elemeket

absztrakt

Háttér

A cianotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél ismeretlen mechanizmusok révén másodlagos eritrocitózis és trombocitopénia alakul ki. Az érett eritrocita mikrociták tükrözhetik a klinikai patológiákat és a sejtdifferenciálódás preenukleációs folyamatait. Ez a tanulmány cyanotikus szívbetegségben szenvedő gyermekek eritrocita mikroRNS-eket értékelte.

mód

A cianotikus és acyanotikus szívbetegségben szenvedő és anélkül szenvedő gyermekek eritrocita mikroRNS-ét az Ion PGM rendszerrel számszerűsítettük (n = 10 csoportonként). A differenciál expressziót kvantitatív PCR-rel igazoltuk (qPCR; n = 20 csoportonként).

az eredmény

A Mir-486-3p, a mir-486-5p és a mir-155-5p növekedett a cianotikus szívbetegségben szenvedő betegeknél a szívbetegség nélküli betegeknél: többszörös különbségek (95% -os konfidencia intervallum): mir-486-3p: 1, 92 (1, 14–3, 23), P = 0, 011; mir-486-5p: 2, 27 (1, 41–3, 65), P 108 sejtek teljes vérkép felhasználásával. A mikroRNS-mérettartományt megerősítettük, és 2 ng RNS-t mennyiségileg meghatároztunk egy Bioanalyzer és egy Agilent Small RNS kit segítségével (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

A kiegészítő DNS-könyvtárakat az Ion Torrent RNS-seq v.2 kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) felhasználásával készítettük a kis RNS-könyvtárakhoz a gyártó utasításai szerint, és tisztaságukat és koncentrációjukat egy Agilent DNS-készlettel (Agilent) ellátott bioanalizátorral igazoltuk. Technológiák).

A mikroRNS könyvtár szekvenálását 318 chipen végeztük Ion Personal Genome Machine rendszer (ThermoFisher Scientific) felhasználásával. Az összes nyers leolvasást automatikusan csonkoltuk az adapterek eltávolítása céljából, igazítottuk az emberi genomhoz (hg19 GRCh37), és a Torrent Suite 1.5-vel (TMAP) annotáltuk alapértelmezett paraméterekkel. A kicsi és a nem kódoló RNS-eket géntípusok szerint osztályoztuk. A miRBase 21 (//www/mirbase.org/) mikroRNS adatbázissal azonosítottuk a szekvenciákat.

A teljes RNS és qPCR izolálása (validációs fázis)

QPCR-t végeztünk az érett mikroRNS meghatározásához és a következő generáció szekvenálási eredményeinek ellenőrzéséhez. Az RNeasy Plus Mini Kit és az RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) felhasználásával a teljes RNS-t kivontuk 2,7 ml beteg vérsejtjéből a gyártó utasításainak megfelelően. Az RNS mennyiségét 1,0 x 108 sejtből kvantáltuk Quantus fluorométerrel (Promega KK, Tokió, Japán), és az egyes minták koncentrációja 0,2 ng/μl volt. A kis RNS-molekulákat, az 5'-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3 'mintákkal dúsítottuk és kontrollként használtuk.

Komplementer DNS-t készítettünk az ABI Taqman kit alkalmazásával a fejlett mikroRNS-komplementer DNS-szintézishez (ThermoFisher Scientific). A qPCR elemzést a Step One Plus (ThermoFisher Scientific) alkalmazásával végeztük. 40-szeres erősítést alkalmaztunk a ciklus küszöbén (Ct értékek = 40). A mikroRNS-eket kizártuk a csoport-összehasonlításokból, amikor három csoportot meghaladó, meghatározatlan mintákat (Ct-érték> 40) figyeltünk meg a csoportban. Az expressziós értékek elemzéséhez ACCt módszert alkalmaztunk.

Statisztikai analízis

A digitális gén expressziójának empirikus elemzését a CLC Genomic Workbench 8.5.1 (Qiagen) verziójával a következő generációs szekvenálás mikroRNS expressziójának eredményeinek összehasonlítására használtuk. A hamis leletek alapján korrigált P értékeket (FDR-P értékek), amelyek kisebbek, mint 0,05, szignifikánsnak tekintettek az elemzés során.

A qPCR expressziós értékeket egyirányú varianciaanalízissel hasonlítottuk össze, amelyet Tukey post hoc assay követett. Három csoportos változókat normál tesztnek vetettek alá az adatok megoszlásának meghatározása érdekében. A normálisan elosztott adatokat átlagként (SD), a nem szabványosan elosztott adatokat pedig az első és a harmadik kvartilis (1. kvartilis és 3 kvartilis) mediánjaként fejezzük ki. A változókat a normál eloszlású adatok Tukey-féle többszörös összehasonlító tesztjével és a normálisan elosztott adatok Dunn-tesztjével elemeztük. A 0,05 alatti P értékeket szignifikánsnak tekintettük. A statisztikai elemzéseket Stat-Flex 6.0 verzióval (Artech, Osaka, Japán) és Graph Pad Prism 7.00 (Graphpad Software, La Jolla, CA) segítségével végeztük.

Becsléseink szerint egy korábbi vizsgálat alapján csoportonként 10 beteg volt a megfelelő mintaméret a feltárási szakaszhoz (20, 21). A qPCR validációs fázis mintaméretének becslése a = 0,05, β = 0,2 és a hatásméret = 0,5 alapján, három csoportban, a G * 3.1.9.2 teljesítmény felhasználásával (//www.gpower.hhu. De /) . Csoportonként tizennégy betegre volt szükség. Ezért 20 beteget vontunk be a csoportba.

az eredmény

Következő generációs szekvenálás (feltárási szakasz)

Asztal teljes méretben

mikropórusok

Az egyes csoportok összehasonlításának vulkanikus grafikonja és a három csoport hőtérképe. ( a ) Az FDR-korrigált P-értékekkel (FDR-P-értékek) 0,05-nél kisebb mikroRNS-ek nevét közlik. A mikroRNS-eket törzs-hurok szekvenciákként ismerték fel. A mir-1260a és mir-1260b esetében a szár-hurkok és az érett szekvenciák egy az egyben megfeleltetést mutattak. Az alkalmazott mikroRNS adatbázis a miRBase 21 volt (//www/mirbase.org/). ( b ) A teljes hőtérkép a jobb oldalon látható. A nagy kifejezési terület balra nyúlik ki. A Mir-486-1 és a mir-486-2 egyértelműen kontrasztot mutat a cianotikus veleszületett szívbetegségekben és a veleszületett szívbetegségekben a kontroll csoporthoz képest. FDR, hamis megállapítás.

Teljes méretű kép

qPCR (ellenőrzési szakasz)

Asztal teljes méretben

Differenciál mikroRNS-ek háromcsoportos összehasonlításban, amelyet qPCR validált. A Mir-486-3p, a mir-486-5p és a mir-155-5p szignifikánsan növekedett a cianotikus veleszületett szívbetegségek csoportjában. * A P + sejtek (a hematopoietikus differenciálódás előtt) és gátolják a normális CD34 + sejtek szuppresszióját in vitro és in vivo (23). A megnövekedett mir-486-5p mechanizmusról azt gondolják, hogy a keringő hemociták növelésével kompenzálja a krónikus szöveti hipoxiát. Az acyanotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknek nem volt rövid a jobbról balra, de gyakran krónikus szöveti hipoxiában szenvedtek a balról jobbra rövid rövidség okozta szisztémás hipoperfúzió miatt. Mind a keringő hemociták, mind a vér térfogatának növekedése ezért előnyösebb lehet kompenzációs mechanizmusként a mir-486-3p és a mir-155-5p emelkedéséhez (a vérképző differenciálódástól lefelé) veleszületett szívbetegség jelenlétében. Ennek eredményeként összhangban áll azzal a tendenciával, hogy az acyanotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél általában nem alakul ki eritrocitózis vagy trombocitopénia (4).

A Mir-155 egy hipoxia által kiváltott mikroRNS (24, 25). Modulálja a megakariopoézist, túlexpressziója pedig gátolja a megakariocita differenciálódást a Meis-1 és az Ets-1 transzkripciós faktorok szabályozásával (26). Ezért a mir-155 túlzott expressziója magyarázhatja az eritrocitózist és a thrombocytopeniát cianotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél. A Mir-155 szintén ismert, hogy szabályozza a hexokinase II-t, és növekedése elősegíti a hexokinase II és a fehérjék termelését (27). Az anaerob glikolízis elsősorban az eritrocitákat látja el energiával, mert a mitokondriumokat eltávolítják a retikulocitákból az eritrocita differenciálódás utolsó szakaszában (28).

Érdekes módon a mir-155 nemcsak az eritrocitózist, hanem az anaerob glikolízist is megkönnyíti az eritrocitákban, ami elősegíti a hipoxiához való alkalmazkodást. Ezenkívül a mir-155 expresszálódik limfocitákban, endoteliális sejtekben és simaizomsejtekben (29, 30, 31). Nemrégiben kimutatták, hogy a mir-155-nek antiangiogén és pro-arteriogén funkciói vannak az endothelsejtekben az 1-es típusú angiotenzin II-receptoron keresztül, és a makrofágokban az 1-es citokin-jelátviteli receptor szuppresszorán keresztül (32). Amikor a cianotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél keringő keringés alakul ki, mint például a fő aortopulmonáris artéria, a mir-155 megkönnyítheti a neovaszkularizációt.

Noha magyarázatot javasoltak a cianotikus szívbetegség kóros állapotaira, a mechanizmus továbbra sem tisztázott (4, 33, 34, 35). A mir-486-3p, mir-486-5p és mir-155-5p-t tartalmazó mikroRNS-asszociált mechanizmus lehet a legmegfelelőbb magyarázat mindmáig. Ezt támasztja alá az a tény, hogy a cianotikus veleszületett szívbetegségben csökkent a retikulált vérlemezkék száma, a normál trombopoietinszint (4) és a fokozott eritropoézis ellenére is fennmarad az eritropoietinszint kezdeti növekedése után (6). Egerekben a közelmúltban kimutatták, hogy a tüdő a terminális thrombocyta-termelés másik elsődleges helyszíne, ahol a megakaryocyták vándorolnak a csontvelőből és felszabadítják a vérlemezkéket (36 Ezért a jobboldali rövidzárlat megakariocita "rövidzárlatot" vált ki és felgyorsíthatja a trombocitopéniát (3. ábra).

Vázlata a veleszületett szívbetegségben előforduló véreltérések lehetséges mechanizmusának. A mir-486-5p növekedése növeli a CD34 + sejtek differenciálódását (a hematopoietikus differenciálódás előtt). A mir-486-3p és mir-155-5p növekedése a megakariocita progenitor sejtek és az erythroid progenitor sejtek differenciálódását indukálja (a hematopoietikus differenciálódástól lefelé). A jobb-bal rövidzárlat megakariocita "rövidzárlatot" vált ki és felgyorsíthatja a trombocitopéniát (36).

Teljes méretű kép

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a krónikus hipoxia gátolja a Dicer expresszióját és aktivitását, amely a prekurzor mikroRNS-eket érett formájukba dolgozza fel (37, 38, 39). Így az érett mikroRNS-ek expressziója a pre-mikroRNS-ek krónikus hypoxiában történő felhalmozódásával általában csökkent. Ezzel szemben a mir-155 és a pre-mir-155 egyaránt növekszik a hipoxiával és a leütéssel Dicer (27); A mir-486-3p és -5p hasonlóan viselkedhet ebben a vizsgálatban. Úgy tűnik, hogy a Dicer maradék előnyösen feldolgozza az ilyen pre-mikroRNS-eket, különben lebomlásuk késik a hipoxiában, de a részletes mechanizmus továbbra sem tisztázott (27).

Az sem világos, hogy az acycoticus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél csökkent mir-1260a és let-7e-5p hozzájárulnak-e a vérsejtek differenciálódásához. A keringő let-7e-5p downregulációját a kamrai septum hibáiban szenvedő betegeknél azonosították, ami arra utal, hogy ez szabályozó szerepet játszik a kamrai septum defektusainak kialakulásában (40). Az acyanotikus csoportba tartozó betegek többsége jelen vizsgálatban volt kamrai septum hibás betegeknél, és a let-7e-5p downregulációja is megfigyelhető volt az eritrocitákban. Összefoglaltuk a vérsejtek differenciálódásával kapcsolatos géneket, amelyek a mikroRNS-ek feltételezett célpontjai a további vizsgálatok alátámasztására (3. táblázat).

Asztal teljes méretben

A vizsgálat korlátja, hogy pusztán megfigyeléses volt. Nem végeztünk olyan jelentős mikroRNS-ek funkcionális elemzését, amelyek közvetlen bizonyítékot szolgáltatnának a cianotikus betegeknél előforduló véreltérésekről. Ezért további vizsgálatokra van szükség a mikroRNS-kombináció komplex mechanizmusának tisztázásához. A Mir-155-3p, a mir-140-5p és a mir-296 (-3p és -5p) a statisztikai pontosság érdekében kizárták a három qPCR csoport összehasonlításából, mert több mintában nem definiált Ct értékek (Ct értékek> 40) . Előnyösebb lehet megváltoztatni a Ct küszöböt ezen mikroRNS-ek kimutatásához. A kontroll és az acianotikus csoportokban lévő mir-140-5p minták csaknem fele nem érte el a küszöbértéket, bár amplifikációs görbét figyeltünk meg. Ennek oka lehet, hogy a mir-140-5p szintje általában alacsony volt, és nem patológiás körülmények között nehezen volt kimutatható. Az ilyen mikroRNS-ek esetében a következő generációs szekvenciák szekvenciagenerálása segíthet azonosítani a nyomváltozásokat.

További korlátozás, hogy a cianózis időtartama és mértéke változó volt az érintett cianotikus betegek körében, ami befolyásolhatja a mikroRNS termelését. A thrombocytopenia és az erythrocytosis mértéke cianotikus csoportunkban nem volt igazán súlyos. Ennek oka lehet az előbb leírtaknál korábban elvégzett műtéti eljárások (4, 33, 34, 41), ezáltal korlátozva a krónikus hipoxia időtartamát, összhangban a mir-155, egy hipoxia által kiváltott mikroRNS figyelemreméltó növekedésével a következő generáció és qPCR. Ezenkívül a korábbi műtét azt eredményezheti, hogy a cianotikus és acianotikus csoportba tartozó betegek fiatalabbak, mint a kontrollcsoport betegei. Ezenkívül a mir-486-5p szignifikáns változást mutatott a cianotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél. A normális CD34 + sejtek növekedése és a mir-486-5p eritroid differenciálódása elfedheti a mir-486-3p és mir-155-5p megakariociták differenciálódásának gátlásának hatását. Végül ebben a vizsgálatban a retikulocitákat nem távolították el, bár ezek a számok mindhárom csoportban hasonlóak voltak.

Végül a cianotikus és acyanotikus szívbetegségben szenvedő gyermekeknél az eritrocitákban számos mikroRNS expressziós szintje szignifikánsan nőtt vagy csökkent. Számos forma, köztük a mir-486-3p, a mir-486-5p és a mir-155-5p, hozzájárulhat a coxiás gyermekek másodlagos eritrocitózisának és trombocitopéniájának kialakulásához hypoxia után.

További információ

Word dokumentumok

Kiegészítő S1 táblázat

Kiegészítő táblázat S2

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

NM és Yo.N .: tanulmányterv, betegfelvétel, adatgyűjtés, adatelemzés és a kezdeti kéziratterv megírása; SM, TM, TS és Ya.N.: A tanulmány megtervezése, az adatok értelmezése és az eredeti kézirat megírása; TT: tanulmányterv és az eredeti kéziratterv kidolgozása; DIS: tanulmányterv (a statisztikai megközelítés felügyelete) és a fontos szellemi tartalom kéziratának kritikai felülvizsgálata; SI, SO és NT: betegek toborzása, adatgyűjtés és kezdeti kéziratírás.

Nyilatkozat a pénzügyi támogatásról

Ezt a munkát részben támogatták a japán oktatási, kulturális, sport-, tudomány- és technológiai minisztérium tudományos kutatásának támogatására szánt támogatások (26462370, 15K21287, 15K10542 és 17K11093 sz.).