll230 transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk.