- elemeket
- absztrakt
- HÁTTÉR:
- A CÉL:
- módszertan:
- az eredmények:
- következtetés:
- bevezetés
- Anyagok és metódusok
- vadállat
- diéta
- Kísérleti protokoll
- Szövetfehérje-tartalom és biokémiai mérések
- Izotóp mérések
- Gén expresszió
- statisztika
- az eredmény
- Élelmiszerbevitel, állatok növekedése és testösszetétele
- Plazma-karbamid, hormonok és aminosavak
- A szövetek összetétele, a fehérjeszintézis sebessége és a proteolitikus út gén expressziója
- vita
- További információ
- Word dokumentumok
- További információ
elemeket
- anyagcsere
- Elhízottság
- proteolízis
absztrakt
HÁTTÉR:
A magas fehérjetartalmú (HP) étrendeket az energiakorlátozás során alaposan tanulmányozták a testzsír csökkentésére és a sovány testtömeg fenntartására való képességükről, de a sovány szövetek fehérje-anyagcseréjére gyakorolt hatásukról keveset tudni.
Az energiakorlátozás és a fehérjebevitel hatásának meghatározása patkányok fehérje anabolizmusára és katabolizmusára.
módszertan:
5 héten keresztül 56 hím Wistar patkányt tápláltak elhízást okozó étrenddel (OI). Ezután OI diéta vagy kiegyensúlyozott HP étrend alkalmazásával 3 hétig 40% -os energiakorlátozásnak vetették alá őket, míg a kontroll csoportot ad libitum OI diétával táplálták (n = 8 csoportonként). A HP-korlátozott patkányokat öt csoportba osztották, amelyek csak fehérjeforrásban különböztek: az összes tejfehérje, a kazein (C), a savó (W), az 50% C és W keveréke és a szója (n = 8). Ezután az állatokat étkezés utáni állapotban leöltük és meghatároztuk testösszetételüket. A fehérjeszintézis sebességét a májban, a gyomorban és a vesékben szubkután 13 C-valin dózis alkalmazásával határoztuk meg. Az MRNA-szinteket meghatároztuk a három proteolízis útvonalban részt vevő kulcsfontosságú enzimek esetében.
az eredmények:
Az energia korlátai, de az étrend összetétele nem, befolyásolta a fogyást és az adipozitást, míg a sovány szövet súlyát (a vesék kivételével) nem befolyásolta az étrend összetétele. A neoglükogén aminosavak szintje általában az energiahatár alá esett (P 1, 2 magában foglalja az energia korlátozásának és az étrend tápanyagok energiatartalmának módosítását, például a zsírok vagy szénhidrátok (CHO) fogyasztásának csökkentését és a fehérje növelését. tartalom. 3, 4 tanulmány telítő hatásuk miatt, amelyek csökkenthetik az energiafogyasztást 5, és növelhetik a betegek étrendnek való megfelelését. 6, 7 Ezenkívül a fehérjében gazdag étrend minimalizálhatja az alacsony kalóriatartalmú izomtömeg-veszteséget diéta.8, 9 A fehérjeforrás típusa szintén hatással lehet a rágcsálók 10., 11. modelljeiben leírtakra
Az energiakorlátozás anabolikus és katabolikus áramlásra gyakorolt hatása nem eléggé ismert, és a rendelkezésre álló, sok paraméterben (modell, időtartam, korlátozás mértéke) eltérő eredmények nem összehasonlíthatók. Egy emberi tanulmány nemrégiben kimutatta, hogy az izomfehérje szintézise enyhe energiacsökkenés után csökkent. 12 Patkányokból nyertek további adatokat, amelyek az energia korlátozásának az izomfehérje anabolizmusra gyakorolt káros hatásait tárták fel az izom típusától (soleus, gastrocnemius, plantaris, tibialis anterior) és a fehérjéktől (szarkoplazmatikus vagy mitokondriális) függően. 13, 14, 15 Ezenkívül a fehérje anabolizmust nem vizsgálták más szervekben, például a májban vagy a vesében, míg az ad libitum megfigyelte, hogy a májban és a vesében a fehérjeszintézist az étrendi fehérje szintje módosította, ellentétben az izomszintézissel. . 16, 17 Az energiakorlátozás proteolízisre gyakorolt hatásának vizsgálata ritka, és a fehérjeszintézis vizsgálatokkal ellentétben a májban 18, 19 részt vett, de sem izomban, sem vesében. Ezért szükségesnek tűnik tisztázni az energiakorlátozás következményeit a fehérje áramlásában az étrendi összetétel és különösen annak fehérjetartalma függvényében.
Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy jobban megértsük a makrotápanyag-étrend, beleértve a fehérjeforrást, hatását a testösszetételre és a szövetfehérje-anyagcserére patkányok energiakorlátozása során.
Anyagok és metódusok
Valamennyi kísérletet a Francia Állatgondozási Bizottság iránymutatásainak és a kísérletekhez használt gerinces állatokról szóló európai egyezménynek megfelelően hajtottuk végre. A hím Wistar patkányokat (n = 56, 300 - 320 g) Harlan-tól (Horst, Hollandia) vásároltuk, és azokat ellenőrzött környezeti körülmények között (hőmérséklet, 12 órás sötét időszak 08: 30-tól kezdődően) tartottuk. A patkányok a kísérleti étrendhez való étrendi alkalmazkodás megkezdése előtt 5 napig szabadon hozzáférhettek a vízhez és a kereskedelmi laboratóriumi chow-hoz.
diéta
Összesen 56 patkányt tápláltak 5 héten keresztül elhízást okozó étrenddel (OI) ad libitum (12% energia fehérje, 43% CHO, 44% zsír), majd 3 hétig hét különböző csoportba osztották Csoportonként 8). A kontrollcsoportot 3 hétig ad libitum diétán tartottuk. Az OI-R patkányok OI étrendet kaptak, amelynek energiakorlátozása 45% volt, míg más patkányok energia korlátozottak voltak magas fehérjetartalmú (HP-R) étrenddel (33% energia fehérje, 37% CHO és 30% zsír). Öt különböző fehérjeforrást teszteltek HP-R patkányokon: tejfehérjék (MP), tejsavó (W), kazein (C), C és W azonos arányú keveréke (CW) és szója (S). Úgy számoltuk, hogy a korlátozott csoportban szolgáltatott energia az indukció utolsó 2 hetében megfigyelt átlagos energiafogyasztás 55% -át adja. A tanulmány tervezésével kapcsolatos további információk az Int J Obes weboldalon érhetők el (S1. Ábra). Az összes MP volt az étkezési fehérje IO és IO-R forrása (1. táblázat). Összetételét tekintve a HP-R étrendek reprezentatívak voltak az embereknél általában alkalmazott fogyókúrás étrendekhez. Az OI-R és HP-R étrendeket ásványi anyagokkal és vitaminokkal egészítették ki, hogy elkerüljék az energiakorlátozás miatti hiányosságokat.
Asztal teljes méretben
A diétákat félfolyékony formában szállították a kiömlés megakadályozása és a bevételek nyilvántartásának javítása érdekében. A restrikciós periódus utolsó hetében a patkányokat szokás szerint táplálékra használták, az első 8: 30-9: 30 közötti periódusból, amely a napi adag 1/3-át adta, és egy második periódust 12: 00-18: 00 között: 00 a maradék adag beadása. Az OI patkányokat ugyanazon ütemezésnek vetették alá, de 12:00 és 18:00 között szabadon hozzáférhettek az élelemhez. Ezt a mintát úgy alkalmaztuk, hogy az állatok a kísérleti napon 1 órán belül teljesen normál ételt ettek.
Kísérleti protokoll
A patkányok testtömegét és táplálékfelvételét naponta mértük az első 3 napban, majd 2 naponta. Az 56. napon a patkányokat kalibrált étellel etették, amely a napi adag 1/3-ának felel meg 2 órával az elpusztítás előtt. A fehérjefrakció-szintézis (FSR) sebességének mérésére az állatokat szubkután 300 μmol kg-1 BW mennyiségű L- (1-13C) -valin (50% mol, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) áradó dózisával injektáltuk. perccel a megölés előtt. Az állatokat nátrium-pentobarbitál (50 mg/kg testtömeg) intraperitoneális injekcióval altattuk. A has bemetszése után a vena cava-ból vért töltött EDTA csövekbe, majd centrifugáltuk a plazma metabolitjainak és hormonjainak mérésére. Ezután a patkányokat a farok vena cava és az aorta felszakadásával feláldozzuk. Steril körülmények között a májat, a vesét és a gyomorizmokat eltávolítottuk, leöblítettük, lemértük és lefagyasztottuk az elemzésig. A lép, a lép izma, a belek és a gyomor szintén figyelembe vették. A hasi zsírpárnákat (epididymális, mesentericus és retroperitoneális) kivágtuk, és az inguinalis subcutan zsírpárnákat eltávolítottuk. A tetemet eltávolítottuk a sovány testtömeg értékelése céljából. Ezeknek a szöveteknek a tömegét feljegyeztük.
Szövetfehérje-tartalom és biokémiai mérések
A szöveteket liofilizáltuk és lemértük. Teljes N-tartalmukat Dumas-módszerrel határoztuk meg, elemi elemzővel (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Milánó, Olaszország), standard atropinnal.
A szövetek összes fehérjetartalmát (g) P = TM x% DM x% N x 6, 25/10 000, ahol a TM a szövet nedves tömege (g) és a DM szárazanyagban.
A plazma aminosavkoncentrációkat deproteinizált plazma mintákon határoztuk meg ioncserélő kromatográfiával, oszlopon ninhidrin-származékkal (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Franciaország). Az inzulin- és leptin-koncentrációkat patkány endokrin panel segítségével (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, USA) elemeztük Bioplex 200 rendszerben (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). A karbamid koncentrációkat kereskedelmi készlet segítségével határoztuk meg (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Franciaország).
Izotóp mérések
A szöveti fehérjék FSR-jét (%/nap) az alábbiak szerint számítottuk: FSR = Ebound val/(Efree val × t) x 100, ahol az Ebound val és az Efree val fehérje kötések és 13 C-valin dúsított a szövetekben. Az abszolút szintézis sebességet (ASR, g/nap) az ASR = FSR x P értékeként számítottuk, ahol P a szövet teljes fehérjetartalma. A teljes izomtömeg a testtömeg 45% -ára becsülték. 20
Gén expresszió
A teljes RNS-t fagyasztott szövetből extraháltuk TRIzol-reagensekkel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A teljes RNS-koncentrációt 260 nm-en számszerűsítettük, és etídium-bromid festést használtunk az RNS integritásának megerősítésére. Az első szál komplementer DNS (cDNS) szintézisét 400 ng RNS-n hajtottuk végre reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Franciaország) PTC-200 termikus ciklissel (MJ kutatás, Waltham, MA, USA). A valós idejű PCR-t egy "power syber green PCR master mix" (Applied Biosystems) felhasználásával hajtották végre 7300 valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems). A primereket az Oligo Explorer 1.1.0 szoftver (GeneLink, Hawthorne, NY, USA) felhasználásával tervezték. Az alkalmazott PCR-láncindítók szekvenciái a következők voltak: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(előre) és 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (különben) katepszin D-re (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTGACTACA-3 '(hátra) és 5' - GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3 '(fordított) ubikvitinnel (Ubb, NM_138895), 5'-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3' (előre) és 5'-ACACAACGACGATGGAAAG-3 '(hátramenet) aAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA (NM_017116), 5'-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3 'és 5'-GGGTCGGGGGGGTG-3' 18S esetén.
Az összes PCR-reakciót az alábbiak szerint hajtottuk végre: denaturálás 95 ° C-on 10 percig, 40 amplifikációs ciklus, mindegyik ciklus 15 másodpercből állt 95 ° C-on, majd 1 percig 60 ° C-on. A ciklusküszöböt (CC) minden mintára állandó fluoreszcencia küszöbértéknél határozva meg. A ribosomális 18S RNS amplifikációit alkalmaztuk a cDNS kezdeti mennyiségének változékonyságának figyelembevételére, és a lemezek közötti variációkat korrigáltuk RT kalibrátorral.
A génexpressziót a 2-ACt képlet segítségével határoztuk meg, ahol 2 a cél PCR gén optimális hatékonyságát jelenti, és ACt = Ct - Ct18S. A PCR hatékonyságát minden lemezen reverz transzkripcióval írt RNS soros hígításával határoztuk meg.
statisztika
Az adatokat átlag ± sd-ben fejezzük ki. A csoportos hatást egyirányú ANOVA-val (9.1 verzió; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) elemeztük, és post-hoc Tukey teszteket végeztünk több összehasonlítás céljából. Az energia-korlátozás és a fehérjeszint hatásait a modell kontraszt-állításaival elemeztük az OI és a korlátozott csoportokban. A fehérjeforrás hatását a HP-R csoportokban elemeztük. A növekedési görbék esetében az adatokat kevert modell alkalmazásával elemeztük, az idő ismétlődő tényezőként. P
A patkányok növekedése az 5 hetes OI periódus alatt és az energia korlátozás alatt 3 hétig. Átlag ± sd (n = 8). A jobb érthetőség kedvéért csak egy HP-R csoport szerepel, mivel nincs különbség a korlátozott csoportok között. * jelentősen eltér a kontrollaktól (vegyes modell ismételt mérésekkel, post hoc Tukey-teszt). OI, a kontroll patkányokat OI ad libitum diétával etettük; OI-R, korlátozott energiájú patkányok OI étrendben; HP-MP-R, korlátozott energiájú patkányok teljes MP-t tartalmazó HP diétán.
Teljes méretű kép
A testösszetételt az energiakorlátozás befolyásolta, míg a makrotápanyagok étrend-összetételének (azaz fehérjeszintnek vagy fehérjeforrásnak) nem volt hatása (2. táblázat). A vese volt az egyetlen szerv, amelyben a fehérjék súlya jelentősen megnőtt. Az energiakorlátozás csökkentette a zsírpárnákat, míg a sovány szöveteket csak kismértékben befolyásolta az energiakorlátozás. Nem volt különbség a testösszetételben a különféle korlátozott csoportok között, függetlenül az étrendjük fehérjetartalmának szintjétől és jellegétől.
Asztal teljes méretben
Plazma-karbamid, hormonok és aminosavak
A plazma metabolitokat és a hormonokat étkezés után 2 órával mértük (3. táblázat). Az uremia 64% -kal volt magasabb HP patkányokban, mint OI patkányokban (P
Plazma aminosavkoncentrációk, amelyekre hatással van az energia korlátozása, a fehérjeszint és/vagy a fehérjeforrás. Átlag ± sd (n = 8). OI, a kontroll patkányokat OI ad libitum táplálékkal etették (fekete vonal); OI-R, táplálékban korlátozott energiájú patkányok OI (fehér sáv); HP-R, korlátozott energiájú patkányok HP diéta alatt (szürke oszlopok) különböző forrásokból származó fehérjével (MP; W; CW; C; S). A fő statisztikai hatásokat az egyes grafikonok mutatják: energia korlátozás (ER), fehérjeszint (PL), fehérjeforrás (PS).
Teljes méretű kép
A szövetek összetétele, a fehérjeszintézis sebessége és a proteolitikus út gén expressziója
A máj, a gastrocnemius izom és a vese fehérje-, FSR- és ASR-tartalmát a 4. táblázat mutatja. Az összes HP-R csoport eredményeit összesítettük, mivel nem volt fehérjeforrás. Az energia korlátozása és a fehérjeszint nem befolyásolta a fehérjetartalmat és a fehérjeszintézis áramlását ezekben a szövetekben, az FSR vagy az ASR szerint.
Asztal teljes méretben
A májban az étrend nem befolyásolta a katepszin D, az ubiquitin, az E2 enzim és az m-Calpain expresszióját (3. ábra). Ezzel szemben a proteolitikus útvonalakban részt vevő RNS génszinteket a vese energiakorlátozása jelentősen megnövelte, és mind a négy enzim esetében korlátozott energiájú étrendben csökkent a fehérje szintje. A fehérjeforrás hatása az ubiquitin, az E2 enzim és az M-kalpain esetében is megfigyelhető volt, az MP csoportban magasabb expressziós tendenciát mutatva a Cas és az S-hez képest. az energia korlátozásával általában nőtt, míg a HP szint drasztikusan csökkentette e négy enzim expresszióját.
Patkányok proteolitikus útvonal-génjeinek (katepszin D, ubiquitin, E2 enzim, m-Calpain) relatív expressziója májban, gastrocnemiusban és vesében 3 hetes energiakorlátozás után. Átlag ± sd (n = 8). OI, a kontroll patkányokat OI ad libitum táplálékkal etették (fekete vonal); OI-R, táplálékban korlátozott energiájú patkányok OI (fehér sáv); HP-R, korlátozott energiájú patkányok HP diétán (szürke sávok) különböző forrásokból származó fehérjével (MP; W; CW, C és W keverék; C; S). A fő statisztikai hatásokat az egyes grafikonok mutatják: csoport, energiakorlátozás (ER), fehérjeszint (PL), fehérjeforrás (PS).
Teljes méretű kép
vita
Ez a tanulmány kimutatta, hogy 40-45% -os energiakorlátozásnak kitett patkányokban a fogyást és a testösszetételt főként az energiakorlátozás befolyásolta, míg az étrendi összetételnek és a fehérjeforrásnak nincs szignifikáns hatása. A HP szint javította a keringő glükóz és a vér lipidjeit, míg az energia korlátozást csak a szabad zsírsavak csökkentették. A HP szint ellensúlyozta a keringő neoglükogén aminosavak növekedésének tendenciáját az energia korlátozása miatt. A fehérjeszintézis sebességét nem befolyásolta sem az energiakorlátozás, sem az étrendi fehérjeszint, míg a vese és az izomban a kulcsfontosságú proteolízis enzimeket energiakorlátozással túlexpresszálták, és a fehérjeszint emelkedésével nem fejezték ki. A proteolitikus utak ezen modulációi azonban nem befolyásolták az izomvesztést, függetlenül az étrendi fehérjetartalomtól.
Következtetésként elmondható, hogy azoknál a felnőtt elhízott patkányoknál, akiket 3 hétig 40% -os energiakorlátozásnak vetettek alá, súlyukat és zsírvesztésüket csak a kalóriabevitel vezérelte, függetlenül a makrotápanyagok összetételétől. A sovány tömeg megmaradt a fehérje szintjétől függetlenül, és a fehérje anyagcseréjét csak kis mértékben befolyásolták, kivéve az izom és a vese proteolízis útjait, ahol az étkezés utáni aktiválást energia korlátozással egy HP szint ellensúlyozta. Végül, amikor a fehérjeszint magas volt, az összes fehérjeforrás hatásukat tekintve egyenértékű volt.