elemeket

absztrakt

Az aldoszteron egy mineralokortikoid hormon, amelyet a mellékvesekéregben termelnek. Fiziológiai körülmények között az aldoszteron specifikus intracelluláris mineralokortikoid receptorokhoz (MR) történő kötődése a disztális nephronban szabályozza az elektrolit és a víz homeosztázisát. Így az aldoszteron szabályozza a vér térfogatát és a vérnyomást. Az aldoszteron azonban hozzájárul a vesekárosodás kialakulásához is, amiről több tanulmány is beszámolt. Az elsődleges aldoszteronizmus, amelyet a plazma magas aldoszteronszintje és alacsony reninaktivitása jellemez, gyakran korrelál a vesekárosodás fokozott kockázatával. 5.

Cry1,2 DKO egereket alkalmaztunk az aldoszteron által kiváltott vesekárosodás vizsgálatára előzetes vese manipuláció, magas sótartalmú kezelés és/vagy mineralokortikoid beadás hiányában. A kriptokrómról ismert, hogy szabályozza a cirkadián ritmust. 14 Cry1, 2 DKO egér megnövekedett mRNS expressziót és a 3β hidroxi-szteroid-dehidrogenáz, az aldoszteron szintézisben részt vevő enzim fehérje szintjét mutatja. Az enzim főként a zona glomerulosa-ban fejeződik ki, ahol az aldoszteron termelése ismerten kizárólagosan fordul elő. Így a Cry1,2 DKO egerek magas aldoszteronszintet mutatnak, de alacsony plazma aktivitást mutatnak. 15

mód

Állatkísérletek

Ebben a vizsgálatban kriptokróm-null egereket (Cry1, 2 DKO) használtunk, amelyeket a magas plazma aldoszteronszint és a renin aktivitás elnyomása jellemez. A Cry1,2 DKO egerek kifejlődését fentebb leírtuk. A vizsgálat során az összes egeret stabil környezeti hőmérsékleten tartottuk 12 órás világos-sötét ciklus mellett, és szabadon hozzáférhettek a vízhez és az élelemhez. Az összes kísérleti protokollt a japán Kobe Egyetemen végzett állatkísérletek alapján hajtották végre.

Kontrollként Cry 1, 2 DKO egereket és standard (WT) testvéreket használtunk. A 12 hetes hím egereket a következő hat csoportba osztottuk: normál sókezelésben részesülő WT egerek (WTNS; n = 17), magas sótartalmú kezelésben részesülő WT egerek (WTHS; n = 16), Cry1, 2 DKO egerek normális sókezelés (CRYNS; n = 13), Cry1, 2 magas sótartalmú kezelésben részesülő DKO egér (CRYHS; n = 20), Cry1, 2 DKO egér magas sótartalmú és spironolakton kezelésben (CRYSPI; n = 13); ) és Cry1, 2 DKO egér, amely magas sótartalmú és hidralazinos kezelést kapott (CRYHYD; n = 6). Valamennyi egér 32 héten át megfelelő kezelésen esett át. A normál sótartalom NaCl-tartalma 0,2% volt, míg a magas sótartalmú étrend 3,15% NaCl-ot, az ivóvíz pedig 1% NaCl-ot és 0,2% KCl-ot tartalmazott. A spironolaktont vagy a hidralazint ivóvízben adtuk be. A spironolakton (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és a hidralazin (Sigma-Aldrich) dózisa napi 6 mg/kg testtömeg és 25 mg/kg/nap volt. A spironolaktont etanolban oldjuk, majd ivóvízben hígítjuk.

Vérnyomásmérés

A vérnyomást tudatos, kiképzett egerekben határoztuk meg egy nem invazív számítógéppel automatizált farok mandzsetta rendszerrel (BP-98A, Softron, Tokió, Japán). Az adatok elemzéséhez átlagosan 10 mérést használtunk.

A vér és a vizelet biokémiai elemzése

32 hetes kezelés után vért nyertünk biokémiai analízishez szívszúrással, mielőtt az egereket feláldoztuk volna. A 24 hurin betakarítást metabolikus ketrecek alkalmazásával végeztük 1 nappal az egerek megölése előtt. A szérum és a vizelet kreatinin koncentrációját enzimatikus vizsgálattal (Nescoat VLII CRE Kit; Alfresa Pharma Corp, Osaka, Japán) mértük. Kereskedelmi forgalomban kapható enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készletet használtunk a vizeletalbumin mérésére (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A szérum aldoszteront egy kereskedelemben kapható enzim immunvizsgálati készlettel (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, USA) mértük a gyártó által leírt protokoll szerint. A szérum- és vizelet-elektrolitokat ionszelektív elektróddal mértük, és a Nernst-egyenlet segítségével számoltuk ki.

Gén expresszió

Az eltávolított vese teljes RNS-ét RNAIsoPlus (TaKaRa, Dalian, Kína) alkalmazásával extraháltuk. A reverz átírást a ReverTra Ace (Toyobo, Oszaka, Japán) alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint. A renin, MR, 11β hidroxi-szteroid-dehidrogenáz 2-es típusú (11BHSD2), nephrin és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD) expressziós szintek mennyiségi meghatározását Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japán) alkalmazásával végeztük a leírt protokoll szerint. gyártó. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott primerek a következők voltak: renin (előre: 5'-ATGAAGGGGGGTGTCTGTGGGGTC-3 '; hátramenet: 5'-ATGTCGGGGGGGGGGGGCACCTG-3'), MR (előre: 5'-GGAAACCAAAGGCTACCACG-3 ' Tz 3 ′), 11BHSD2 (előre: 5′-TTTGGTGCACTTGAGCTGAC-3 ′; hátramenet: 5′-GGTATGGCATGTCTCCTGCT-3 ′), nefrin (előre: 5′-ACTACGCCCTCTTCAAATGCA-3 ′; G6P; 5G-6G; forward: 5'-GTTAAATGGGCCAGCGAAG-3 '; reverz: 5'-CCTGCTCTGCCATGATGTTT-3') és a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (forward: 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 'TGGA: 5'GGGGCTCT-3';).

A hisztopatológia számszerűsítése

A reaktív oxigénfajok termelésének értékelése

A reaktív oxigénfajok (ROS) kiértékelését dihidroetídiummal festett kriozektálásokon végeztük. Röviden, a kriosekciókat 5 μM dihidroetidiummal dimetil-szulfoxidban inkubáltuk 37 ° C-on 30 percig. A dihidroetídium intenzitásának számszerűsítését 15 látómező alkalmazásával végeztük 200-szoros nagyítással.

Statisztikai elemzések

Minden adatot átlag ± félként adunk meg. Feltételeztük, hogy a csoportok nem voltak normálisan elosztva. Ezért több csoport statisztikai elemzését végeztük a nemparametrikus Kruskal-Wallis teszt alkalmazásával, majd a két csoport közötti Mann-Whitney U-tesztet követtük. A P19 értéket a teljes vese 11BHSD2 expressziójával is mértük. Ugyanakkor nem figyeltünk meg különbséget a 11BHSD2 expressziójában a különböző csoportok között (1c. És d. Ábra).

egerek

A szérum aldoszteron koncentrációja ( a ) és renin ( b ), mineralokortikoid receptor (MR) ( c ) és a 11pHSD2 (11BHSD2) mRNS expressziója ( d ). A szérum aldoszteron szintjét öt-kilenc egérben mértük. ( b - d ) A grafikonok az mRNS-expresszió és a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) mRNS-expressziójának arányát mutatják az egész vesében (n = 4). Az adatokat átlag ± sem * P formában mutatjuk be

Szisztolés vérnyomás mérése tudatos egerekben farok mandzsetta módszerrel. Az adatok átlag ± sem n = 6–14. * P

Kreatinin-clearance ( a ), albuminuria ( b ), szérum kálium c ), szérum-nátrium d ), a vizelet káliumszintje e ) és a vizelet nátriumszintje ( f ) egerek 32 hetes kezelés után. Az adatok átlag ± sem n = 6–13. * P

Reprezentatív képek a tubuláris régió periódusos sav-Schiff (PAS) festéséről, a tubuláris régió Sirius vörös festéséről és a glomeruláris PAS régió GAS festéséről ( a ). A grafikonok a tubuláris károsodás pontszámának számszerűsítését mutatják ( b ), glomerulosclerosis c ) és tubuláris intersticiális fibrózis ( d ). A tubuláris károsodást a tubuláris terület PAS festésével azonosítottuk, mint csőszerű vakuolizációt (nyíl) és a kefe szélének elvesztését (nyíl nyíl). Az adatok átlag ± sem n = 6–14. * P

Nefrin kifejezés. a ) Nephrinnel és immunfluoreszcens festéssel reprezentatív kép b ) a jel kvantifikációja a glomeruláris terület százalékában (n = 5–10). ( c ) A grafikonok az mRNS expresszió és a GAPDH mRNS expresszió arányát mutatják (n = 5-7). Az adatokat átlag ± sem * P formában mutatjuk be

Dihidroetídium festés (DHE) ( a ), a DHE festés számszerűsítése b ) és a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD) mRNS expressziója ( c ). A DHE festés mennyiségi meghatározását minden csoportban öt mintán végeztük. ( a ) A DHE-pozitív festés vörös fluoreszcens festést mutat a sejtmagon a glomeruláris (G) és a tubuláris (T) régióban. ( b ) A DHE festési intenzitás számszerűsítése. ( c ) A grafikonok a G6PD mRNS expresszió és a GAPDH mRNS expresszió arányát mutatják (n = 6-11). Az adatokat átlag ± sem * P 20, 21, 22 formában mutatjuk be. Ezért a magas vérnyomás nem használható előfeltételként az aldoszteronizmus elsődleges diagnózisához. Azt is javasolják, hogy a normokalémia ne zárja ki az elsődleges hiperaldoszteronizmus lehetőségét. 23

Megállapítottuk, hogy ebben a vizsgálatban a Cry1, 2 DKO egérben normális sókezelés után és emelkedett vérnyomás hiányában albuminuria alakult ki. Az aldoszteron MR-hez való kötődésével fejti ki hatását. Az MR a vesében főleg a disztális tubulusokban és a gyűjtőcsatornákban fejeződik ki. Alacsonyabb MR-expresszióról számoltak be a glomerulusokban, különösen a 25 mesangialis sejtekben és a podocytákban, 26 amelyekben az aldoszteron közvetlenül hat. Aldoszteronnal és magas sótartalmú egyoldalú nephrectomizált patkányokban a proteinuria a nephrin, a podocitákhoz kapcsolódó fehérje csökkent szintjével társult. A nefrin specifikusan expresszálódik a podocyták membránmembránjában, ezért fontos szerepet játszik a glomeruláris filtrációs gát működésében. Ebben a tanulmányban azt figyeltük meg, hogy a Cry1, 2 DKO egerek csökkent nephrin expressziós szintet mutattak. Ezért azt javasoljuk, hogy a nefrin expressziójának csökkenése a Cry1,2 DKO egerekben a glomeruláris filtrációs gát megszakadását eredményezné, és így legalább részben befolyásolja a vizelet albuminszintjét.

Az egyoldalú nephrectomiát magas só- és mineralokortikoid-expozícióval ötvöző állatmodellekhez képest, ahol a viszonylag rövid ideig tartó kezelés (4-8 hét) súlyos vesekárosodást okozott, beleértve a glomerulosclerosist és a vesefibrózist, 8, 12 vesekárosodást észleltek a normál sóban. kezelt Cry1, 2 DKO egér 32 héten át kevésbé volt súlyos. Ezenkívül még a 32 hetes magas sótartalmú kezelés után sem alakult ki Cry1, 2 DKO egérben glomerulosclerosis vagy interstitialis fibrosis. Ezen megfigyelések alapján nem zárhatjuk ki, hogy a krónikus endogén hiperaldoszteronizmus olyan adaptív mechanizmusokat indukálhat, amelyek korlátozhatják az aldoszteron káros hatásait. Ezek az eredmények tükrözhetik a primer aldoszteronizmusban szenvedő betegek klinikai eredményeit, akiknél gyakran mikroalbuminuria és megnövekedett glomeruláris szűrési sebesség van 31, amelyek adrenalectomia vagy MR blokkoló terápiával is sikeresen kezelhetők. 32, 33, 34 Ezenkívül a súlyos vesekárosodás néhány év múlva feltételezhető. 35

Tekintettel a kriptokrómok cirkadián ritmusban betöltött szerepére, a Cry1,2 DKO egerekben a kriptokróm deléció hatását nem lehet figyelmen kívül hagyni. A magas sóval kezelt CRYHS egerekben megnövekedett vizeletalbuminszintet, csökkent nephrin expressziót és fokozott ROS termelést gátolta a spironolakton kezelés. Így feltételeztük, hogy a Cry1,2 DKO egerek vesekárosodása hiperaldoszteronizmussal társult.

Végül a nephrin expressziós szint és az ROS termelés egerekben a spironolaktonnal kezelt csoportban jobb volt, mint a CRYNS csoportban, és összehasonlítható volt a WTNS csoportéval. A hiperaldoszteronizmus és a só együttes hatásának gátlásán túl a spironolakton önmagában is elnyomhatja a hiperaldoszteronizmus hatását.

Összefoglalva, tanulmányunk kimutatta, hogy az aldoszteron vesére gyakorolt ​​káros hatása független lehet a magas sóknak és magas vérnyomásnak való kitettségtől, de a magas sótartalmú kezelés ezeket a hatásokat rontja. Eredményeink alapján azt javasoljuk, hogy a primer aldoszteronizmusban a vérnyomás-szabályozás nem lehet elegendő a vese védelmére; ilyen esetekben azonban elegendő aldoszteron blokád elegendő lehet a vesék védelmére.