absztrakt

Humán adipociták in vitro előállíthatók humán preadipociták vagy mezenhimális őssejtek (hMSC) differenciálásával. Bár funkcionálisan hasonló a frissen izolált sejtekhez, a különféle sejttípusok részletes összehasonlítására nem került sor. Az antilipolitikus α 2A-adrenoreceptor (AR) és a cAMP-bontó enzim, a foszfodiészteráz-3B (PDE3B) részt vesz a lipolízis finomhangolásában, de kevéssé ismert az emberi adipocitákban betöltött szerepük, illetve az, hogy expressziójuk és/vagy funkciójuk eltér-e. . különböző prekurzorok zsírsejtjeiben.

módszertan:

Meghatároztuk az α2A-AR és a PDE3B gátlásának érett adipocitákban kifejtett hatásait, és összehasonlítottuk őket differenciált preadipocytákban és hMSC-eredetű zsírsejtekben. A génexpressziót valós idejű PCR-rel, a fehérje expressziót Western-blot segítségével határoztuk meg.

az eredmények:

A noradrenalin (NA) stimulálta a lipolízist a preadipocytákban és az érett adipocitákban, de jelentősen csökkentette a lipolízist a hMSC-kből származó differenciált adipocitákban. Ennek oka az α2A-AR erős stimulálása volt, miután NA-val és az inhibitorral, valamint a -2-AR-yohimbinnel együtt inkubálták, helyreállt az NA által kiváltott lipolízis. A yohimbin válasz sorrendje a hMSC> preadipociták> érett adipociták volt. Bár az α2-AR mRNS expressziója az érett adipocytákban volt a legmagasabb, az α2A-AR fehérje szintekben nem volt különbség sejttípusok között. Ezzel szemben a Gα2 mRNS és a fehérje expressziója szignifikánsan magasabb volt az MSC-ből származó adipocytákban, ami arra utal, hogy az α2A-AR gátlására adott válasz különbségei a poszt-receptor szintjén vannak. A cAMP analóg 8-bróm (8b) cAMP-vel történő inkubálás fokozta a lipolízist a hMSC-ből származó adipocitákban, míg a PDE3-specifikus OPC3911 inhibitorral történő együttes inkubálás nem változtatta meg a lipolitikus hatást. Ezzel szemben az OPC3911 szignifikánsan fokozta a 8bcAMP által kiváltott lipolízist a preadipocytákban és az érett adipocitákban. A PDE3B gátlására adott válasz a következő volt: érett adipociták> preadipociták> hMSC lelet, amely szignifikánsan korrelált a PDE3B mRNS expressziójával, valamint az enzimatikus aktivitással.

következtetés:

Noha a különböző eredetű differenciált adipociták hasonló funkcionális jellemzőkkel rendelkeznek, jelentős különbségek vannak a lipolízis szabályozásában markáns α 2A-AR-val és a PDE3B kevésbé kifejezett hatásával az MSC adipocytákban.

A cAMP-szintek szabályozását más szinten érik el a foszfodiészterázok (PDE-k), olyan enzimek csoportja is, amelyek lebontják a cAMP-t antilipolitikus hormonok, például inzulin általi aktiválás után. Az emberi zsírszövetben a PDE fő altípusa a foszfodiészteráz-3B (PDE3B). Az adipociták inzulinstimulációja az inzulinreceptor autofoszforilezését és az adaptív fehérjék, köztük az inzulin-receptor-1 szubsztrát (IRS-1) megkötését eredményezi. Az adaptív fehérjék számos effektort szereznek, beleértve a foszfatidil-inozit-trifoszfát-kinázt (PI3-K). A PI3-K foszforilezésével képződött foszfatidil-trifoszfát-lipid horgonymolekulaként működik, és PDK1/2-kinázt toboroz a plazmamembránba. A PDK1/2 foszforilálja a protein-kináz B-t (PKB), a PDE3 foszforilezéséért és aktiválásáért felelős enzimet. Ez a jelátviteli kaszkád a cAMP koncentrációjának csökkenését eredményezi, ami a PKA aktivitás csökkenéséhez és a HSL defoszforilációjához vezet. Humán adipocitákban az inzulin által kiváltott antilipolízist teljesen semlegesíti az OPC3911 szelektív PDE3 inhibitor. Más vizsgálatokkal6 kombinálva ez arra utal, hogy a PDE3 aktiváció az inzulin in vivo antilipolitikus hatásának fő mechanizmusa.

Anyagok és metódusok

Adipocita sejttenyészet

Érett adipocitákban és preadipocita kultúrákban 13 nőtől nyertek zsírt, akik kozmetikai mastectomián vagy hasi műtéten estek át. 28-62 évesek voltak, testtömeg-indexük (BMI) 24 és 51 kg/m 2 között volt. A zsírszövetmintákat a Huddinge Kórház és a Danderyd Kórház sebészeti osztályaiból nyertük. Mintákat vettünk a beteg szubkután és hasi depóiból. A kórház Etikai Bizottsága jóváhagyta a tanulmányt. Tájékozott beleegyezést kaptak minden alanytól. Az érett adipocitákat Rodbell szerint izoláltuk. Elkülönítés után a sejteket Krebs-Ringer foszfátpufferrel (KRP) mossuk (pH 7), 4: 0,9% NaCl, 0,1 M NaH 2 PO 4, 0,154 M KCl, 0,1 M CaCl 2, 0,154 M MgSO 4, amely 0,1% szarvasmarhát tartalmaz szérumalbumin (BSA), pH 7,1, 4. Az adipocitákat ezután 2% BSA-t (FFA akceptor), glükózt (üzemanyag, 1 mg/ml) és aszkorbinsavat (antioxidáns, 0,1 mg/ml) tartalmazó KRP-ben hígítottuk.

Humán preadipocita tenyészeteket állítottunk fel és különböztettünk meg a fentiek szerint, 6, 12 vagy 24 lyukú lemezeken 37 ° C-os inkubátorban, 5% CO 2 -val. A lipolízist a differenciálódás 16. napján értékeltük.

Humán MSc kultúra

A differenciálás értékelése

A preadipocita és a hMSC differenciálódását a glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (GPDH) aktivitásának meghatározásával és triglicerid-specifikus Red Red O festékkel történő festéssel határoztuk meg a fent leírtak szerint. 10.

Valós idejű RNS és PCR izolálás

lipolízis

Western blot

PDE3B aktivitás vizsgálata

A PDE assay a következő reakción alapul: cAMP AMP-vé (amelyet PDE katalizál), majd az AMP átalakulása adenozinná 5'-nukleotidázon keresztül. A differenciálódott preadipocitákat és hMSC-ket, valamint az érett adipocitákat 50 mM TES-t, 250 mM szacharózt, 1 mM EDTA-t, 0,1 mM EGTA-t (pH 7,5) és Complete (Roche Diagnostics, Svájc) tartalmú pufferben homogenizáltuk. A sejt homogenizátumokat 30 ° C-on 20 percig inkubáltuk 300 μl össztérfogatban, amely 50 mM HEPES-t (pH 7,4), 0,1 mM EGTA-t és 0,5 μM [3 H] cAMP-t tartalmazott. Kígyómérget (Crotalus atrox, Sigma, St. Louis, MO, USA), amely 5'-nukleotidáz aktivitást tartalmaz, 0,4 mg/ml koncentrációban adunk hozzá, és a sejt homogenizátumokat 20 percig 37 ° C-on inkubáljuk. A PDE3 aktivitást a hidrolizált cAMP mennyiségeként határoztuk meg, és az összes fehérje 1 mg-jára vonatkoztatva fejeztük ki. A fehérje koncentrációt a sejt homogenizátumokban az RC/DC protein assay segítségével határoztuk meg (Biorad, Hercules, CA, USA).

Statisztikai analízis

Az értékeket átlag ± standard deviációként (sd) jelentjük az mRNS és PDE vizsgálati adatokban, és átlag ± standard hibaként (se) adjuk meg a lipolízist. Összehasonlították őket a hallgató párosítatlan t-teszttel vagy Kruskal-Wallis nemparametrikus teszttel, amint azt a szokásos szoftvercsomagok jelzik.

Kábítószerek és vegyszerek

A BSA V frakciót (tételszám: A-9418), 8-bróm-AMP-t, glükózt, glicerin-kinázt, NA-t, Oil Red O-t és yohimbint a Sigma Chemical cégtől (Sigma, St. Louis, MO, USA) szereztük be. Az OPC 3911-et a Otsuka Pharmaceuticals-tól (Japán) szereztük be. Minden felhasznált vegyi anyag a kereskedelemben kapható legmagasabb tisztaságú volt.

az eredmény

A hMSC-eredetű adipociták markáns α2A-AR hatást mutatnak, de PDE3B hatást nem

különböző

Lipolízis hMSC-eredetű adipocitákban. A sejteket NA-val (NA) stimuláltuk α2A-AR blokkoló yohimbinnel vagy anélkül (NA + Yoh), vagy a foszfodiészteráz 3-ra érzékeny cAMP analóg 8pcAMP-vel (PDE3), PDE3-specifikus OPC3911 inhibitorral (8bcAMP + OPC) vagy anélkül. A glicerin felszabadulást tápközegben mértük 3 óra inkubálás után, és a GPDH aktivitáshoz és a fehérjekoncentrációhoz viszonyítva fejeztük ki. A bazális lipolízist 100% -ra állítottuk be minden kísérlet esetében, amelyet legalább négyszer megismételtünk különböző donor sejtjeivel. Az α2A -AR erős antilipolitikus hatása miatt az NA csökkentette a lipolízist a kontroll sejtekhez képest. Yohimbine jelenlétében az NA által stimulált lipolízis több mint háromszor helyreállt bazális szinten. Ezzel szemben az OPC hozzáadása a 8bcAMP-hoz nem volt szignifikáns hatással a lipolitikus sebességre (***, statisztikailag szignifikáns a bazális P lipolízishez képest

Lipolízis differenciált preadipocitákban. Ne feledje, hogy az NA által indukált lipolízis fokozódik yohimbine jelenlétében. Hasonlóképpen, a 8bcAMP hatása szignifikánsan megnőtt az OPC3911 jelenlétében (***, statisztikailag szignifikáns a bazális P lipolízishez képest

Lipolízis frissen izolált érett adipocitákban. A sejteket ugyanazokkal a gyógyszerekkel stimuláltuk, mint az 1. ábrán. A glicerin felszabadulást a táptalajban 2 óra inkubálás után mértük, és a lipidtartalomhoz viszonyítva grammban fejeztük ki. Vegye figyelembe az α2A-AR gátlásának kissé kevésbé kifejezett hatását és a PDE3B gátlásának markáns hatását (* P *** P preadipociták> érett adipociták), míg a fordított aktivitás (érett adipociták> preadipociták)> HMSC-adipociták figyelhetők meg PDE3B aktivitással).

Gátló hatások összehasonlítása különböző sejttípusokban. Az α2A -AR antilipolitikus hatását a NA + yohimbinnel kezelt sejtekben a lipolízis százalékos növekedésében fejeztük ki, szemben a kizárólag NA-ban inkubált sejtekkel. A PDE3 antilipolitikus hatását a 8bcAMP + OPC-vel kezelt sejtek lipolízisének százalékos növekedésként fejeztük ki a 8bcAMP-hez viszonyítva. Az α2-adrenoreceptorok antilipolitikus hatása szignifikánsan alacsonyabb volt az érett adipocytákban a differenciált hMSC-khez képest (P = 0,002, Student's t-teszt). ). Ezzel szemben a PDE3 antilipolitikus hatása szignifikánsan megnőtt az érett adipocytákban a differenciált hMSC-khez képest (P = 0,036, Student's t-teszt).

Teljes méretű kép

Az α2A -AR és Galfa mRNS és fehérje expressziója

Messenger és fehérjék expressziója különböző eredetű adipocitákban. Az α2A-AR (a) és Gai2 (b) mRNS expresszióját izolált adipocitákban, preadipocitákban és hMSC-kben értékeltük. A génexpressziót 18S rRNS-re standardizáltuk. Az értékek átlag ± sd (* = P

Az érett adipocitákban az α2A-AR gátlás csökkent hatásával ellentétben a PDE3 hatása fokozottnak tűnik. Ez nagy valószínűséggel a PDE3B mRNS fokozott expressziójának köszönhető, ami fokozott aktivitáshoz vezet. Ennek oka nem világos. A PDE3 az inzulin antilipolitikus hatásának egyik fő hatása. A megnövekedett PDE3 aktivitás tehát az érett zsírsejtek magasabb szintű lipolitikus szabályozását tükrözheti, ahol a lipolízist nemcsak a katekolaminok, hanem az inzulin is szabályozza. További vizsgálatokra van szükség annak megállapításához, hogy az expressziós különbségek függenek-e a sejttípusok közötti elsődleges különbségektől vagy egy in vitro differenciálási eljárás miatt.

Összefoglalva, megmutattuk, hogy az α2A -AR és a PDE3B funkciói az érlelő zsírsejtek adipogén eredete szerint különböznek. A lipolízis α2A-AR és PDE3B gátlása differenciáltan fontosnak tűnik a különböző sejtekből származó adipociták számára. Az α2A-AR szerepe túlsúlyban van a hMSC-ből származó adipocitákban, míg a PDE3B aktivitás az érett adipocitákban. Mindkét út fontos a preadipocytákban. Ezek a jelek szerepet játszhatnak a lipidek felhalmozódásában az adipocita érése során, hogy megvédjék az éretlen zsírsejtet a gátolt energia ellenőrizetlen felszabadulásának gátlásával. Eredményeink azt mutatják, hogy minőségi különbségek vannak a különböző prekurzor sejtekből származó humán adipociták között, és óvatosságra van szükség az in vitro adipocita vizsgálatok eredményeinek értelmezésekor.

köszönöm

Ezt a munkát az Åke Wiberg, Tore Nilsson, Signe és Olof Wallenius, Magnus Bergvall, Åhlens és Novo Nordisk, a Svéd Orvosi Egyesület, a Svéd Kutatási Tanács, a Svéd Diabetes Szövetség, a Tobias Alapítvány és a Svéd Rák Alapítvány támogatta. .,