elemeket

absztrakt

A Hashimoto pajzsmirigy-gyulladása (HT), amelyet a pajzsmirigy elleni autoantitestek termelése jellemez, lokalizált autoimmun betegség. Kimutatták, hogy a HT 55% -ban egyetértett a monozigóta ikrekben. 1 Repplinger és mtsai. 2 azt állítja, hogy a nők körében magas a HT előfordulási gyakorisága, ami hétszer magasabb, mint a férfiaknál. A betegség patogenezisében különféle genetikai és környezeti tényezők vesznek részt. 3 Köztudott, hogy a HT során bekövetkező krónikus gyulladás a citokinek és más gyulladásos mediátorok szintjének jelentős növekedését okozza, ami végül a pajzsmirigy pusztulásához vezet. 4 Pontosabban, több gén és környezeti tényezők kölcsönhatása növelheti a HT érzékenységét és a betegség súlyosságát. 5.

A poli (ADP-ribóz) polimeráz-1 (PARP-1) a gyulladásos helyzetek patogeneziséért felelős jelölt gének egyike. Úgy gondolják, hogy a PARP-1 fontos szerepet játszik a DNS-helyreállítási útvonal elindításában, bár aktivációjának magas szintje összefüggésben van a megnövekedett apoptózissal is. Nemrégiben bebizonyosodott, hogy a PARP-1 inhibitorokat alkalmazó PARP-1 knockout állatmodellekben a gyulladásos betegségek kialakulása és progressziója megszakadt. 6, 7 Számos tanulmány eredményei azt mutatták, hogy a PARP-1 inaktiválása megvédi az endotoxikus sokkot, a vastagbélgyulladást, a tüdőgyulladást és más betegségeket, például a traumás agysérülést, az agyi és a szívizom ischaemiáját, agyvérzést, a reumás ízületi gyulladást és a diabetes mellitushoz társuló szívet. betegségek. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Bár a PARP-1 pontos szerepe a gyulladásos kaszkádban még nem ismert, a PARP-1-en végzett összes rendelkezésre álló tanulmány arra utal, hogy ez a gén erős jelölt és genetikai tényező a HT fejlesztéséhez.

A (1q41-43) kromoszómán elhelyezkedő PARP-1 génről (OMIM 173870) kimutatták, hogy olyan allélpolimorfizmusokat tartalmaz, amelyek különböző betegségek iránti fogékonysággal társulnak, amelyek közül néhány gyulladásos. Ezenkívül több transzkripciós faktor kötőhelyet azonosítottak a PARP-1 gének promóter régiójában; ezért a régió genetikai változatai befolyásolhatják a PARP-1 expressziót. 17 A promóter régióban számos variánst (C410T (rs2793378), Poly (A) n, C1362T és G1672A (rs7527192)) azonosítottak, és számos olyan tanulmány létezik, amelyek megvizsgálták e promóter polimorfizmusok és számos betegség patogenezisének kapcsolatát. Cottet és munkatársai azonosították a T2444C (rs1136410) (más néven Val762Ala) helyét, amely a 17. exonban T-ben C-t, Val-tól Ala-ig változást okoz. 18 Wang és munkatársai szerint a T2444C polimorfizmus azáltal csökkenti a PARP-1 enzimatikus aktivitását,

Ebben a tanulmányban arra kerestük a választ, hogy a PARP-1 gén két promóter-polimorfizmusa (rs2793378 és rs7527192) és egy aktív hely polimorfizmusa (rs1136410) hajlamosíthatja-e az egyéneket a HT-betegségre a török ​​női populációban.

Betegek és módszerek

Tanulmányi tárgyak

Száz negyvenegy nőt vontak be ebbe a tanulmányba, akiknél HT-t diagnosztizáltak az isztambuli Cerrahpasa Orvostudományi Egyetem endokrin és anyagcsere-betegségek ambulanciáján. A kontrollcsoport százötven egészséges, hasonló átlagéletkorú nőből állt. A vizsgálatban való részvétel kizárási kritériumai között szerepelt a terhesség, a dohányzás, a vényköteles vagy vényköteles gyógyszerek használata, valamint olyan autoimmun betegség, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményeit.

Bár a törökök etnikailag sokfélék, Isztambul európai oldala minden esetet és ellenőrzést gondosan kiválasztott annak biztosítására, hogy minden egyén török ​​származású legyen. A vizsgálat minden résztvevője nem volt kapcsolatban, és aláírt, tájékozott beleegyezést nyújtott be a minta és az adatgyűjtés előtt. A vizsgálati protokollt az Isztambuli Egyetem Cerrahpasa Medical School intézményi etikai bizottsága hagyta jóvá.

A PARP-1 polimorfizmusok genotipizálása

A vizsgálati alanyok genomi DNS-ét etanolos kicsapási módszerrel izoláltuk. A DNS-koncentrációt és tisztaságot NanoDrop spektrométereken (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) mértük és 260/280 nm optikai sűrűséggel határoztuk meg. A PARP-1 C410T és G1672A genotípusokat restrikciós fragmens hossza polimorfizmus (RFLP) módszerrel határoztuk meg. A polimorf helyek amplifikálásához használt primerek: F: 5'-TCCAGTGGCACTATCAT-3 'és R: 5-GTTGTGAGACATAGGCCGAATC-3' az rs2793378 esetében, és F: 5'-GCGAGACCCTGTCCCTAA-3 'és R: 5-TCTTTTTTTT 16.

Az amplifikációs termékek 298 bázispár (bp) fragmentumot eredményeztek az rs2793378 esetében, és egy 187 bázispár méretű fragmenst az rs7527192 esetében. Tíz mikroliter rs2793378 amplifikációs terméket emésztettünk egy egység Hpy31-gyel (Dde I) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), 12 órán át 37 ° C-on inkubáltuk és 30 percig 120 V-on 3% agarózon elektroforáztuk. gél. A közös allél (amelyet a CC genotípus képvisel) homozigozitását a 145 és 109 bp sávok, míg a variáns allél (a TT genotípus képviseli) homozigozitását a 127 és 109 bp sávok jelzik. Tíz mikroliter rs7527192 amplifikációs terméket emésztettünk egy egység Bsh1236I-vel (BstUI) (MBI, Fermentas, Vilnius, Litvánia), 12 órán át 37 ° C-on inkubáltuk és 3% -os agarózgélen elválasztottuk. A közös allél (amelyet a GG genotípus képvisel) homozigozitását a 152 és 35 bp sávok, míg a variáns allél (az AA genotípus képviseli) homozigozitását egyetlen 187 bp sáv képviselte, mivel ez a polimorfizmus elpusztítja a a Bsh1236I restrikciós helye. 20

Az rs1136410 esetében a PCR-körülményeket 95 ° C-on 4 percig állítottuk be denaturálás céljából, majd 35 ciklusban 94 ° C-on 30 másodpercig, 62 ° C-on 45 másodpercig és 72 ° C-on 45 másodpercig az izzítási lépésnél, majd egy végső meghosszabbítás 72 ° C-on 10 percig. Az alkalmazott primerek a következők: közvetlen 5'-TGAGGAAGGCCTGACCCTGT-3 'és az 5'-TGACCAGCAGGAGGGTTTGC-3' primer. Az rs1136410 szekvencia változását kétirányú szekvenálással határoztuk meg. Az amplikon szekvenciákat a CLC 3.6.1 munkapad segítségével értékeltük (Dánia).

Haplotípus elemzés

Haplotípusokat genotípus adatokból állítottak elő. A kötési egyensúlyhiány (LD) és a haplotípus elemzését a Haploview 4.2 alkalmazásával végeztük, amely az elvárásmaximalizálás (EM) algoritmust használja.

Adatfeldolgozás és elemzés

az eredmény

Vizsgálati populáció

Összesen 141, 39-55 éves (átlagosan 48,9 év) Hashimoto thyreoiditisben szenvedő beteget és 150 37-54 éves (átlagosan 46,6 éves) kontrollt vontak be ebbe a vizsgálatba. Nem volt szignifikáns különbség az esetek életkora és a kontrollok között.

Ebben a vizsgálatban a HT-ben szenvedő betegeknél a pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH), az antiTPO és az antiTG antitest átlagos szintje 8,3 ± 6, 8 μIUU/ml, 806, 7 ± 447, 3 NE/ml és 382, ​​7 ± 207,4 volt. NE/ml. A kontroll alanyok TSH, AntiTg és AntiTPO antitest szintje 2,8 ± 1,2, 2 NE/ml, 65,4 ± 59,7 NE/ml és 27 ± 15,8 NE/ml volt. A HT betegek, a TSH, az AntiTPO és az AntiTG antitest szintje statisztikailag magasabb volt, mint a kontroll csoport, a vártnál (P = 0, 0305, 0, 0296, 0, 0242).

141 HT beteget és 150 kontroll alanyot vizsgáltak az rs2793378, rs7527192 és rs1136410 vonatkozásában. Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a betegek és a kontrollok között az átlagos életkor (41, 1 ± 11, 7 év, P = 0,352), nem (minden nő, P = 0,881) és etnikai származás (török) tekintetében, ami hogy a csoportok közötti megfelelő frekvencia.

A PARP-1 SNP megoszlása ​​HT-ben

Az rs2793378, rs7527192 és rs1136410 genotípusok megoszlása ​​a kontroll csoportban HWE volt. Az összes vizsgált polimorfizmus genotípus-eloszlását és allélfrekvenciáját az 1. táblázat mutatja.

Asztal teljes méretben

Jelentős összefüggést találtunk a PARP-1 rs1136410, rs7527192 és HT között. Az rs1136410 heterozigóta TC genotípus gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a kontrollokban a betegekhez képest (OR: 2, 504, 95% CI: 1, 48–4, 23, P = 0,001). Ezenkívül az rs1136410 C allél gyakoriságát statisztikailag magasabbnak találták az egészséges csoportban (OR: 1632, 95% CI: 1, 1-2, 403, P = 0,013), és az rs1136410 a Bonferroni-korrekció után megőrizte jelentőségét. Az rs7527192 heterozigóta GA genotípus gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a kontrollokban (OR: 1, 633, 95% CI: 1, 017-2, 623, P = 0,042), mint a betegeknél. Ezenkívül az rs7527192 A allél gyakoriságát statisztikailag magasabbnak találták az egészséges csoportban (OR: 1,492, 95% CI: 1, 039-2, 122, P = 0,03); bár sem a GA genotípus, sem az rs7527192-ből származó A allél nem tartotta fenn a jelentőségét a Bonferroni korrekció után. Ezenkívül az rs1136410 C-allélje nem mutatott szignifikanciát a Bonferroni-korrekció után, a PARP-1 rs2793378 pedig nem mutatott védő vagy veszélyes hatást HT-betegségben. Minden eredményt az 1. táblázat mutat be.

A PARP-1 SNP haplotípus-elemzése

Megvizsgáltuk azt is, hogy ez a három polimorfizmus kötődik-e egyensúlyhiányba, és vannak-e olyan általános haplotípusok, amelyek betegségekkel és ritka haplotípusokkal társulnak (5% -os gyakorisággal).

A CGC haplotípus prevalenciája szignifikánsan magasabb volt a kontrollokban (az esetek aránya a kontrollokhoz: 0,061: 0, 146, P = 0, 0252, x 2 = 5,01), amint azt a 2. táblázat mutatja. A CGC haplotípus első markere, C- Az allél vad típusú az RS2793378-hoz. A CGC haplotípus második markerje, a G allél vad típusú az rs7527192 esetében. A harmadik marker, a C allél mutáns az rs1136410 esetében. A különbség egy harmadik marker, a C allél rs1136410 alapján történt, amely védőfaktorként szolgál. Mivel azonban ez a vizsgálat kis mintaméreten alapult, Bonferroni-korrekciót használtunk az I. típusú hiba csökkentésére.A Bonferroni-korrekció után a haplotípus-elemzés nem mutatott szignifikanciát. Ezenkívül a PARP-1 két SNP-je (rs1136410 és rs7527192) erős LD-ben volt (1. ábra).

társulása

A nem egyensúlyi diagram páros eltérése a vizsgált PARP-1 SNP-knél. Az r 2 magasabb értéke sötétebb színt jelöl. A PARP-1 rs2793378 kromoszóma helye 226597341, az rs7527192 hely 226596079 és az rs1136410 hely 226555302.

Teljes méretű kép

PARP-1 SNP genotípusok kombinált elemzése

A 3., 4., 5. táblázat összefoglalja az asszociációs vizsgálatokat a három SNP kombinált genotípusai és a HT teljes kockázata között. A PARP-1 rs2793378 és rs7527192 SNP-k statisztikai szignifikanciát mutattak a kombinált genotípusok között HT-betegek és a kontrollok között. A CC/GA, CT/GG és TT/GA genotípusok együttes gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a kontrollcsoportban a HT csoporthoz képest a kombinált CC/GG genotípushoz képest (OR: 2, 956, 95% CI: 1, 114–7, 840, P = 0,027, OR: 2, 66, 95% CI: 1, 13 - 6, 259, P = 0, 023, VAGY: 4, 644, 95% CI: 1, 455 - 14, 822, P = 0, 007). A Bonferroni korrekciója után csak a kombinált TT/GA genotípus maradt szignifikáns, és azt találták, hogy szignifikáns védő faktor a HT-betegség ellen (P = 0,007), amint azt a 3. táblázat mutatja.

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

A fenti eredményektől eltekintve nem volt más szignifikáns különbség az rs7527192-rs1136410 és rs2793378-rs1136410 többszörös összehasonlítása között HT betegeknél és kontrolloknál (4. és 5. táblázat).

vita

Pajzsmirigy-asszociációs (GWAS) vizsgálatok alapján egyértelmű, hogy a genetikai tényezők fontos tényezők a pajzsmirigy működésében és az autoimmunitásban. A közelmúltban kiderült, hogy a VAV3 intronikus változata (vav3 guanin nukleotidcserefaktor, rs12126655) társult a TSH-koncentrációkhoz, és egy másik variáns (rs2071403), amely a kiindulási TPO transzlációs helyhez közel 75 bp-ig helyezkedik el, szignifikánsan társult a plazma anti-TPO antitesttel . A HLA-DPB2 (rs733208) egy másik intronikus változata szintén társult az anti-TPO antitestek pozitivitásával. 21 Eriksson és mtsai. 22 összefüggést mutatott ki a hypothyreosis és az autoimmun pajzsmirigy betegség között az SNP-kkel a HLA I. és II. Osztályú régióiban (rs2517532 és rs2516049, illetve) és a CAPZB (Z-vonalú izom bezáró fehérje (aktinrost), béta, rs1209EB47 Gs) közelében. foszfodiészteráz 8B, rs4704397) és CTLA-4 (toxikus T-sejt antigén-4, rs231779). Jelölt génvizsgálatok alapján a CTLA-4 széles körben társul számos más autoimmun betegséggel, beleértve az autoimmun hypothyreosisot is.

Ezenkívül olyan variánsokat is azonosítottak, mint a FOXE1, a pajzsmirigy transzkripciós faktor, mint az elsődleges hypothyreosis genetikai kockázati tényezői. A FoxE1 által készített GWAS-ban felvetették, hogy a FoxE1 és a PARP-1 vegyen részt az emberi NIS represszor komplexben, amely egy pajzsmirigyrákban található transzaktív transzkripciós represszor, amely PARP-1-et tartalmaz és poli (ADP-ribosil aktivitása) révén működik. . Ezért a PARP-1 erős és alkalmas jelölt gén a pajzsmirigy autoimmunitásában genetikai tényezők közötti asszociációk azonosítására.

Számos tanulmány határozottan alátámasztja azt a tényt, hogy a PARP-1 fontos szerepet játszik az autoimmun gyulladásos megbetegedésekben. A PARP-1 inhibitorokat vagy PARP-1 deléciókat számos olyan terápiás megközelítésben alkalmazzák, amelyek szöveti blokádon vagy szisztémás gyulladáson alapulnak. Nemrégiben alternatív útvonalakat javasoltak, amelyek magukban foglalják a PARP-1 képességét a gyulladással összefüggő gének transzkripciójának szabályozására. Több friss publikáció azt mutatja, hogy a PARP-1 magfehérje szabályozza a gyulladásos mediátorok transzkripcióját és szintézisét. Ezenkívül a PARP-1 aktivitás és a gyulladás kapcsolatát alaposan megvizsgálták, és a gyulladással való összefüggést szilárdan megalapozták a PARP-1 aktivitás farmakológiai gátlásán keresztül, amely enyhítette a gyulladásos választ. 6, 30 A PARP-1 aktivitás gátlása gyulladásos állapotok széles körében védő, mint például szív- és érrendszeri betegségek, cukorbetegség, rheumatoid arthritis és stroke. 13., 31. Ezért a PARP-1 gén erős jelölt lehet a kiütéses egerekben végzett megfigyelések alapján, és ígéretes terápiás megközelítést nyújt a gyulladásos betegségekhez PARP-1 inhibitorok alkalmazásával. .

Alternatív megoldásként a PARP-1 fehérje koncentrációját a promoter aktivitásának közvetlen szabályozásával lehet szabályozni. Ezért a promóter régió polimorfizmusai szintén befolyásolhatják a PARP-1 aktivitást. A promóter régióban több transzkripciós helyet azonosítottak, valamint 3 CCAAT/TATA doboz készletet, amelyek kötési helyet biztosítanak az YY1 transzkripciós faktorokhoz. Ezen kívül négy szekvenciaváltozatot azonosítottak ebben a régióban: rs2793378, Pol (A) n, C1362T és rs7527192. Infante és munkatársai, 32 szerint a heterozigóta állapotban lévő C410T polimorfizmus növelte a Parkinson-kór kockázatát, míg az rs7527192 heterozigozitása jelentősen késleltette a betegség kialakulását. Ebben a tanulmányban nem találtunk jelentőséget az rs2793378 vonatkozásában.

A közelmúltban az rs2793378, rs7527192 és rs1136410 vizsgálatokat számos gyulladásos autoimmun betegségben tanulmányozták, beleértve RA, 16 AR, 33 asztma, 34 nephritis és ízületi gyulladás SLE 35-ben szenvedő betegeknél és Alzheimer-kórban szenvedő betegeknél, 36, 37, a fentiek szerint. Vizsgálatunk során kiderült, hogy a PARP-1 rs7527192 heterozigóta GA genotípus védő hatással van a török ​​populáció HT-betegségére. Ez összehasonlítható Infante és munkatársai eredményeivel, amelyek azt mutatták, hogy bizonyos promoter variációk (rs2793378 és rs7527192) összefüggenek a Parkinson-kór elleni védelemmel. Korábban azt is megállapítottuk, hogy a heterozigóta rs7527192 genotípus szignifikánsan összefügg az allergiás náthára (AR) való hajlammal a török ​​lakosságban. Ezenkívül ebben a vizsgálatban az rs2793378 - rs7527192 kombinált genotípusok többszöri összehasonlítása alapján a kombinált TT/GA genotípus gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a kontrollokban a HT csoporthoz képest, a kombinált CC/GG genotípushoz képest. A Bonferroni-korrekció után továbbra is csak a TT/GA genotípus mutatott szignifikanciát védő faktorként. Amikor az rs2793378 mutáns formáját és az rs7527192 heterozigóta formáját kombináltuk, szignifikáns védőhatást figyeltünk meg HT betegeknél.

Kimutatták, hogy a PARP-1 promóter haplotípusai bizonyos krónikus gyulladásos betegségekre, például AR, RA és coeliakia iránti érzékenységre is képesek. Kimutatták a PARP-1 gén polimorfizmus haplotípusának az Alzheimer-kórra gyakorolt ​​védő hatását is. 37 rs2793378, rs7527192 és rs1136410 haplotípushoz nem társult megnövekedett AR-kockázat. 33 Pascual és mtsai. A PARP-1 16 haplotípusa (−410, −1327, CA mikroszatellit ismétlés) szerepet játszik a RA érzékenységében a spanyol populációban, míg az rs7527192 variáns nem tűnik ennek a haplotípusnak a része. Noha a C (Ala) rs1136410 allél alapján a CGC haplotípusnak védő hatása volt, nem élte túl a Bonferroni korrekciót.

Az rs1136410 a teljes populáció körülbelül 5-33% -ában van jelen. Korábban beszámoltunk arról, hogy az rs1136410 T (Val) allélje az asztma fokozott kockázatával jár. Ezenkívül az rs1136410 jelentősen összefüggésbe hozható az ischaemiás szívbetegséggel, amely szintén gyulladásos folyamat. 39 Hur és mtsai. 35 kimutatta, hogy a nem szinonim változat + 40329T → C (V762A) az SLE-ben szenvedő koreai betegeknél is szignifikánsan összefügg az ízületi gyulladás fokozott kockázatával. Onaran és munkatársai szerint azonban a 40 rs1136410 nem társult a rheumatoid arthritis kockázatával. A Val762 PARP-1 rs1136410 variánsokról azt is megállapították, hogy növelik a diabéteszes polineuropátia kockázatát 1-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél. Ezenkívül azt találtuk, hogy a heterozigóta TC (Val/Ala) rs1136410 genotípus a Bonferroni korrekció után is védő hatást gyakorolt ​​a török ​​populáció HT érzékenységére.

Úgy gondolják, hogy a PARP-1 és a kappa B nukleáris faktor (NF-κB) fontos szerepet játszik a gyulladásos megbetegedésekben. Kimutatták, hogy a PARP-1 az NF-κB koaktivátoraként működhet a sejt gyulladásos folyamatai szempontjából. Ezek a megállapítások új betekintést nyújtottak a különféle gyulladásos betegségek, például a HT patogenezisébe. Korábban beszámoltunk arról, hogy az rs28362491 NF-κB deléció allél gyakorisága, amely az interleukin-6 (IL-6) magas szintjét kíséri, szignifikáns volt a HT-betegek csoportjában. 43 Ez a tanulmány korábbi kutatásainkra épít.

Ezenkívül szem előtt kell tartani, hogy a kis mintanagyság, amely befolyásolhatta elemzéseink statisztikai erejét, a vizsgálat korlátozásának tekinthető. Bár egy alacsony statisztikai erővel rendelkező vizsgálatnak kisebb az esélye a valós hatás feltárására, a kis mintamérettel rendelkező eset-kontroll vizsgálatokat továbbra is széles körben használják, és felhasználhatók a mintában korábban azonosított jelölt területek értékelésére és a szelekciós célok pontosabb azonosítására., nagyobb minta vagy replikációs vizsgálat bizonyosságot nyújt a további vizsgálatokhoz.

A PARP-1 több transzkripciós faktor aktiválásához szükséges számos mediátor gyulladásával. Feltételezték, hogy a PARP-1 heterozigóta rs1136410 genotípus miatti eltérő kötődési és aktiválási mechanizmusa befolyásolhatja a gyulladásos válaszban részt vevő gének expresszióját, esetleg megváltozott gyulladásos úton. Ezért ez a polimorfizmus védőhatást nyújthat a HT ellen. Ez a hipotézis azonban még további vizsgálatokat igényel.

Összefoglalva, lehetséges, hogy a PARP-1 génvariánsok kölcsönhatásai kulcsfontosságú szerepet játszanak a HT-betegség gyulladásos reakciója során bekövetkező különféle változások megszervezésében. Mindazonáltal replikációs vizsgálatokra vagy más funkcionális vizsgálatokra van szükség nagyobb mintamérettel, hogy megerősítsük ezen PARP-1 génvariánsok feltételezett védő szerepét. Pontosabban, nagyobb, különféle etnikai csoportokat bevonó tanulmányok és replikációs vizsgálatok erősen ajánlottak a PARP-1 polimorfizmusok (különösen az rs1136410 TC) és a HT kialakulása, valamint a betegség prognózisa közötti összefüggés helyes meghatározásához.