absztrakt
A fő
Teljes méretű kép
Vizsgáltuk a PKA izoenzim eloszlását (1c. Ábra). Cc, mutáns Ct - m, RI és transzfektánsok esetében a PKA-I szint 1,5-szeresére nőtt anélkül, hogy megváltoztatta volna a PKA-II szintet. Az RII és a transzfektánsokban a PKA-I szint 40% -kal csökkent, a PKA-II szint pedig megduplázódott. A RII p és RII p-P transzfektánsok szignifikánsan csökkentették a PKA-I szintet (a szülői sejtek szintjének 25% -ára), és megduplázták a PKA-II szintet. Így az R1a vagy C7 túlzott expressziója nem tudta elnyomni a PKA-II expressziót, míg az RIIa, RIIp vagy RIIp-P túlzott expresszió szignifikánsan csökkentette a PKA-I expressziót, ami a PKA-I-hez képest kedvező PKA-II termelést jelzett (Otten és McKnight, 1989, Otten et al., 1991; Nesterova és mtsai, 1996; Lee és mtsai, 1999). Figyelemre méltó megállapítás, hogy a mutáns RIa-P, ellentétben a vad típusú RIa-val, elnyomhatja a PKA-II-t (1c. Ábra, RIa-P), amint azt korábban más rákos sejtekben is bemutatták (Lee és mtsai, 1999). a mutáns Ria-P iránti magasabb affinitás Ca-hoz, mint Ria, RIIa vagy RIIp (Lee és mtsai, 1999).
A RII p és RI a-P sejtek növekedését mutatták az apoptotikus sejtmagokban (1d. És e. Ábra). Ezenkívül ezek a sejtek szabályozták az antiapoptotikus Bcl-2 fehérjét; szabályozott Bax, Bak és Bad proapoptotikus fehérjék; és fokozott gyenge hipofoszforiláció (1f. ábra), ami azt jelzi, hogy az apoptózis rossz foszforilációként való elősegítése antiapoptosishoz vezet (Harada et al., 1999).
Vizsgáltuk a PKA alegység géntranszfektánsok növekedési tulajdonságait in vitro és in vivo. Egyrétegű tenyészetben az RIIp és R1a-P transzfektánsok 80% -os növekedésgátlást, az RIIa és RIIP-P transzfektánsok enyhe növekedésgátlást mutattak (1g. Ábra). Ezzel szemben az R1a, Cc - m, Ca vagy csak vektor transzfektánsok azonos vagy gyorsabb ütemben növekedtek, mint a szülői kontroll sejtek. Ezenkívül meztelen egérmodellben az in vivo tumor növekedése szignifikánsan csak az RIIp és RI α-β transzfektánsokban csökkent (1h ábra).
Az RIIp és RI α-β-transzfektánsokban megfigyelt tumor növekedés in vivo gátlása korrelált a sejtmorfológiájukban a sejttenyészet in vitro változásával. A nem transzfektált szülői sejtek kerek formájú morfológiát mutattak, főként egy nagy, kis citoplazmával rendelkező magot mutattak, és akkumulációval nőttek (1j ábra). Jelentős változások következtek be a sejtmorfológiában az RII β és RI α-β sejtekben. Ezek a sejtek nagy vagy elhúzódó lapos fenotípust mutattak, amely hasonlított a korábban leírt lapos revertánsra (Noda et al., 1985). Mindkét sejt megnagyobbodott citoplazmát és kisebb magot mutatott, ami megnövekedett citoplazma és a mag arányt eredményezett, és finoman nőtt (1j ábra). Az összes többi transzfektáns - Ca, Cc - m, RIIa, RIIa és RIIp - P - morfológiája hasonló volt a parenterális nem fertőző szerekhez (1j ábra).
Teljes méretű kép
A PKA C és RII p génekkel transzfektált PC3M sejtekben megváltozott gének északi elemzése. A teljes sejtes RNS-t parenterális és transzfektált PC3M sejtekből állítottuk elő Rneasy Midi Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), elektroforézis, nejlon membrán blot alkalmazásával, és Northern blot elemzésnek vetettük alá (Nesterova et al., 1996). Az adatok két független kísérlet egyikét jelentik, amelyek hasonló eredményeket adtak. A megfelelő géneknek megfelelő specifikus cDNS-fragmenseket állítottunk elő PCR-rel. TGFBR3, transzformáló növekedési faktor, béta receptor III; AKT2, 2 v-hatású egér thymoma vírusos onkogén homológja; MMP-1, mátrix metalloproteináz 1; RBBP2, retinoblastoma-kötő fehérje 2; PAI2, plazminogén aktivátor inhibitor, II. AOE372, tioredoxin-peroxidáz
Teljes méretű kép
Tehát az RII β által kiváltott tumor megfordítása magában foglalhatja a sejtciklus deregulációját, amely sejtciklus leállításához vezet, valamint apoptózis indukcióhoz (1d-f. Ábra). Meglepő módon a sejtdifferenciálódásban részt vevő gének klaszterét indukálták az RII-β-újra expresszáló sejtekben, és ezek a gének változatlanok voltak a C18-repressziós sejtekben (2c. És 3. ábra). A CREB-célzott gének genomikai elemzésének nemrégiben végzett vizsgálata feltárta a cAMP-érzékenység nukleáris promóterének szükségességét (Conkright et al., 2003). Lehetséges, hogy az RII β sejtekben indukált differenciálódási gének célpontjai lehetnek az RII β által közvetített génindukciónak (Srivastava et al., 1998), akár közvetlenül, akár közvetve a CRE/CREB-en keresztül. Ezen differenciálódási gének további jellemzése rávilágít a PKA jelátvitel mechanizmusára a tumorsejtek apoptózisában/differenciálódásában.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az R1a- és C-represszív sejtek, amelyek szabályozott PKA-I-t tartalmaznak, olyan változásokat mutattak a génexpressziós profilban, amelyek ellentétesek voltak a főleg PKA-II-t tartalmazó p-re-expresszáló RII-sejtekével. Így a cDNS mikrorajzok pozitív és negatív cAMP jelzést mutattak ki a tumorsejtek növekedésére, amelyet a PKA szabályozó alegységek differenciális expressziója indukált.
Ezután konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk a Cp és az RIIp intracelluláris lokalizációját (4a. Ábra). A szülői sejtek, valamint a C-, R1a és R1- és -P-túlexpresszáló sejteket tartalmazó sejtek mindegyikében a Cα festés (zöld) és az RIIB festés (vörös) volt, amely kizárólag citoplazmatikus volt; A C és RII p kolokalizációját az átfedő képen látható módon (sárga) mutatjuk be. Ezekben a transzfektánsokban kevés sejt mutatott egy tiszta helyet a C és RII p festésben, amely az átfedésben sárga volt, és amelyet megerősítettek a mag metszeteinek vizsgálatával. Ezenkívül az R1- és -expressziós sejtek a perinukleáris régióban koncentrálódva expresszálták a Cα és RIIβ festést, míg az R1a-β-t túlzott mértékben expresszáló sejtek növelték az RIIβ festést az egész citoplazmában és a mikrotubulusokat szervező látszólagos központban.
Teljes méretű kép
Az RII p-represszív sejtek megnövekedtek. Kevesebb sejt volt jelen, amely az egyik ilyen. Ami a legfontosabb, ebben az átfedéses nézetben az α és az RII p teljesen kolokalizálódott. Az RIIp és a C7 szubcelluláris kolokalizációja nem korlátozódott az apoptotikus RIIp sejtekre. Amikor az RII β sejtek Zn 2+ kezelés hiányában csak korlátozott mennyiségű RII β-t expresszáltak (LTR-vezérelt transzkripció (Nesterova és mtsai., 1996)), ahol a sejtek proapoptotikusak voltak, Ca és RII β kolokalizációt szintén megfigyelték (4b. ábra), jelezve, hogy a Ct-RIIp kolokalizáció megakadályozza a sejtek apoptózisát. Így az RIIp túlexpressziós szekvenciák a cc-t a holoenzimben RIIp-vel blokkolják a C-aktivációt, és megváltozott cAMP-jelzéshez vezetnek ezekben a sejtekben. Bámulatos, hogy a Cα és az RII ß erős festése behatolt a magba, amit megerősített egy metszési metszés, amely inkább a magban volt, nem pedig annak közelében, vagy a magmembrán behatolása miatt. Ez a Ca fizikai blokkolása, amelyet az RII ß okoz a sejtmagban, megmagyarázhatja a C és RII β transzfektánsok legalább részben ellentmondó expressziós profilját, amelyet a DNS mikrorakatok mutatnak be. Az RIIp-P vagy RIIa túlzottan expresszáló sejtek Ca és RIIP festést mutattak, utánozva a szülői sejteket, de nem RIIp-t expresszáló sejteket.
vita
Vizsgálatunk során a PKA szabályozó és katalitikus alegységeinek vad típusú és mutáns formáit túlexpresszáltuk a PC3M prosztatarák sejtjeiben, és összehasonlítottuk az izozimképződésre, a sejtmorfológiára, a sejtproliferációra, a génexpresszióra és a tumor fenotípusára gyakorolt hatást. Az I típusú PKA-ban a cAMP-kötő mutáció funkcionális jellemzését alaposan tanulmányozták (McKnight és mtsai., 1988), míg az RI és a pszeudofoszforilációs hely alegységeinek (Taylor és mtsai, 1988) funkcionális elemzését alig vizsgálták (Durgerian és mtsai., 1988). Taylor)., 1989, Lee és mtsai, 1999). RI és egy mutánst, az R1a - P-t használtunk, amely G → T pontmutációval (Durgerian és Taylor, 1989; Lee és mtsai, 1999) autofoszforilációs helyet (ala → ser) szerez az RII funkcionális utánzásához. Ugyancsak használtuk az RII β mutánst, az RII β-P-t, amelyből hiányzik az autofoszforilációs hely (ser → ala) egy T → G pontmutációval (Budillon et al., 1995). C és mutáns esetében az N-terminális mirisztát hiányzó mutánst, a Cc-m-t használtuk, amelyről kimutatták, hogy ugyanolyan aktív, mint a vad típusú C, és aktiválja a PKA-t a sejtben (Clegg et al., 1989), míg a vad típusú Cpa-val ellentétben nem képes kiválasztódni az extracelluláris térbe (Cho és mtsai, 2000).
Eredményeink azt mutatták, hogy az RIIa-, RIIp- és RIIp-P sejtek túlexpresszálják a PKA-II-t és szinte teljesen megszüntetik a PKA-I-t, míg az R1a-, C7- és C7-m-túlexpresszáló sejtek növelik a PKA-I-t, de a PKA-t nem tudtam elnyomni -II. Legfőképpen az RIa-P-t túlzott mértékben expresszáló sejtek, az RII funkcionális utánzói fokozták a PKA-I-t és jelentősen csökkentették a PKA-II-t. Kimutatták, hogy a PKA-II a PKA-holoenzim előnyösebb formája a PKA-I-vel szemben (McKnight et al., 1988). Az R1a egyetlen pont mutációja az R és C kölcsönhatás helyén, azaz a pszeudofoszforilációs helyen (Taylor és mtsai., 1988) PKA-I-t (PKA-I-t tartalmazó RIa-P-t) kapott, amely funkcionálisan utánozta a PKA-II-t, és mint eredmény, túlexpressziója elnyomja az endogén PKA-II-t.
A klasszikus biokémiai analízis, a DNS-mikrotömbök és a konfokális mikroszkópia eredményeink azt támasztják alá, hogy a RKA szabályozó alegységhez kötött és a PKA-I holoenzimet alkotó PKA katalitikus C alegység hajlamos a sejtben történő aktiválódásra, és sokféle aktivációt okoz tumorsejt-növekedési gének; Ezzel ellentétben, amikor a C alegységet a PKA-II holoenzim komplex ketrecébe helyezik az RIIp szabályozó alegységhez való kötődés révén, a C alegység aktiválása korlátozott, ami a tumor növekedésének elnyomásához és egy fordított fenotípus indukciójához vezet.
A PKA holoenzim rendszer egyik legérdekesebb aspektusa, hogy egy sejt képes kétfajta kinázt fenntartani a sejtben - a PKA-I és a PKA-II -, és megvédi a C alegységet az R alegység előfordulásától. A karcinogenezis kezdetén a PKA-I növekszik az adenilát-cikláz és a cAMP szintjének növekedésével a sejtben (lásd Boynton és Whitfield, 1983). Nyilvánvaló, hogy a PKA-I: PKA-II arányának rendellenessége egy sejtben kóros/veszélyes jel, amely olyan betegségeket okozhat, mint a rák. Így jelenlegi tanulmányunk azt sugallja, hogy a protein-kináz A izozim-váltás, differenciális cAMP-jelátvitel indukálásával a sejtben, génterápiát nyújthat a tumor-cél prosztata PC3M és más daganatok alapján.
köszönöm
Köszönet Cheryl Pellerinnek, a Palladian Partners, Inc.-től, aki szerkesztői támogatást nyújtott az Országos Rákintézetnek az N02-BC-76512/C2700212 szerződés alapján.