szabályozza

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A DNMT1 méhen kívüli expressziója érelmeszesedéssel társult makrofágokban
  • A DNRT1 makrofágok súlyosbítják az érelmeszesedés kialakulását a DNMT1 Tg egérmodelljében
  • A DNMT1 makrofág növeli a gyulladásgátló citokin termelését
  • A PPAR-y promoter DNMT1 által közvetített metilezése
  • A roziglitazon megakadályozza a DNMT1 makrofágok által kiváltott proinflammatorikus citokinek termelését és az AS kialakulását
  • A makrofág DNMT1 elősegíti a proinflammatorikus citokintermelést és az AS fejlődését azáltal, hogy elnyomja a PPAR-γ-t makrofágokban
  • Emelkedett DNMT1 szint és csökkent PPAR-γ szint az AS betegekkel társult monocitákban
  • vita
  • mód
  • Humán perifériás vér monociták gyűjtése és izolálása
  • Transzgénikus egerek generálása
  • Egerek és diéta
  • Az érelmeszesedés számszerűsítése
  • A peritoneális makrofágok (PM) kivonása
  • Makrofágok izolálása a zsírszövetből vagy az artériás plakkból
  • Ox-LDL előállítása
  • Biszulfit konverzió és piroszekvenálás
  • PPAR-y promoter klónozása és riporter gén vizsgálata
  • Valós idejű PCR
  • Western blot
  • Enzimatikusan kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)
  • A plazma lipidek mérése
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

  • Szív-és érrendszeri betegségek
  • Anyagcserezavarok

absztrakt

Az ateroszklerózis (AS), amely világszerte gyakori rendellenesség, ok-okozati összefüggésben áll a komplex betegségekkel, beleértve a szívkoszorúér-betegséget és az 1., 2., 3. stroke-ot. A makrofágok által közvetített gyulladásos válaszok kulcsszerepet játszanak az AS 4, 5 kialakulásában. Az alacsony sűrűségű oxidatív lipoprotein (ox-LDL) és a makrofágok artériás falban való felhalmozódása fontos szerepet játszik az AS fejlődésének patofiziológiájában, meghatározva a plakkképződést, a progressziót és a repedést 6, 7. Az AS korai szakaszában a keringő monociták vonzódnak az erek endotheliumához. Az érsejt-adhéziós molekulák és a monocita kemoattraktáns fehérje részt vesz az 1, 3 monocita kemotaxisban. A makrofágok, amelyek az intimában különböznek a monocitáktól, előgyulladásos citokinek (pl. TNFα, IL-6 és IL-1β) szekretálásával, a koleszterin felvételével és az 1, 3, 8 apoptózis kialakulásával segítik az AS kialakulását. A makrofágok proinflammatorikus aktivitásának elnyomása hatékony stratégia az AS 3 megelőzésére és kezelésére .

A makrofágok klasszikusan aktiválhatók (M1) vagy alternatív módon aktiválhatók (M2) 9, 10. Az M1 makrofágok hajlamosak olyan gyulladáscsökkentő fenotípusra, amely magas szintű gyulladáscsökkentő citokint (pl. TNFα, IL-6 és IL-1β) expresszál, míg az M2 makrofágok gyulladáscsökkentő szerepet játszanak azáltal, hogy magas szintű anti- gyulladásos citokinek (pl. IL-10 és Arg1) 10. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HFD) vagy az elhízás M1 makrofágokat indukálhat, míg a Th2 citokinek, például az IL-4 vagy az IL-13 polarizálhatják az M29 makrofágokat. A peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma receptor (PPAR-y) szintén fontos szerepet játszik az M2 11, 12 makrofágok polarizációjának elősegítésében. A PPAR-y expressziójának vagy aktivitásának szabályozása hatékony eszközt jelent a gyulladásos citokinek 11, 12 makrofágok általi termelésének szabályozására. .

Új tanulmányok a génexpresszió szerepére összpontosítottak a 8, 13, 14 makrofágaktivitás szabályozásában. A makrofág-aktivitás epigenetikus szabályozása azonban még mindig nincs teljesen tisztázva. Az epigenetikus szabályozás, beleértve a DNS-metilezést, összekapcsolja a környezeti tényezőket (pl. Stressz, étrend) összetett rendellenességekkel (pl. AS, rák) 15, 16, 17. A citokinek DNS-metilezése, elsősorban a CpG dinukleotid helyeken, a 18, 19 genom leggyakoribb epigenetikus módosítása. A CpG-k gyakran dúsulnak a promóter régiókban és a 20 gének első exon/5'-nem transzlált régióiban. A transzkripciósan aktív gének promotereit általában hipometilezzük, míg a DNS hipermetilezése a 15, 19 gének elnémításához vezethet. A de novo metilációt a 3a és 3b21 DNS-metiltranszferázok (DNMT) közvetítik. Meghatározás után a DNS metilezését mitózis, különösen a DNMT1 22, 23 fenntartó enzim tartja fenn. A globális DNS-metiláció megváltoztatása szabályozhatja a krónikus gyulladásos betegségeket 16, 17. A DNS-metil-transzferázok makrofág-polarizációban és AS-fejlesztésben betöltött szerepét azonban még nem sikerült teljesen tisztázni.

Ebben a tanulmányban feltételeztük, hogy a DNMT1 szabályozhatja a gyulladásos citokinek termelését a makrofágokban, és befolyásolhatja az AS kialakulását. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez létrehoztunk egy egérmodellt a makrofág-specifikus transzgén DNMT1 vagy PPAR-γ-val. Bevezettünk egy AS egérmodellt is ApoE-knockout (ApoE -/-) egerek aterogén étrendjének etetésével. In vitro és in vivo kísérletek segítségével azonosítottuk a DNMT1/PPAR-γ út szerepét az AS kialakulásában.

az eredmény

A DNMT1 méhen kívüli expressziója érelmeszesedéssel társult makrofágokban

a ) DNMT1, DNMT3a és DNMT3b mRNS szintek zsírszövetből származó makrofágokban (ATM) olyan hím C57BL/6 egerekből, akiket normál étrenddel (ND) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) tápláltak 12 hétig (n = 5, *) P -/-) atherogén étrendet táplált 12 hétig (n = 5, *** P DNMT1

( a ) A DNMT1 transzgén jelentősen befolyásolja a gyulladás útját és a PPAR jelátviteli utat. A transzgénikus vad típusú peritoneális makrofágokat és a DNMT1-et izoláltuk, és 24 órán át LPS-sel (100 ng/ml) kezeltük, majd ezt követtük egy gar microarray-vizsgálattal. A mikroszkóp adatait ezután KEGG elemzésnek vetettük alá. Különösen a megváltozott gyújtási útvonalak és a PPAR jelút a megfelelő P értékekkel jelennek meg. ( b ) ApoE -/- vagy makrofág DNMT1 transzgén (Tg DNMT1) ApoE -/- egerek plazma citokinszintje 12 hétig AD-vel etetett (n = 6, * P DNMT1 egerek (n = 6, * P DNMT1 (n = 6, *) P 11, 12 és ebben a vizsgálatban gátolta a DNMT1 túlzott expressziója, a microarray génexpressziós elemzés szerint. Valós idejű PCR-vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a PPAR-γ túlnyomórészt makrofágokban expresszálódott, és a DNMT1 transzgén mRNS szintjei jelentősen gátoltak Megerősítettük továbbá, hogy a DNMT1 szignifikánsan elnyomta a PPAR-y mRNS és célgénje, CD36 expresszióját (4b. Ábra), de a DNMT1 és a PPAR-y expresszióját összekapcsoló mechanizmust tovább kellett tisztázni.

( a ) A PPAR-α, β és γ mRNS relatív szintje a transzgén peritonealis WT vagy DNMT1 makrofágokban (n = 5, * P DNMT1 24 órán át. Ezután a sejteket luciferáz vizsgálatokhoz gyűjtöttük. (N = 3, ** P DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 az ApoE -/- egerek plazmájában AD-ben szignifikánsan gyengítette a rosiglitazon kezelés (5a. Ábra), míg a Tg DNMT1 - szuppresszív plazma IL-10 szinteket nagyrészt a roziglitazon mentette meg (5a. Ábra). ugyanezeket az eredményeket találtuk a fenti AS egerek artériás plakkjaiból izolált makrofágokban (5b. ábra), és igazoltuk, hogy a DNMT1 az ox-LDL-kezelt peritoneális makrofágokban PPAR-γ jelátvitel révén szabályozza a gyulladásos citokintermelést (5c. ábra). A roziglitazonnal végzett vivo kezelés teljesen megmentette a DNMT1 transzgén által okozott káros AS kialakulását (5d. ábra).

a ) A transzgénikus ApoE -/- vagy a DNMT1 (Tg DNMT1) ApoE -/- makrofágok plazma citokinszintjei Rosi-val (ip, 12 mg/100 g testtömeg/2 nap) és AD-vel 12 hétig (n = 6) kezeltek, * P DNMT1 egér. (n = 6, * P PPAR-y) egérmodell (6a., b. ábra). A DNMT1-hez hasonlóan a makrofágokban lévő PPAR-y transzgénnek sem volt szignifikáns hatása a testtömeg-gyarapodásra (6c. Ábra) vagy a plazma lipidprofilokra (pl. Szabad és teljes koleszterin, trigliceridek, foszfolipid és koleszterin-észter) (6d. Ábra) ). A Tg DNMT1 által indukált proinflammatorikus citokinek plazmaszintjeit azonban elsősorban az ApoE -/- AS modellben Tg PPAR-y hozzáadása akadályozta meg (6e. Ábra). Ugyanakkor a plazma Tg DNMT1 IL-10 szintjét megmentettük a Tg PPAR-y plazmiddal (6e. Ábra). Tovább igazoltuk a DNMT1/PPAR-γ út szabályozó szerepét a gyulladásos citokinek termelésében artériás plakkokból származó makrofágokban (6f. Ábra) és ox-LDL-stimulált makrofágokban (6f. Ábra, g). A DNMT1/PPAR-γ útnak az AS fejlődésében kifejtett hatásainak további megfigyeléséhez kettős transzgénikus egérmodell létrehozásához ApoE -/- Tg DNMT1 egereket kereszteztünk ApoE -/- Tg PPAR-γ egerekkel. Ahogy az várható volt, a DNMT1 Tg miatti károsodott AS progressziót PPAR-γ Tg megakadályozta (6h ábra).

( nak,-nek ) Relatív DNMT1 mRNS-szintek ( a ), PPAR-ok ( b ), IL-ip ( c ), IL-6 ( d ), TNFα ( e ) és az IL-10 ( f ) az AS vagy egészséges donoros betegek izolált perifériás vér monocitáiban (n = 25, * P 17, 27. A DNS metilációs célgének és szerepük az AS fejlődésében azonban továbbra sem tisztázott. Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a DNMT1 ektopikusan expresszálódott AS-szel társult makrofágokban: A DNMT1 makrofágok súlyosbították az AS kialakulását azáltal, hogy elnyomták a PPAR-γ-közvetített gyulladáscsökkentő hatásokat, és ezek az eredmények potenciális terápiás célpontokat jelentenek az AS számára.

Megállapítottuk, hogy a DNS-metiltranszferázok (DNMT3a és DNMT3b) expresszióját a zsírszövetből származó makrofágokban HFD-vel vagy elhízással kapcsolatos tényezőkkel indukálták. Ez a megállapítás hasonló volt egy korábbi tanulmány 17 eredményeihez. Különösen azt tapasztaltuk, hogy a DNMT1, a DNS metilációjának 22., 23. fenntartó enzime, indukciója hangsúlyosabb volt a makrofágokban, mint a DNMT3a és a DNMT3b HFD általi stimulálása. Érdekesebb, hogy a DNMT1-et, de nem a DNMT3a-t vagy a DNMT3b-t indukálták az ApoE -/- AS modellben. Egy korábbi tanulmány szerint a gyulladáscsökkentő faktorok (például telített szabad zsírsav) vagy a gyulladáscsökkentő citokinek (pl. IL-4) stimulálhatják vagy elnyomhatják a DNMT3b (nem a DNMT3a) expresszióját 17. Más 17., 28. tanulmány, eredményeinkkel együtt azt sugallja, hogy a DNS-metilációval összefüggő enzimek expresszióját különféle tényezők külön-külön szabályozták. A HFD-t vagy az ApoE-t a DNMT1, DNMT3a és DNMT3b indukciójával összekapcsoló részletes molekuláris mechanizmusok továbbra sem tisztázottak, és nagyon összetetteknek kell lenniük.

A DNMT1 céljai univerzális 18, 23. Microarray és KEGG elemzéssel azt tapasztaltuk, hogy a PPAR jelátvitelt jelentősen befolyásolta a DNMT1. További megerősítéssel azt tapasztaltuk, hogy a PPAR-γ, de nem a PPAR-α vagy a β, túlnyomórészt a DNMT1 által expresszált és szabályozott makrofágokban. Szerencsére azt tapasztaltuk, hogy a PPAR-γ, a DNMT1-től lefelé, hatékonyan szabályozhatja a gyulladásos citokintermelést a makrofágokban és az AS fejlődését egérmodellben. A specifikus PPAR-y agonista védő szerepet játszott az AS előrehaladásában is. Valójában gyulladásos citokinek sorozatát (például TNFa, IL-1β, IL-6 és IL-10) modulálta a PPAR-y 11, 12. A citokin, amely a legfontosabb volt a makrofágaktivitás szabályozásában és az AS kialakulásában a DNMT1/PPAR-γ irányában, továbbra sem tisztázott. Ennek a kérdésnek a jövőbeni kezelése érdekében meg kell határozni ezen citokinek specifikus kölcsönhatását antitestekkel vagy knockout egér modellekkel.

Adataink együttvéve feltárták a DNMT1 méhen kívüli expresszióját az AS-hez kapcsolódó makrofágokban. Először bizonyítottuk, hogy a DNMT1 elősegítette az AS-hez kapcsolódó makrofágok gyulladásgátló aktivációját és az AS progressziót egérmodellekben. Megállapítottuk azt is, hogy a PPAR-y a DNMT1 által szabályozott DNS-metiláció célpontja volt, és részt vett a DNMT1 által közvetített krónikus gyulladásban és az AS kialakulásában. Ezek a megállapítások megvilágították az AS megelőzési stratégiáit és kezeléseit, amelyeket az AS kezelésére kell használni.

mód

Humán perifériás vér monociták gyűjtése és izolálása

Transzgénikus egerek generálása

Az egér DNMT1 vagy PPAR-y cDNS-jét egy humán CD11b promotert tartalmazó konstrukcióba szubklónoztuk, hogy irányítsuk a 29, 30 makrofág-specifikus gén expresszióját. A makrofágokra (Tg DNMT1) vagy a PPAR-y (Tg PPAR-γ) specifikus transzgénikus DNMT1 konstrukciót standard protokollok szerint mikroinjektáltuk C57BL/6 embriókba, és az alapítókat kereszteztük vad típusú C57BL/6 törzzsel. y expresszió makrofágokban Tg DNMT1 egerek, Tg PPAR-y egereket kereszteztünk Tg DNMT1 egerekkel kettős transzgénikus egerek (Tg DNMT1 + PPAR-y) előállításához. Ezeket a kísérleteket az Állatok gondozásával és felhasználásával foglalkozó intézményi bizottság hagyta jóvá a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetemen, és a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.

Egerek és diéta

Valamennyi állatkísérletet az Állatok intézményes gondozásával és használatukkal foglalkozó bizottsága hagyta jóvá a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetemen, és azokat az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által kiadott "Laboratóriumi állatok gondozásának és felhasználásának kézikönyvével" összhangban hajtották végre. kiadvány). nem. 85-23, felülvizsgált 1996). Az egereket kórokozóktól mentes létesítményben tartottuk 12 órás fényciklussal, 12 órás sötét ciklussal, és ad libitum táplálékkal és vízzel láttuk el.

A C57BL/6 háttérrel rendelkező ApoE knockout egereket (ApoE -/-) a Jackson Laboratory-tól vásároltuk. A vad típusú C57BL/6 egereket a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetem Állatközpontjából vásároltuk. A DNMT1 vagy PPAR-γ makrofágok AS fejlődésben játszott szerepének vizsgálatához Tg DNMT1 vagy Tg PPAR-y egereket pároztunk ApoE -/- egerekhez. A hathetes egereket atherogén táplálékkal etették (magas zsír- és koleszterintartalmú étrend: 45% zsíros energia [16: 0 = 23, 3%, 18: 0 = 15,9%, 18: 1 = 34,8%, 18: 2 = 18,7%] és 0,2% (w/w koleszterin) 31. 12 hetes aterogén étrend után az egereket feláldoztuk a plazmának, az aortának, az epididymális zsírnak és más szöveteknek.

Az érelmeszesedés számszerűsítése

Az előző vizsgálat 32 szerint az egereket 12 hetes aterogén étrenddel történő etetés után feláldoztuk, hogy elemezzük az ateroszklerózis kialakulását az egér aorta gyökerében. A keringési rendszert PBS-sel (100 Hgmm) perfundáltuk 10 percig, mielőtt a szív és az aorta eltávolításra került. A szívet, valamint az aorta gyökerét és az aorta ívet kivágtuk, az aorta gyökér soros szakaszait pedig Leica CM3050 kriosztát segítségével. A metszeteket hematoxilinnel és 0,5% olajvörös O-val (Sigma-Aldrich) festettük az aorta sinus atherosclerotikus intim területének értékelése céljából. Az érelmeszesedéses elváltozások és az Olajvörös O-pozitív területét Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics) számszerűsítettük.

A peritoneális makrofágok (PM) kivonása

Az elsődleges PM-ket a korábban leírt módon izolálták 13. Röviden, mindegyik egeret (ip) 2 ml 2,9% -os tioglikoláttal (# T9032, Sigma) injektáltuk az 1. napon, majd a 3. napon leöltük. 5 ml friss DMEM táptalaj ip injekciója után a peritonealis sejteket tenyésztőcsészékbe gyűjtöttük. Két órával később az úszó sejteket PBS-sel mossuk, és a csatolt PM sejteket felhasználjuk egy másik kísérlethez.

Makrofágok izolálása a zsírszövetből vagy az artériás plakkból

A stromális vaszkuláris sejtek izolálását a zsírszövetből a fent leírtak szerint hajtottuk végre. A makrofágok (F4/80 + sejtek) izolálását a sztrómás vaszkuláris sejtekből mágneses immunoaffinitás izolálással hajtottuk végre, mágneses gyöngyökhöz konjugált anti-F4/80 antitestekkel (MACS; Miltenyi Biotec). A sejteket pozitív szelekciós oszlopok (MACS) alkalmazásával izoláltuk, mielőtt sejtlizátumokat készítettünk az mRNS analíziséhez valós idejű PCR-rel.

Az aorta immunsejtek összegyűjtése érdekében az aortákat összegyűjtöttük, megtisztítottuk és megemésztettük, hogy az aorta sejtek felszabaduljanak, amint azt korábban leírtuk 33. Az F4/80 + sejteket ezután szelektíven gyűjtöttük a fent leírtak szerint.

Ox-LDL előállítása

Valós idejű PCR

Az összes RNS-t a peqGold Total RNS Kit alkalmazásával izoláltuk, beleértve a DNáz emésztést (Peqlab, Erlangen, Németország). Az RNS-eket az Omniscript (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével cDNS-be írtuk át. Az MRNA szinteket kvantitatív valós idejű PCR-rel (qPCR) határoztuk meg. GAPDH-t használtunk belső kontrollként, és a génexpressziós szinteket delta-Ct módszerrel számoltuk. Az egyes gének mRNS-szintje a kontrollcsoportban lévő mennyiséghez viszonyított mennyiséget jelentett, amelyet önkényesen egyre standardizáltunk. A qPCR-hez használt alapozó szekvenciák kérésre rendelkezésre állnak.

Western blot

A szövet- és sejtfehérjéket RIPA lízispufferrel (# P0013, Beyotime, Kína) extraháltuk, és BCA kit (# P0009, Beyotime, Kína) segítségével számszerűsítettük. A fehérjemintákat 10% -os SDS poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el és PVDF membránra (Millipore) vittük át. Miután 5% tejet blokkoltunk Tris-pufferolt sóoldatban, amely 0,1% Tween-20-ot (TBST) tartalmazott, a membránt inkubáltuk a DNMT1 elleni elsődleges antitestekkel (# 5032, Cell Signaling Technology). Az antigén-antitest komplexet Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) detektálta, belső kontroll fehérjeként GAPDH-val (# 5174, Cell Signaling Technology). A jeleket Bio-Rad ChemiDoc MP rendszerrel rögzítettük (170-8280).

Enzimatikusan kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)

A plazma-citokineket ELISA készletekkel mértük a kutatás-fejlesztési rendszerből származó TNF-α (# MTA00B), IL-1β (# MLB00C), IL-6 (# M6000B) és IL-10 (M1000B) segítségével a gyártó protokolljainak megfelelően.

A plazma lipidek mérése

A gyártó protokolljait követték a triglicerid szint (triglicerid reagens, Sigma # T2449; szabad glicerin reagens, Sigma # F6428), az összes koleszterin (folyékony koleszterin reagensek, Pointe Scientific Inc. # C7510-120), a szabad koleszterin (WaKo # 435) mérésére. . -35801) és foszfolipidek (C foszfolipid reagens, Wako # 433-36201) plazmamintákban.

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± SEM-ben fejezzük ki, és elemzésüket egyirányú ANOVA-val vagy párosítatlan Student kétfarkú teszttel végeztük. Az összes adat minden paraméterére az eredmények szignifikánsak voltak * P-nál