áramkörének

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az érzékszervi jelek közvetítik az etetés megkönnyítését vagy elnyomását
  • Áramkörök, amelyek a hatalomkönnyítés alapját képezik
  • Áramkörök, amelyek az energiaelnyomás alapja
  • Kölcsönös gátlás az NSM és a RIM/RIC neuronok között
  • A központi integrációs áramkör "győztes mindent elvállal" funkciója
  • vita
  • mód
  • törzs
  • Molekuláris biológia
  • Viselkedési tesztek
  • Fluoreszcencia képalkotás
  • Adatelemzés
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Az állatok viselkedése
  • Etetési magatartás
  • Érzékelő rendszerek

absztrakt

A táplálkozási magatartást a környezet és a belső élettani viszonyok modulálják. Az étvágyat általában az étel kellemes illata (vagy megjelenése) támasztja alá, és a rossz íz elrontja. Valójában az állatok egyszerre több környezeti ingert érzékelnek, és nem világos, hogy ezek az érzékszervi bemenetek hogyan integrálódnak, ezért döntés születik az étkezési szokások ennek megfelelő szabályozásáról. Itt megmutatjuk, hogy a Caenorhabditis elegans étkezési szokásait vonzó szaggal vagy riasztókkal elnyomhatjuk. Az érzékszervi közvetítésű táplálkozás szabályozásában hibás mutánsok azonosításával elemeztünk egy központi flip-flop áramkört, amely két ellentétes érzékszervi bemenetet integrál, és bistabilis hormonkimenetet generál az étkezési viselkedés szabályozására. Mivel az etetés szabályozása az állatok túlélésének alapja, feltételezzük, hogy az itt megállapított alapvető szervezeti logika a C. elegans-ban valószínűleg összefog a különböző phyllitisekben.

Az állatoknak bonyolult változásokkal kell szembenézniük. Ezek a környezeti tényezők magukban foglalják a "jó" és "rossz" fizikai és kémiai ingereket, például a kellemes és visszataszító szagokat, valamint a magas és az alacsony hőmérsékletet. Az azonban nem világos, hogy ezek az ellentétes tényezők hogyan modulálják a viselkedést.

A Caenorhabditis elegans számos szenzoros modalitással rendelkezik, amelyek képesek érzékelni a környezetet, beleértve a szagot, az ízt, az ozmolaritást, a hőmérsékletet és a mechanikus érintkezést. Több száz vízoldható és illékony molekulát képes érzékelni, amelyek különböző viselkedést, például vonzást, elkerülést, táplálkozást vagy párzást okozhatnak 1. Két pár amfid szenzoros neuron, az AWA és az AWC, a kemotaxist közvetíti a vonzó illékony illatanyagokhoz 2, míg egy másik kemoszenzoros neuronpár, az ASH, a magas ozmolaritás, az illékony szagok magas koncentrációja, a forró alkaloidok (pl. Kinin) és a detergensek elkerülését. 3, 4, 5. Nem világos, hogy mennyire vonzó és visszataszító érzékszervi jelek vannak beépítve az állatok viselkedésének szabályozására.

A C. elegans a garatcső erőteljes pumpálásával táplálkozik, ami baktériumok lenyelését, koncentrációját, őrlését és a zúzott szuszpenzió bélüregbe való tolását eredményezi 6. Amikor a pumpálás sebességét választjuk kivonásnak, és igényeljük a C. elegant vonzószerekkel és repellensekkel, azt találjuk, hogy az attraktánsok és repellensek megkönnyítik és elnyomják a C. elegans táplálkozását. Ezenkívül az érzékszervi közvetítésű táplálás elősegítésében és szuppressziójában hiányos mutánsok azonosításával és jellemzésével bemutatjuk a C. elegans molekuláris és idegi körét, amely az ellentétes érzékszervi bemeneteket integrálja a pumpálási sebesség szabályozásába. A szenzoros ingerek lineáris összege helyett nemlineáris integrációt tárunk fel a központi neuroszekretorikus sejtekben. Arra a következtetésre jutunk, hogy a központi integrációs áramkör "mindent elnyer" funkciója stabil etetési viselkedést biztosít zajos környezeti ingerek jelenlétében.

az eredmény

Az érzékszervi jelek közvetítik az etetés megkönnyítését vagy elnyomását

Először azt teszteltük, hogy az olyan egyszerű szervezetek, mint a férgek, képesek-e megváltoztatni étkezési viselkedésüket az emberhez hasonló környezeti ingerekre reagálva. A férgeket vonzó illatanyagokkal, diacetil-csoporttal és alacsony izo-metil-2-koncentrációval, vagy repellensekkel, például kininnel és nagy koncentrációjú izo-amil-7, 8-mal támadtuk meg. Megállapítottuk, hogy a 10% -os vagy annál nagyobb diacetil-koncentrációk a szivattyúzási sebességet növelik

25%, ezt a jelenséget az etetésnek hívjuk könnyebbnek (La ábra). A táplálás megkönnyítését az izoamol alacsony koncentrációinál (10–4–10–5 hígítások, S1. Kiegészítő ábra) is megfigyeltük, amely attraktáns főleg az AWC 2 idegsejtjei által detektálható. Ezenkívül megfigyeltük az etetés elnyomását, amelyben a pumpálási sebességet nagyon alacsony szintre csökkentettük, dózisfüggő módon, nagy izoamilol vagy kinin koncentrációk mellett (1a. Ábra, b). A dózis-válasz görbék alapján a következő kísérletekhez 100, 100% és 5-10 mM koncentrációt választottunk ki a diacetil, izoamil és kinin esetében, hacsak másképp nem jelezzük. A pumpálási sebességet 5 és 10 perc között mértük, amikor az ingerek maximális hatást váltottak ki (1c. Ábra). Ezeknek a vegyi anyagoknak a mozgásra gyakorolt ​​lehetséges hatásait a test hajlításainak figyelemmel kísérése rövid vagy hosszú távú vegyi anyagoknak való kitettség során (S2.

Áramkörök, amelyek a hatalomkönnyítés alapját képezik

Ezután különböző szenzoros modalitásokkal vizsgáltuk a jelátviteli utakat. Az 5-hidroxi-triptamin (5-HT, szerotonin) neurotranszmitter szabályozza az étellel kapcsolatos viselkedést és fiziológiát a különböző gerinces és gerinctelen 15, 16, 17, 18 fajokban. Az 5-HT köztudottan növeli a szivattyúzási sebességet 19 élelmiszer hiányában, míg a tph-1 mutánsok, amelyek nem képesek szintetizálni az 5-HT-t, csökkent táplálékot mutatnak 17. Élelmiszerek jelenlétében az exogén 5-HT (13 mM) jelentése szerint nem stimulálja a 20 szivattyúzást. Ezzel szemben megfigyeltük

A szivattyúzási sebesség 25% -os növekedése 2 mM 5-HT exogén beadása esetén (2a. Ábra), összhangban a Srinivasana és mtsai. 21 tanulmányában tett megfigyelésekkel, amelyekben 5 mM 5-HT-t alkalmaztak. Érdekes módon megerősítettük, hogy csak az 5-HT (2-5 mM) alacsony koncentrációja segítheti a táplálékot étel jelenlétében (S8. Kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy az 5-HT magas koncentrációja a táplálkozási szabályozás alkalmazkodását vagy gátlását indukálja. javasolta Hobson és mtsai. A diaphetil-mediált, de nem az 5-HT-mediált szivattyúzási javulást megszüntették a tph-1 mutánsokban (2a, b. Ábra), ami arra utal, hogy az 5-HT részt vesz az érzékszervi közvetítésű táplálkozási könnyítésekben. A C. elegans hermafroditban a tph-1 expresszió csak néhány szerotonerg idegsejtre korlátozódik, például NSM, ADF és HSN 17, 22. Az 5-HT felszabadulási hely lokalizálásához idegsejt-specifikus promótereket használtunk a TPH-1 expressziójának vezérlésére tph-1 mutánsokban. A tph-1 helyreállítása a sejtek azon részhalmazában, amelyek átfedésben vannak a szerotonerg idegsejtekkel az NSM-ben, megmentette az etetés megkönnyítését (2c. Ábra), ami arra utal, hogy a TPH-1 NSM idegsejtekben hat.

Asztal teljes méretben

Áramkörök, amelyek az energiaelnyomás alapja

A kinin és az izoamol által kiváltott szivattyúzás gátlását azonban teljesen blokkolták a tdc-1 mutánsokban, míg a tbh-1 mutánsok pumpálását csak részben gátolták (3a. Ábra és S10a kiegészítő ábra). a tbh-1 a TA β-hidroxilázt kódolja, amely szükséges a TA OA30-vá történő átalakításához. Ezek az eredmények összhangban vannak a TA/OA gátló szerepével a szabályozás 32 pumpálásában .

Kölcsönös gátlás az NSM és a RIM/RIC idegsejtek között

a - d ) Időbeli tanfolyamok mintái és statisztikák az NSM kalciumszintjéről ( a, b ) és a RIM ( c, d ) szabadon mozgó állatok neuronjainak táplálékán, 100% -os diacetil (vörös) hiányában vagy jelenlétében. és 5 mM kinin (kék). A szürke négyzetek jelzik a kémiai alkalmazás időtartamát. ( e ) A diacetil azon képessége, hogy gátolja a kalciumszintet a RIM neuronokban, elveszett a tph-1 és a mod-1 mutánsokban, de a tph-1 NSM-ben és a mod-1 RIM/RIC neuronokban történő transzgénikus expressziója mentette meg. ( f ) A kinin által kiváltott kalciumszint gátlást az NSM idegsejtekben a tdc-1 és a ser-2 mutánsokban eltörölték, de a tdc-1 RIM/RIC-ben és a ser-2 NSM neuronokban történő transzgénikus expressziójával megmentették. Promóterként Ptdc-1-et RIM/RIC-hez, Ptph-1-t NSM-hez használtunk. Statisztika ( b, d - f ): * P

mód

törzs

A C. elegans törzseket fonálféreg-tenyésztő táptalaj (NGM) lemezeken tenyésztettük 20 ° C-on, E. coli OP50 baktériumsejteket használva táplálékként standard módszerekkel 39 .

A törzseket a CGC-től (//www.cbs.umn.edu/CGC/) és a National Bio-Resources Project-től (//www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp) kaptuk. Az ebben a vizsgálatban használt vagy előállított törzseket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. A kettős és hármas mutációval rendelkező állatokat, a mutációk kívánt kombinációjával, PCR-rel és szekvenálással igazoltuk. Minden transzgén törzset publikált 40 módszerrel állítottunk elő. A plazmidokat 50 ng μl -1 értéken injektáltuk együtt unc-122: rfp-vel (20 ng μl -1) együttinjekció markerként, hacsak másképp nem jelezzük. Minden mentési kísérlethez legalább három független vonalat teszteltek.

Molekuláris biológia

A gateway technológiát használták a konstrukciók gyártásához. A pPD95.75 vektor (az A. Fire ajándéka) GFP kódoló szekvenciáját tdc -1 G-CaMP 2.0, TagRFP-T vagy C. elegans génekkel helyettesítettük, hogy módosított vektorok sorozatát hozzuk létre. Az attP1-ccdB-CmR-attP2 kazettát pDONR221-ből (Invitrogen) származó PCR-rel amplifikáltuk Hin dIII vagy I. kor restrikciós helyeket tartalmazó oligóval. pPD95 .75 és a fent felsorolt ​​egyéb módosított vektorok a módosított kapubejáró vektorok megszerzéséhez.

A tph-1, tdc-1, gcy-13, tbh-1 és mod-1 promotereket N2 genomi DNS-ből PCR-rel amplifikáltuk attB1 és attB2 maradékokat tartalmazó primerek alkalmazásával. Ezeket a PCR fragmenseket rekombináns BP reakcióval rekombináltuk módosított donor vektorokban az attP1 és attP2 helyekkel. Ily módon P tph-1: G-CaMP2.0, P tdc-1: G-CaMP2.0, P tph-1: GFP, P tdc-1: GFP, P mod - 1: TagRFP-T, Pgcy-13: tdc-1 és Ptbh-1: tdc-1 plazmidok alkották. A tph-1, tdc-1, gcy-13, mod-1 és tbh-1 promoterek hossza 4, 5, 4, 4, 2, 3, 5, 5 és 4, 6 kb.

A P tph-1: ser-2 plazmid felépítéséhez a C. elegans ser-2 gén cDNS-szekvenciáját szubklónoztuk a pPD49.26 vektor SalI és KpnI helyeire (A. Fire ajándéka). A tph-1 promótert ezután inszertáltuk a vektor SphI és Sall helyei közé.

A P tdc-1: mod-1 plazmid előállításához az összes mod-1 intront és exont tartalmazó 4073 bp méretű genomi DNS-fragmenst PCR-rel amplifikáltuk az N2 genomi DNS-ből, és szubklónoztuk a pPD49.26 vektor NheI és KpnI helyeire. A tdc-1 promótert azután a vektor BamHI és NheI helyei közé illesztettük be.

A Ptph -1: glr -7 plazmid megalkotásához az összes glr-7 intront és exont tartalmazó, 3 657 bp-os genomi DNS-fragmenst PCR-rel amplifikáltuk az N2 DNS-genomból, és szubklónoztuk a pPD49.26 NheI és KpnI helyeire. A tph-1 promótert inszertáltuk a vektor MscI és NheI helyeibe.

Viselkedési tesztek

Minden viselkedési tesztet fiatal felnőtteken végeztek. A szivattyúzási sebesség teszteléséhez megmértük a 20 szivattyú elkészítéséhez szükséges időt. Minden állatnál négy-hat mérést regisztráltunk, és kísérletenként legalább 8-12 állatot teszteltünk, az összes kísérletet legalább háromszor megismételtük. A különféle illékony vegyi anyagok takarmány-modulációra gyakorolt ​​hatásának tesztelésére a jól táplált fiatal felnőtt férgeket új OP50 maggal ellátott lemezekre vitték át. 10 perc múlva 2 ul illékony vegyszert (diacetil- vagy izoamilol, mind a Sigma cégtől) adunk a fedélhez, és a lemezt 5 percig lezárjuk, mielőtt regisztrálnánk a pumpálási sebességet. A szerotonint, a TA-t és az OA-t feloldottuk M9 pufferben, és 2 mM végkoncentrációban szétterítettük élelmiszer NGM lemezeken. A kinint M9 pufferban oldottuk 5 mM koncentrációban, és NGM lemezekre szélesztettük. A fiatal felnőtteket 2 óra elteltével átvitték ezekre az NGM lemezekre, és a szivattyúk számát 5 perc után 10 percig számoltuk. M9 puffert adtunk a lemezhez kontroll céljából.

A 100% izoamil kizárását az előzőekben leírtak szerint mértük 5, kisebb módosításokkal: a jól táplált állatokat 10 percig tápláléklemezekre helyeztük. A bevont 1 MQ-os üveg elektródot ezután 100% izoamil-oldatba merítettük, és 2 másodpercig az elülső állat állatának orra elé helyeztük. Az egyes állatok 4 másodpercen belüli válaszát pozitív (hátra mozgás) vagy negatív (nincs visszafelé mozgás) válaszként rögzítették.

Az itt alkalmazott mozgásvizsgálat az előző vizsgálatban használt teszten alapult 41. Röviden, a kontroll állatokat és a vegyszereknek kitett állatokat táplálékmentes lemezekre vittük át. 10 perc elteltével az elülső testhajlítások számát 20 s időközönként 5 percig számoltuk.

Fluoreszcencia képalkotás

A G-CaMP2.0 fluoreszcencia képeit Zeiss Discovery V8 fluoreszcens mikroszkóp alatt, x20 objektívvel készítettük. Az NSM vagy RIM/RIC idegsejtekben G-CaMP2.0-t expresszáló fiatal felnőtt férgeket új, OP50-vel beoltott NGM csészékbe helyeztük. A fedélbe lyukat vágtak, és egy 25 mm-es 00 # méretű fedőlemezzel borítottak be, amelyhez 2 ul illékony vegyszert adtak. A kinint közvetlenül az agarlemezre adtuk. Ezután a lemezeket lezártuk, és 5 perces kémiai stimuláció után képeket készítettünk a sejttestekről, amikor a pumpálási sebesség már megnőtt (diacetil) vagy csökkent (izoamilol vagy kinin). A Ca 2+ idő lefutásának mérésére Olympus IX81 invertált fluoreszcens mikroszkópot használtunk, amely × 20 objektívvel, NA0,75 volt felszerelve. Ahhoz, hogy a mozgó féregneuron a feltöltött eszköz látómezőjében maradjon, az Applied Scientific Instrumentation (ASI, Eugene, USA) PhotoTrack rendszerét az ASY XI stádiumával kombinálva zárt 42-es ciklussal. A G-CaMP2.0 NSM vagy RIM/RIC neuronok fluoreszcenciáját szabadon mozgó férgekben a PhotoTrack rendszer rögzítette Andor Luca EM-CCD-vel 2 Hz-en.

A tdc-1: GFP és mod-1: TagRFP-T vagy tph-1: TagRFP-T és ser-2: GFP együttes lokalizációját Andor Revolution XD lézeres konfokális mikroszkópos rendszer alkalmazásával vizsgáltuk rotáció alapján - lemez konfokális pásztázó fej, CSU-X1 (Yokogawa Electric), az Andor IQ 1.91 szoftver irányítása alatt. Konfokális mikroszkópot készítettek egy Olympus IX-71 invertált mikroszkópra (Olympus, Tokió, Japán), amely x60-as objektívvel volt felszerelve (numerikus rekesz = 1,45, Olympus, Japán). A képeket a Image-J 1, 43b (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA) segítségével jelenítettük meg és elemeztük.

Adatelemzés

Az adatok elemzését az IGOR Pro 5.01 (Wavemetrics, Portland, OR, USA) alkalmazásával végeztük. Az eredményeket ± 10-12 állat átlagértékeként jelentjük, hacsak másképp nem jelezzük. A statisztikai szignifikanciát Student t-tesztjével értékeltük. A csillagok statisztikai szignifikanciát jeleznek: * P