klinikai

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az alkohollal táplált rhesusmajmok ultrahangvizsgálata és szövettani jelei
  • Az alkohollal táplált tenyésztett rhesusmajmok plazmajellemzői
  • A máj gén expressziójának változásai alkohollal táplált rhesus majmokban máj steatosisban és májfibrózisban
  • vita
  • mód
  • Állatok és alkohol beadása
  • Vérgyűjtés és kémiai plazmatesztek
  • Ultrahangvizsgálat és májbiopsziás minták
  • Szövettani elemzés
  • A máj gén expressziójának mikroarray elemzése
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • Hozzászólások

elemeket

  • Alkoholos májbetegség
  • Metabolikus szindróma

absztrakt

Az alkoholos májbetegség (ALD) súlyos közegészségügyi probléma, amely magas egészségügyi és gazdasági terhet jelent. Az ALD etiológiája még nem teljesen ismert. Az ALD gyógyszerek és terápiák kifejlesztését akadályozza az emberi ALD szövettani és metabolikus tulajdonságait megismételni képes megfelelő állatmodellek hiánya. Itt jellemezzük a máj steatosis és az alkohol okozta májfibrózis makákó majommodelljét, amely kompatibilis a biokémia és a patológia klinikai progressziójával ALD-ben szenvedőknél. A máj gén expressziójának mikroszkópos elemzését végeztük az ALD progresszió potenciális molekuláris aláírásainak azonosítására. Kivágott modellünkben kimutattuk a máj steatosishoz kapcsolódó májgének (CPT1A, FASN, LEPR, RXRA, IGFBP1, PPARGC1A és SLC2A4) expressziójának szabályozását, valamint e gének (CYP7A1, HMGCR, GCK) csökkenését . és a PNPLA3) és a májrákkal kapcsolatos májgénexpresszió (E2F1, OPCML, FZD7, IGFBP1 és LEF1) felszabályozása. Eredményeink azt mutatják, hogy ez az ALD modell tükrözi a klinikai betegségek progresszióját és a máj gének expresszióját az emberekben. Ezek a megállapítások hasznosak lesznek az ALD patogenezisének megértésének javításához, és hasznosak lesznek új terápiás megközelítések és farmakológiai szerek kifejlesztésében az ALD kezelésére.

Az alkohol okozta krónikus májbetegség a globális morbiditás és halálozás egyik fő oka 1. A fejlett országokban a krónikus májbetegségek akár 66% -át is alkoholfogyasztás okozza, és az alkoholfogyasztás az összes májbetegség halálának csaknem a felét okozza 2. Ezért az alkoholos májbetegség (ALD) súlyos közegészségügyi probléma, amely magas orvosi és gazdasági terhet jelent. Az alkohol okozta krónikus májbetegség progresszív betegség, több szövettani stádiummal: zsírmáj (steatosis), alkoholos hepatitis, krónikus hepatitis fibrózissal vagy májcirrhosissal és hepatocelluláris carcinoma 3. Az ALD etiológiája azonban nem teljesen ismert. Más májbetegségektől, például a vírusos hepatitistől eltérően az ALD-kezelés az utóbbi évtizedekben nem javult jelentősen2. Jelenleg nincs hatékony, széles körben elfogadott terápia az ALD 4, 5 kezelésére. A gyógyszerfejlesztést és az ALD-terápiákat akadályozza az emberi ALD2 szövettani és metabolikus tulajdonságait megismétlő megfelelő állatmodellek hiánya.

A génexpressziós profilozás meghatározza az ALD-ben kiemelkedően expresszált útvonalakat és új molekuláris célpontokat, és az ALD 15-ben szenvedő betegek májbiopsziájában jelentős változásokat állapítottak meg a csomópont génexpressziójában. Az ALD patogenezisével kapcsolatos ismereteink bővítése értékes információkkal szolgál az ALD megelőzéséről és kezelési stratégiáiról. Ezért a gyógyszerjelöltek vagy terápiák humán ALD hatásosságának és biztonságosságának szisztematikus preklinikai értékelésének lehetővé tétele érdekében fontos, hogy a rhesus makákó ALD modellek tükrözzék mind a betegség progresszióját, mind a génexpressziót. Azonban a krónikus alkoholos májkárosodás gén expresszióját rhesus majmokban nem vizsgálták. Ebben a tanulmányban a máj steatosis, alkoholos hepatitis és májfibrózisos makákó metszési modellek kifejlesztését írtuk le. Megállapítottuk az ALD biokémiájának és patológiájának klinikai fejlődését is ezekben az állatmodellekben. Ezen túlmenően mRNS-elemzéseket hajtottak végre egy sor állati májszövet alapján, hogy azonosítsák a betegség progressziójának lehetséges molekuláris aláírásait, és összehasonlítsák a génexpressziós mintákat az emberi ALD-mintákkal.

az eredmény

Tizenhat rhesus majmot etettek alkoholos oldattal 3 évig. Az átlagos napi alkoholfogyasztás három éves periódus alatt napi 9,6 g/kg volt (tartomány: 6, 2–12, 1 g/kg/nap), vagy a teljes napi kalóriabevitel 24% -a (tartomány: 16–42%) ). Három kontrollállatot tartottak ugyanazon étrenden, de alkohol nélkül, és a táplálékfelvételt naponta ellenőrizték.

Az alkohollal táplált rhesusmajmok ultrahangvizsgálata és szövettani jelei

A rhesusmajmokat 3 évig alkoholos étrenden tartották. Az alkohollal táplált állatok ultrahang és szövettani értékelések alapján mutatták ki az ALD valamennyi szakaszát. Az alkohollal táplált rhesus majmok májának ultrahangvizsgálata egyértelmű máj steatosist és májfibrózist mutatott, ellentétben az alkoholmentes kontrollokkal (1. ábra). A H & E-vel festett májszakaszok szövettani vizsgálata enyhe, mérsékelt és súlyos máj steatosis kialakulását tárta fel nekrotikus változásokkal az alkohollal táplált rhesus makákókban (2. ábra). A kontroll állatokkal ellentétben az alkohollal táplált rhesus majmok májszakaszai steatosist mutattak ki, beleértve a hepatocelluláris vakuolizációt, valamint a makro- és mikro-vezikuláris lipidek felhalmozódását a máj hepatocytáiban (2c-h ábra); Gyulladást és ballon degenerációt is megfigyeltek (2h ábra). Ezenkívül a Massonnal festett májszakaszok szövettani vizsgálata májfibrózist mutatott az alkohollal táplált rhesus majmokban (3. ábra). Egy-egy majom a steatosis és a steatohepatitis különböző szakaszaiban haladt előre.

Normál májszövet ultrahang ( a ): a májkapszula elegáns és sima, lineáris, karcsú, erős visszhanggal rendelkezik, és a lineáris visszhangban egy kis rés van a hashártya falán. A máj parenchymás foltjai finomak és egyenletesen oszlanak el, az intrahepatikus csatornarendszer normális, a textúra tiszta és a jó hang jó. A máj zsírszövetének ultrahangja ( b, c ): a májkapszula elegáns és sima, a máj széle tompa. Az intrahepatikus visszhangok puhák és egyenetlen visszhangokkal szorosan szőttek. Az intrahepatikus erek jelentősen csökkentek. Májfibrózis szövet ultrahangvizsgálat ( d - f ): máj felszíne ( d ) szabálytalan és érdes, a máj parenchyma egyenetlen, szabálytalan nekrotikus lerakódásokkal ( e, f ).

Teljes méretű kép

Szövettani jellemzők a rhesus majommájban ( a, b ) és mérsékelt alkohollal táplált rhesus majmokban ( c, d ), mérsékelt e, f ) és súlyos ( g, h ) máj steatosis (hematoxilin és eozin) által. A máj májsejtjeiben nyilvánvaló hepatocelluláris vakuolizáció, valamint makro- és mikro-vezikuláris lipidek felhalmozódása figyelhető meg. A 2h. Ábrán látható nyíl a gyulladásos sejtek behatolását jelzi.

Teljes méretű kép

A normál rhesus makákómajmok szövettani jellemzői ( a, b ) és alkohol fibrózisos rhesus majmokban ( c - h ). A leülepedett kollagén rostokat sűrűn festik Masson trichromjával.

Teljes méretű kép

Az alkohollal táplált tenyésztett rhesusmajmok plazmajellemzői

A májszakaszok szövettani jellemzőinek értékelése alapján az alkohollal táplált állatokat a betegség stádiuma szerint kategorizálták súlyosságuk szerint: enyhe, közepes és súlyos máj steatosis és májfibrózis. A májfunkciókat és a vérszérum lipideket is elemezték, és a kontrollmajmok, az enyhe, közepes és súlyos máj steatosisban szenvedő majmok, valamint a fibrózisos majmok száma 3, 3, 3, 6 és 3 majom volt (4a-h. Ábra). A máj steatosisban és fibrózisban szenvedő állatok szérum AST-koncentrációja megemelkedett az enyhe, közepes és súlyos máj steatosis kontrollcsoportjához (P1) képest, és a májfibrózisos csoportok jelezték az ALD jelenlétét ezekben a majmokban (4d. Ábra). Eközben a májfibrózisos majmokban a plazma GGT-koncentrációja szignifikánsan megemelkedett (P

A szérum plazma kémiai paraméterei GGT, AST, ALT, AST/ALT, LDH, ALP, TG és CHOL esetében ( a - h ) normál májú (nyitott vonalú) rhesusmajmok és enyhe, közepes és súlyos májsteatózisú (szürke sávok) és májfibrózisos (fekete rúd) rhesusmajom-alkoholok esetében. Az oszlopok fölött található különféle feliratok jelentős eltéréseket jeleznek (P

* Jelentősen különbözik a májfibrózisos kontroll és alkohol rhesus makákómajmok között (P

Microarray elemzés a máj gén expressziójának változásáról a kontroll rhesus majmok és a máj steatosisban szenvedő rhesus majmok között ( a ) és a májfibrózis ( b ).

Teljes méretű kép

vita

Végül jellemeztük a rhesus majom steatosis, alkoholos hepatitis és májfibrózis majommodelljét, amely kompatibilis a biokémia, a patológia és a máj gén expressziójának klinikai progressziójával ALD-ben szenvedő embereknél. A májbetegség ezen embertelen prímás modellje hasznos lehet az ALD patogenezisének megértésének javításában, és új terápiás megközelítések és farmakológiai szerek kifejlesztésének kedvez az ALD kezelésében.

mód

Állatok és alkohol beadása

A Kunming Biomed International által biztosított tizenkilenc felnőtt rhesus majmot (9-12 éves korig) használtunk ebben a vizsgálatban. Valamennyi állatot külön-külön ketrecekben helyeztük el egy állatkamrában, 12 órás fénysűrűséggel: 12 óra. A hőmérsékletet 18 ° C és 26 ° C között, a páratartalmat 40% és 70% között tartjuk. Az állatokat naponta kétszer etették kereskedelmi majomeledellel (LabDiet, Harlan Laboratories, Inc., USA). A friss gyümölcsöket és zöldségeket naponta egyszer pótolták. Valamennyi eljárást a Kunming Biomed International Állatgondozásával és -használatával foglalkozó intézményi bizottság hagyta jóvá, és a laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának kézikönyvével összhangban hajtották végre. Az állatok létesítményét az International Care Care International Laboratory Association for the Assessment and Accreditation akkreditálta. A kísérleti csoport tizenhat rhesusmajmjának 24 órás hozzáférést biztosítottak cukorral édesített etanolos oldathoz. A kezdeti etanolkoncentráció 5% (v/v) volt, és az etanolkoncentráció minden héten 5% -kal nőtt, amíg el nem érte a 25% -os végkoncentrációt. Három kontrollállat alkohol helyett szabad vízhez jutott.

Vérgyűjtés és kémiai plazmatesztek

Vérmintákat vettünk ketamin-kloriddal (10 mg/kg; Shenyang Veterinary Pharmaceutical Inc., Kína) altatott szekcionált majmok combvénájából kb. A kémiai plazma vizsgálatokhoz a vérszérumot centrifugálással választották el 3000 fordulat/perc sebességgel. 15 percen belül. A következő kémiai plazma paramétereket Roche Modular P800 automatizált biokémiai analizátorral (Roche Diagnostics Ltd., Bázel, Svájc) mértük: γ-glutamil-transzpeptidáz (GGT, U/l), laktát-dehidrogenáz (LDH, U/l), aszpartát-aminotranszferáz (AST, U/l), alanin-aminotranszferáz (ALT, U/l), koleszterin (CHOL, mmol/l), triglicerid (TG, mmol/l). Az ADC CLIA 400 kemilumineszcencia-analizátort (Addcare, Yantai, Kína) a májfibrózis plazma-markerének mérésére használták, amelyek magukban foglalták a szérum hyaluronsavat (HA), laminint (LN), a kollagént IV (IV-C) és a prokollagént III N - terminális peptid (PIIINP).

Ultrahangvizsgálat és májbiopsziás minták

Kéthavonta ultrahangvizsgálatokat végeztek. Legalább 6 órás éheztetés után az állatokat ketamin-kloriddal (10 mg/kg) altattuk intramuszkuláris injekcióval (IM), és az alsó hasat és a sípcsontot leborotváltuk. Valamennyi állat máját transzkután módon készítettük Diasus ultrahangos rendszerrel (Dynamic Imaging Ltd., Livingston, Skócia, Egyesült Királyság), 5-10 MHz-es lineáris jelátalakítóval felszerelve, amely felméri a májbetegség kialakulását. A biopszia előtt a rhesusmajmokat IM-injekcióval altattuk ketamin-kloriddal (10 mg/kg) és morfin-hidrokloriddal (0,2 mg/kg, Northeast Pharmaceutical Group, Kína). A májbiopsziát ezután Bard Monopty biopsziás pisztollyal (Bard Biopsy Systems, Tempe, AZ, USA) végeztük, 16 mérőeszközű eldobható biopsziás tűvel és echogénen bevont heggyel (Bard Peripheral Vascular, Inc. USA), egyszerű perkután áthaladás a jobb alsó interkontinentális térben az ultrahangrendszer irányítása alatt. A májbiopsziás szövetmintát két egyenlő részre osztottuk. Az egyik részt formaldehidben rögzítettük a későbbi hisztopatológiai elemzéshez, a másik részt pedig folyékony nitrogénben fagyasztottuk be az ezt követő RNS-extrakcióhoz.

Szövettani elemzés

A biopsziával összegyűjtött májszövetmintákat gondosan rögzítettük 10% semleges pufferolt formalinban, és paraffinba ágyaztuk. A paraffinba ágyazott szöveteket levágtuk és hematoxilinnal és eozinnal (H&E), valamint Masson's Trichrome oldatokkal (Masson) festettük. A mintákat a zsír felhalmozódása és a kollagén lerakódása alapján osztályozták egy tapasztalt állatorvosi patológus korábbi tanulmánya szerint, akit elvakított az állatok kezelésének 13. Röviden, egy mérsékelt zsírpontszám (1. fokozat) azt jelezte, hogy a hepatociták 10-15% -a tartalmazott vakuolákat, az átlagos zsírpontszámot (2. fokozat) rendelték, amikor a vakuolizáció 15-30% -ra nőtt, és súlyos zsírpontszám (3. fokozat) volt. amikor a zsír eloszlott a hepatociták több mint 40% -ánál. A májfibrózist sűrű színű kollagén anyag jelenléte jellemezte.

A máj gén expressziójának mikroarray elemzése

A különböző biopsziás időpontokból származó májszövetekből származó teljes RNS-t a kísérleti elrendezés szerint az RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) segítségével extraháltuk. Az RNS minőségét agaróz gélspektrometriával és elektroforézissel határoztuk meg a PCR mezők előtt. Fordított transzkripciót végeztünk

1 μg RNS az RT2 First Strand Kit segítségével (SABioscience, MD, USA). A májgén expresszióját az RT2 Profiler ™ humán zsírmáj-tömb és az emberi arcerák rák PCR tömb (Qiagen, Frederick, MD, USA) segítségével határoztuk meg. A 84 májgénből álló célcsoport az adipokin és inzulin szignalizációjának szabályozásában részt vevő géneket, metabolikus enzimeket és transzportereket tartalmazott, valamint a gyulladásban és az apoptózisban részt vevő géneket használták fel a hisztopatológiai kritériumok szerint kategorizált állatok szövetének értékelésére a a máj steatosisát, amely a hepatocelluláris karcinóma és a hepatocarcinogenezis egyéb formáinak progressziójában részt vevő 84 gén expresszióját profilizálta, a hisztopatológiai kritériumok szerint kategorizált állatok szövetének értékelésére használták fel a májfibrózis képalkotására. A potenciális zsírmáj biomarkerekben és a májrákban szerepet játszó 84 kulcsgén expressziós kinetikáját minden PCR-területről egyidejűleg elemeztük az online RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0 szoftver segítségével (Qiagen, Valencia, CA, USA).,

Statisztikai analízis

A kémiai plazma paramétereket átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A kémiai plazma paramétereket (GGT, AST, ALT, AST/ALT, CHOL, TG és LDH arány) különböző csoportokban egyirányú ANOVA-val (SPSS szoftver, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) elemeztük, és a legkevésbé szignifikáns különbség ( A különbségek azonosítására a tesztet használtuk. A kontroll és a kísérleti csoportok között a plazma marker szintek különbségének kimutatására Student t tesztet alkalmaztunk. Minden elemzéshez P