mikrokimerizmus

  • absztrakt
  • A fő
  • mód
  • Betegek.
  • Szövetgyűjtemény.
  • Kvantitatív RT-PCR.
  • HLA meghatározása.
  • AZ EREDMÉNYEK
  • VITA
  • szójegyzék

absztrakt

A terhesség alatt kisszámú sejt jut át ​​az anya és a magzat között, és ez a transzfer kiméra állapothoz vezethet, amely évek óta fennáll mindkét egyénben. A magzati és az anyai mikroimimerizmust (MMc) különböző autoimmun rendellenességekkel társították. Az egészséges egyének szöveteiben az MMc-re vonatkozó információk ritkák, de fontosak az anyai sejtek felkutatásában bizonyos betegségek érintett szöveteiben. A vizsgálat célja az anyai sejtek előfordulásának vizsgálata volt 20 egészséges, 2-15 éves gyermek mandulájában és adenoidjában. Minden gyermeket megoperáltak visszatérő torokfájás vagy légúti elzáródás miatt. Az MMc-t RT-PCR-rel detektálták az anya és a gyermek közötti génpolimorfizmusok különbségei alapján. 20 gyermek közül négynél találtunk anyai sejteket mandulákban és/vagy adenoidokban. Ez a gyakoriság alacsonyabb, mint az egészséges felnőttek perifériás vérében talált anyai sejtek gyakorisága, de összhangban van az anyai kiméra korábban közölt gyakoriságával a kontroll szövetekben.

A fő

Az anyai és magzati sejtek kétirányú áthaladása a placentán kiméra állapothoz vezethet, amely évekig fennáll az anyában és utódaiban (1, 2). Ezeknek a szemiallogén sejteknek a funkciója és jelentősége ismeretlen. Bár a magzati mikrokimerizmus következményei (az anyában kis számú magzati sejt) nem ismertek, úgy gondolják, hogy a magzati sejtek részt vesznek az autoimmun rendellenességek kiváltásában (3-7), vagy a szövetek helyreállítási folyamataiban részt vevő fiatalító forrásként működnek. (8, 9). Más jelentések szerint a magzati kiméra sejtek "ártatlan szemlélők" a gyulladásos vagy gyógyulási folyamatokban (10).

Kis mennyiségű őssejt terjedését az utódokhoz terhesség alatt, az anyai mikrobimerizmust (MMc), kisebb mértékben vizsgálták, mint a magzati mikrokimerizmust. Az anyai sejteket különféle magzati vérkoncentrációkban detektálták a 13. (11.) héttől, és akár 100% -ig a köldökzsinór vérmintáiban, az anyai sejtek kimutatására alkalmazott módszertől függően (12-14).

Nemrégiben beszámoltunk anyai immunkompetens sejtek kimutatásáról a 11-es trimeszteres magzatokban (15), amelyeket malformációk és/vagy 21-es triszómia miatt vagy szociális okok miatt elvetettek. Anyai sejteket találtak a 11 magzatból hétben, és ezek a sejtek felszíni markereket expresszáltak a T- és B-limfociták, a leukociták és a hematopoietikus progenitor sejtek számára. Az anyasejtek az összes vizsgált szervben jelen voltak, és normális magzatokban, valamint rendellenességekkel és/vagy triszómiával rendelkező magzatokban találtak 21.

Stevens és mtsai. (16) nemrégiben kimutatta, hogy az anyai sejtek különféle szövettípusokban voltak jelen hét férfi csecsemőben. Megmutatták azt is, hogy az anyasejtek differenciálódtak specifikus sejtszervtípusokra. Maloney és mtsai. (2) kimutatták, hogy egészséges, középkorú egyének vérében anyai sejtek voltak jelen.

A magzati mikrokimerizmushoz hasonlóan az utód anyai sejtjeihez számos autoimmun betegség társult, különösen a gyermekeknél előforduló állapotok (17–25). Mivel ezeknek a szemiallogén őssejteknek a sorsa nagyrészt ismeretlen, különösen egészséges egyének szöveteiben, arra törekedtünk, hogy kiderítsük, hogy az őssejtek gyermekkorban jelen voltak-e a gyermekek limfoid szövetében, annak érdekében, hogy tisztázzuk az MMc potenciális szerepét fejlődés. Korábbi vizsgálatokban bebizonyítottuk az érett anyai T- és B-sejtek, valamint a hematopoietikus progenitorok jelenlétét a különféle magzati szövetekben. Ebben a tanulmányban az MMc-t mandulában és adenoid szövetekben vizsgáltuk, amelyek természetesen gazdagok limfoid sejtekben, sőt a postnatalis lymphopoiesis potenciális helyét is jelenthetik (26).

mód

Betegek.

A mandulaműtéten és/vagy adenoidektómián átesett 20 gyermek mandulájából és/vagy adenoidjából származó szövetmintákat prospektívan vettünk. Az irodalomból és korábbi munkáinkból az MMc 30% -os előfordulását vettük alapul a különféle szövetekben. Ezért feltételeztük, hogy 20 esetben kell mintaméretet biztosítani az anyai sejtek jelenlétének vizsgálatára az utódok manduláiban és adenoid szöveteiben.

A műtét indikációi a légzési obstrukció (horkolás) és/vagy visszatérő tonsillitis voltak (1. táblázat). A gyermek édesanyjának kérdőívet kaptak az anya és a gyermek egészségi állapotáról. A kérdések között szerepelt a szoptatási időszak hossza, az anya anyai története, hogy az anya vagy a gyermek vérátömlesztés volt-e, és hogy az anya vagy a gyermek iker-e. A gyermekek és édesanyjuk jellemzőit az 1. táblázat sorolja fel. Egyik gyermek vagy anya sem volt iker, vagy soha nem kapott vérátömlesztést, és minden résztvevő egészséges volt, kivéve egy hypothyreosisban szenvedő és egy fibromyalgiás anyát. A gyermekek szülésének előzményei minden esetben normálisak voltak, kivéve egy esetet, amikor a gyermeket a terhesség 33. hetében méhlepény repedés miatt szülték (17. eset).

Asztal teljes méretben

Szövetgyűjtemény.

Perifériás vért gyűjtöttek anyáktól és gyermekektől. Gyermekeknél a mandulákat és az adenoidokat általános érzéstelenítésben kurettázással távolították el, majd a műtét után azonnal boncolásra és további elemzésre küldték a patológiai osztályra.

A szöveteket steril sóoldattal mossuk és steril körülmények között felvágjuk. Minden mandulát két részre osztottunk. Körülbelül 5 x 5 x 5 mm méretű szövetdarabot vettünk mindkét feléből PCR-analízishez. Így az egyes mandulapárokból (T1-től T4-ig jelölve) összesen négy frakciót vontunk be az elemzésbe. Ezeket a frakciókat a mandula központi régiójából gyűjtöttük össze, hogy megakadályozzuk a hámsejtekkel való szennyeződést és az esetleges gyulladásos váladékokat a kripták felületén. Az adenoid hasonló módon két részre oszlott, és mindegyik felükből eltávolítottunk egy kis (közepes) szövetdarabot PCR-elemzés céljából. A szövetek szövettani vizsgálatát nem végezték el. Ezt a tanulmányt a karolinai egyetemi kórház etikai bizottsága hagyta jóvá (Dnr 2008/3: 3). Az Intézményi Felülvizsgálati Testület jóváhagyását minden betegnél megkapta.

Kvantitatív RT-PCR.

A vér-, mandula- és adenoidmintákból származó DNS-t Qiagen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával extraháltuk. A szöveti DNS-koncentrációt kezdetben 100 ng/μl-re hígítottuk, így minden egyes PCR-reakcióban összesen 500 ng-ot kaptunk.

Az RQ-PCR módszer specifitását és érzékenységét meghatároztuk a vizsgálatba bevont összes marker esetében, DNS és változó mennyiségű DNS mesterséges keverékeinek felhasználásával. A PCR vizsgálatot úgy igazoltuk, hogy egy egyed DNS-ét (három markernek pozitív) más koncentrációban (negatív a markerek esetében) különböző koncentrációban kevertük. A DNS teljes mennyisége 500 ng volt, amit a GAPDH stabil Ct-értéke bizonyított (az adatokat nem mutatjuk be). 500 ng DNS és 40 PCR amplifikációs ciklus felhasználásával nem találtunk hamis pozitív eredményt.

HLA meghatározása.

A HLA-A, -B és -DRB1 polimorfizmusokat standard PCR-alapú módszerekkel (LabType, One Lambda, Inc, CA) határoztuk meg, ideértve a szekvencia-specifikus oligonukleotid szondákat (PCR-SSOP), xMAP technológiát (Luminex System, Luminex Corporation) alkalmazva (Austin)., TX).

AZ EREDMÉNYEK

Az anyai sejteket 20 gyermekből négyben azonosították (2. táblázat). Azok a gyermekek, akik mandulában és/vagy adenoidban pozitívak voltak az MMc-re, két fiú (9. és 15. eset) és két lány (10. és 14. eset) volt 4-6 éves. A 9. és 14. eset pozitív volt minden szövetfrakcióban, valamint a tesztelt vérben. A 10. eset pozitív volt az őssejtek esetében az összes vizsgált frakcióban, kivéve az egyik mandulát (T4) és két adenoid frakciót. A 15. eset a négy mandula- és vérfrakció közül csak az egyikben volt pozitív. A vér összes MMc-pozitív esete a mandulákban vagy az adenoid szövetekben is pozitívnak bizonyult, körülbelül hasonló sebességgel. Az MMc minták részletes RT-PCR adatait a 3. táblázatban mutatjuk be. Nem találtunk nyilvánvaló összefüggést az anyai sejtek mandulákban és/vagy adenoidokban való jelenléte és az anyai és gyermeki HLA osztályok különböző kombinációi között (az adatokat nem mutatjuk be).

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

VITA

Ez a tanulmány megerősíti azokat a korábbi jelentéseket, amelyek szerint az MMc viszonylag gyakori jelenség. A legtöbb tanulmány értékelte az MMc előfordulását különböző betegségekben szenvedő betegeknél, bár egészséges személyeknél korlátozott információról számoltak be az MMc-ről, különösen a szövetekben. A második trimeszterben, a társadalmilag motivált végződésekből származó magzatok esetében a terhesség 13. hetétől kezdve az esetek mintegy 50% -ában végezhettünk MMc-t különböző szervekben (15). Mold és mtsai. (29) még magasabb MMc értékekről számoltak be a magzati nyirokcsomókban, amelyeket a második trimeszter abortuszai eredményeztek. A születéskor az összes csecsemő 100% -ának van anyasejtje a köldökzsinórvérben (12–14), és az anyasejtek becsült gyakorisága 0,02–5% között van (9, 11, 12). A szülés utáni MMc adatok elsősorban vérmintákon alapulnak. Az MMc középkorig fennmaradhat, és a kimutatáshoz használt módszertől függően az MMc értékek 20 és 39% között mozognak a különböző perifériás vérsejt populációkban (30). Így az MMc úgy tűnik, hogy gyakori és sok évig fennáll.

Az egészséges egyének szerveiben és szöveteiben az anyai kiméra sejtek számára és eloszlására vonatkozó információk döntő jelentőségűek lehetnek e sejtek potenciális fiziológiai szerepének megértése szempontjából; azonban nagyon kevés tanulmány foglalkozott ezzel a kérdéssel. Ezeknek a jelentéseknek az eredményeit a 4. táblázat foglalja össze. Abortusz-, biopszia- és boncszöveti vizsgálatokban az MMc-t számos szövetben kimutatták, például bőrben, szívben, májban, lépben, csecsemőmirigyben, pajzsmirigyben és hasnyálmirigyben. (15–25, 29, 30, 31), és egyetlen specifikus szerv sem rendelkezik nyilvánvaló hajlammal az MMc-re. Ezek a jelentések nagymértékben különböznek az MMc gyakorisága és a gyakorisági hivatkozások tekintetében 0 és 100% között, bár a közzétett eredmények érvényességét számos korlátozás befolyásolta. Sok esetben a beteg anyagának mérete korlátozott volt, és a kimutatási módszerek nagyon eltérőek voltak. Ezenkívül a vizsgálatokban alkalmazott kontrollok többsége egy adott szervben (pl. Bőr, izom, máj stb.) Súlyos betegségben szenvedő betegek volt, és nem egészséges egyének.

Asztal teljes méretben

Ez a tanulmány az első jelentés az MMc-ről a mandula és az adenoid szövetekben. Ezeknek a szöveteknek a vizsgálata részben azon a tényen alapult, hogy képesek voltunk tanulmányozni a limfoid szervek anyai sejtjeit, amelyek viszonylag egészséges gyermekek szöveteiben könnyen rendelkezésre állnak. A mandula és az adenoid szövetek a születés után fejlődnek ki, és jelentik az első védelmi vonalat a felső aero-emésztőrendszer mikrobiális inváziója ellen. A B és T limfocitákkal kapcsolatos immunológiai folyamatok a nádor mandulák különféle speciális rekeszeiben indulnak meg (32, 33). Az adenoid szintén aktív immunológiai hely a nasopharyngealis régióban, amely a veleszületett és az adaptív immunrendszer sejtjeit egyaránt hordozza (34, 35).

Itt elemeztük a friss szöveteket, különös tekintettel az anya polimorf régióira a kivont DNS-ben. Vizsgálatunknak számos korlátja volt. Bár az esetek 20% -ában találtunk MMc-t, a vizsgálatba bevont betegek száma korlátozott volt. Továbbá, Alizadeh et al. (27), az RQ-PCR kiméra módszer érzékenysége a legtöbb marker esetében 0,01%. 0,1% alatt a módszer linearitása zavart, de az érzékenység még mindig 0,01% lehet. Az anyai kimérizmus szintje egyénenként változó, és bár ez a módszer nagyon érzékeny volt, egy még érzékenyebb módszer pozitívabb eseteket eredményezhet.

Így elméletileg ez a módszer alábecsülheti az MMc-t. Ezenkívül, mivel nem végeztünk in situ elemzést, nem tudtuk értékelni e sejtek anatómiai elhelyezkedését és integrációját. Ezért nem állíthatjuk, hogy az anyasejtek beépültek a mandulaszövetbe, vagy hogy ezek a sejtek a mandulakriptákkal társított kis erekben keringenek. Ezek a problémák további vizsgálatokat igényelnek, amelyek kombinálják az immunhisztokémiát más anyai sejt-azonosítási technikákkal, például az X és Y kromoszómák in situ hibridizációjával. Hasonlóképpen, bár adataink jó összefüggést sugallnak a vér és a mandulaszövet MMc között, a probléma nem oldódott meg, mert nem szolgáltat bizonyítékot az anyai kiméra sejtek átültetésére.

Kérdések maradnak arról, hogy az MMc miért marad fenn egyes egyénekben az anya és a gyermek közötti HLA-különbségek ellenére. Az a mechanizmus, amely alapján a magzat felismeri és tolerálja az anyai sejteket, nem ismert, de valószínű, hogy az anyai sejtfelvétel a születendő gyermek éretlen immunrendszerének függvénye. Ebben a tanulmányban nem tudtunk bizonyítani semmilyen látszólagos kapcsolatot a HLA anya és gyermek típusa és az MMc jelenléte között; Vizsgálatunk viszonylag korlátozott anyaga azonban nem adott végleges választ arra, hogy az anya és a gyermek közötti HLA kompatibilitás befolyásolhatja-e az MMc megjelenését (vagy típusát).

Az anyai sejtek működésének spekulációjában további szempont, hogy képesek-e ezek a sejtek kimutatni a sejtek plaszticitását. Stevens és mtsai. (19) Az újszülött lupus szindrómában szenvedő gyermekek myocardialis MMc vizsgálata során kimutatták, hogy az anyai sejtek megkülönböztetik szívizomsejteket. Korábbi vizsgálataink során kimutattuk, hogy a CD 34+ és CD 45+ sejtek az anyától a magzatig terjedhetnek a placentán. Mindkét sejttípus plaszticitási tulajdonságokkal bírhat (41).

Az anyai sejtek működésével kapcsolatos spekulációk másik aspektusa az, hogy ezek a sejtek képesek-e demonstrálni a sejtek plaszticitását. Korábbi vizsgálataink során kimutattuk, hogy a CD 34+ és CD 45+ sejtek az anyától a magzatig terjedhetnek a placentán. Ezek a sejtek sejtmarkert fejeznek ki a hematopoietikus és az endothelsejt-progenitorok számára. Stevens és mtsai. (19) hasonló sejtmarkereket vizsgált az újszülött lupusban és a veleszületett szívblokkban szenvedő gyermekek szívszövetében, és kimutatta, hogy a szívizomban található anyai sejtek 86% -a szarkómikus α-aktint is expresszált, amely a kardiomiociták specifikus markere. Így úgy tűnik, hogy az utódszövetekben lévő anyai sejtek plaszticitást mutatnak. Ez a természetes plaszticitás fontos szerepet játszhat az anya és utódai befolyásolásában. Ez a mechanizmus azt is megmagyarázhatja, hogy a gyermek számára előnyös és/vagy káros képességek hogyan tudnak epigenetikus hatásként továbbadni egyik generációról a másikra.

Összegzésként elmondható, hogy az MMc-t egészséges, 2-15 éves gyermekek mandulájának és adenoidjának szövetmintáinak 20% -ában találták. Tudomásunk szerint ez a tanulmány az első, amely ezekben a szövetekben vizsgálja az MMc-t. Mivel ezek a szervek központi szerepet játszanak a fejlődő gyermek immunszabályozásában, további vizsgálatokra van szükség az MMc biológiai hatásainak ezekben a szövetekben történő vizsgálatához.