absztrakt

Az agy erősen gazdag n-3 többszörösen telítetlen zsírsavban (PUFA), dokozahexaénsavban (22: 6n-3, DHA) és n-6 PUFA arachidonsavban (20: 4n-6, AA). Emlősöknél a DHA-t és az AA-t az étrendből nyerik, vagy szintetizálják úgy, hogy a megfelelő étrendi prekurzorokat, a-linolénsavakat (18: 3n-3) és linolsavat (18: 2n-6) deszaturálják/meghosszabbítják. 2 A DHA és az AA a membránfoszfolipidek sn-2 helyzetében észtereződik, ahol szerepet játszanak a membrán folyékonyságának szabályozásában, és a foszfolipáz általi felszabadulásuk után az A2 fontos szerepet játszik az agyi jelátvitelben, 3 neuroinflammation 4 és ezek megfelelő metabolitjai. 5 és a bipoláris rendellenesség. Az n-3 és n-6 PUFA membránok kiegyensúlyozott összetétele foszfolipidekben döntő fontosságú az agy normális működéséhez. 8, 9

mód

DHA számszerűsítés

Az összes lipidet Folch-módszerrel extraháltuk a frontális kéregből. Az extrakció előtt ismert mennyiségű 1,2-diheptadekanoil-sn-glicero-3-foszfokolint (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) adtunk a szövet egy részéhez belső standardként. Zsírsav-metil-észtereket úgy állítottunk elő, hogy az összes lipid-kivonat egy részét 1% H2S04-ben metanolban 70 ° C-on 3 órán át melegítettük. A metil-észtereket extraháltuk és 30 x 0,25 mm-es kapilláris oszlopon (SP-2330, Supelco; Bellefonte, PA, USA) elválasztottuk, lángionizációs detektorral végzett gázkromatográfiával (6890N modell, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, CA). USA). A kísérleteket 80 ° C hőmérsékleten, 160 ° C (10 ° C/perc) és 230 ° C (3 ° C/perc) hőmérsékleti gradienssel kezdtük 31 percig, és 10 percig 230 ° C-on tartottuk. A csúcsokat a zsírsav-metil-észter standardok retenciós ideje alapján azonosítottuk (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, USA). A DHA frontális kéreg koncentrációit (μmol/g nedves tömeg az agyban) úgy számítottuk ki, hogy a gázkromatográfiai csúcs területét arányosan hasonlítottuk össze a heptadekánsav belső standardjának (17: 0) területével. 34

Citoszol készítmény

Citoplazmatikus és magkivonatokat készítettünk a frontális kéregből a fent leírtak szerint. Röviden: a kérget 10 mM HEPES-ben (pH 7,9), 0,1 mM EDTA-ban, 0,1 mM M EGTA-ban, 1 mM DTT-ben, 10 mM KCl-ban, proteázinhibitor-koktélban (Roche, Indianapolis, IN, USA) homogenizáltuk. ) teflonüveg homogenizátorral. 0,5% NP-40 hozzáadása után további öt homogenizációs stroke-ot hajtottunk végre. A szuszpenziót 10 percig jégen inkubáltuk, majd mikrocentrifugában centrifugáltuk 13 000 g-nál 1 percig 4 ° C-on. A felülúszó túlnyomórészt citoplazmatikus komponenseket tartalmazott. A citoplazmatikus és a magkivonatok fehérjekoncentrációit Bio-Rad protein reagenssel határoztuk meg (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Western blot elemzés

A citoplazmatikus és a magkivonatokból származó fehérjéket (75 μg) 10-20% SDS-poliakrilamid géleken (PAGE) (Bio-Rad) választottuk el. Az SDS-PAGE után a fehérjéket elektroforetikusan átvittük egy nitrocellulóz membránra. A citoplazmatikus proteinek blokkjait egy éjszakán át inkubáltuk 5% nem szárított tejport és 0,1% Tween-20-at tartalmazó TBS pufferben, specifikus primer antitestekkel (1: 200 hígítás) a IVA cPLA2, IIA csoport sPLA2 és VIA iPLA 2 36 csoportokhoz ( Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Kalifornia, USA). A citoplazmatikus fehérje blokkokat megfelelő HRP-konjugált másodlagos antitestekkel (Bio-Rad) inkubáltuk, és kemilumineszcencia reakcióval (Amersham, Piscataway, NJ, USA) röntgenfilmen (XAR-5, Kodak) tettük láthatóvá. Az immunblot sávok optikai sűrűségét Alpha Innotech Software (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) alkalmazásával mértük, és az egyenlőtlen terhelés korrigálására β-aktinná (Sigma) normalizáltuk. Valamennyi kísérletet kétszer hajtottuk végre, és az értékeket a kontroll százalékában fejeztük ki.

A teljes RNS és a valós idejű RT-PCR izolálása

A teljes RNS-t a frontális kéregből izoláltuk az agy és a lipidszövet RNeasy mini készletével (Qiagen, Valencia, CA, USA). A cDNS-t teljes RNS-ből állítottuk elő nagy áteresztőképességű cDNS archív készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 és COX-2 mRNS szinteket kvantitatív valós idejű RT-PCR-rel mértük ABI PRISM 7000 szekvencia detektáló rendszerrel (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). A cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 vagy COX-2 génexpressziós tesztek (Applied Biosystems) specifikus primerei és próbái 20xx-os keverékből álltak jelöletlen PCR-primerek és Taqman minor groove-kötőanyag (MGB) szonda. festékkel jelölt). Az ismételt változásokat a génexpresszióban ACCT módszerrel határoztuk meg. 37 Az adatokat a célgén (cPLA2, sPLA2, iPLA2, COX-1 vagy COX-2) szintjeként fejeztük ki n-3 PUFA-nélkülöző állatokban, endogén kontrollra normalizálva (β-globulin) és a normalizált szinthez viszonyítva. n-3 PUFA-ban (kalibrátor) a fent leírtak szerint. 30, 38 Valamennyi kísérletet kétszer, három példányban hajtottuk végre.

2. Foszfolipáz A aktivitások

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± sem-ként fejezzük ki. A statisztikai szignifikanciát kettős, párosítatlan t-próba alkalmazásával számítottuk ki, P 10 értékre állítva. 15 hetes n-3 PUFA nélkülözés szignifikánsan (27%) csökkentette a frontális kéreg DHA-koncentrációját (12 ± 0,4 μmol/g agy) a v n-3 koncentrációig. 3 patkány, amely megfelel PUFA-nak (19 ± 0,5 μmol/g agy) (P = 0, 0001).

az n-3 PUFA nélkülözése csökkentette az iPLA2, a fehérje és az mRNS aktivitását

Tizenöt hetes n-3 PUFA nélkülözés patkányokban jelentősen csökkentette az iPLA 2 frontális kéreg aktivitását (21%) (1a. Ábra) az n-3 PUFA-val egyező patkányokhoz képest. Ezt a csökkenést az iPLA2 fehérje 27% -os csökkenése (1b. Ábra) és az iPLA2 mRNS 50% -os csökkenése kísérte az n-3 PUFA-val egyező patkányokhoz képest (1c. Ábra).

étrendi

IPLA2 tevékenységek ( a ), fehérje szintje b ) és az mRNS szintje ( c ) az n-3 PUFA frontális kérgében és patkánymentesen. IPLA2 aktivitás n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 8) patkányban (* P = 0,010) ( a ). Az immunblotok és az iPLA2 fehérje reprezentatív szintje n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 10) patkányban (* P = 0,024) ( b ). Az IPLA2 mRNS szintje n-3 PUFA megfelelő (n = 5) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 6) patkányban (* P = 0,021) ( c ). Az adatokat párosítatlan tesztekkel hasonlítottuk össze, átlag ± sem

Teljes méretű kép

az n-3 PUFA nélkülözése növelte a cPLA2 és sPLA2, a fehérje és az mRNS aktivitását

A CPLA2 aktivitás szignifikánsan megnőtt (83%) az n-3 PUFA patkányok patkányainak frontális kérgében, összehasonlítva az n-3 PUFA-val egyező patkányokkal (2a. Ábra). Ez a növekedés a fehérje (22%) (2b. Ábra) és a cPLA2 mRNS-expresszió (4-szeres) (2c. Ábra) szignifikáns növekedésével járt együtt az n-3 PUFA megfelelő patkányokkal összehasonlítva. A cPLA2-hez hasonlóan az 15 hetes n-3 PUFA nélkülözés szignifikánsan növelte az sPLA2 aktivitását (25%) (2d. Ábra), a fehérjét (36%) (2e. Ábra) és az mRNS expresszióját (4,6-szorosa) (2f ábra) az n- 3 megfelelő PUFA patkány.

cPLA2 aktivitás ( a ), fehérje szintje b ), az mRNS szintje ( c ) és az sPLA2 tevékenységek ( d ), fehérje szintje e ) és az mRNS-szintek ( f ) az n-3 PUFA és az n-3 PUFA nélkülözött patkányok frontális kérgében. cPLA2 aktivitás n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 8) patkányban (* P = 0,022) ( a ). Az n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és az n-3 PUFA nélkülözött (n = 10) patkányok reprezentatív immunblotja és cPLA2 fehérje szintje (* P = 0,010) ( b ). Az n-3 PUFA (n = 6) és az n-3 PUFA nélkülözött (n = 6) patkányok cPLA2 mRNS-szintje (*** P = 0, 0001) ( c ). sPLA2 aktivitás n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 8) patkányban (* P = 0, 040) ( d ). Az n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 10) patkányok reprezentatív immunblotjai és sPLA2 fehérje szintje (* P = 0, 020) ( e ). Az SPLA2 mRNS szintje n-3 PUFA megfelelő (n = 6) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 6) patkányban (*** P = 0, 00012) ( f ). Az adatokat párosítatlan tesztekkel hasonlítottuk össze, átlag ± sem

Teljes méretű kép

Az n-3 PUFA nélkülözés csökkentette a COX-1 fehérje szintjét, és növelte a COX-2 fehérje és mRNS szintjét

Tizenöt hetes n-3 PUFA nélkülözés szignifikánsan csökkentette a COX-1 fehérjét (28%) anélkül, hogy megváltoztatta volna annak mRNS szintjét (3a. És b. Ábra). A COX-2 fehérje (38%) és az mRNS szintje (2,4-szeres) szignifikánsan magasabb volt azoknál a patkányok frontális kérgében, amelyek étrendet fogyasztottak n-3 PUFA nélkül, azokhoz képest, akik megfelelő n-3 PUFA étrendet fogyasztottak (ábra 3c hirdetés).

COX-1 fehérje ( a ) és az mRNS-szintek ( b ), COX-2 fehérje ( c ) és az mRNS-szintek ( d ) megfelelő n-3 PUFA és n-3 PUFA nélkülözött patkányok frontális kérgében. Az immunblotok és a COX-1 fehérje reprezentatív szintje az n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és az n-3 PUFA (n = 10) nélkülözött patkányokban (* P = 0,03) ( a ). COX-1 mRNS-szintek n-3 PUFA megfelelő (n = 6) és n-3 PUFA nélkülözött (n = 6) patkányokban (P> 0,05) ( b ). Az immunblotok és a COX-2 fehérje reprezentatív szintje n-3 PUFA megfelelő (n = 10) és n-3 nélkülözött (n = 10) patkányban (* P = 0,002) ( c ). CO-2 mRNS-szint patkányokban, amelyek megfelelőek az n-3 PUFA (n = 6) és az n-3 PUFA nélkülözött (n = 6) patkányokhoz (* P = 0,033) ( d ). Az adatokat párosítatlan tesztekkel hasonlítottuk össze, átlag ± sem

Teljes méretű kép

vita

A DHA felszabadulását a foszfolipid membránból elsősorban az iPLA2 11, 40 szabályozza (4. ábra). Az n-3 PUFA nélkülöző patkányok agyában a DHA megnövekedett felezési ideje valószínűleg az iPLA2 aktivitás csökkenésének tudható be, amint ez a tanulmány megfigyelhető. Az iPLA 2 és a COX-1 közötti funkcionális kapcsolat megszűnik. Amikor különféle PLA2-t és COX-ot transzfektáltunk 293 emberi embrionális vesesejtbe, az iPLA2 nem tudott társulni a COX-2-vel a késleltetett PG bioszintetikus válasz alapján mérve, de párosítva a COX-1-gyel. Az n-3 PUFA nélkülözött patkányokban az iPLA2 fehérje expressziójának csökkenése megfelelt a csökkent COX-1 fehérje expressziónak. A patkány n-3 PUFA mRNS-ben azonban nem történt szignifikáns változás a COX-1 mRNS-ben. Ez arra enged következtetni, hogy a COX-1 változásokat poszt-transzkripcióval közvetítették.

A kölcsönhatások sematikus ábrázolása AA és DHA kaszkádokban. A membránfoszfolipideket cPLA2-vel vagy sPLA2-vel hidrolizáljuk, amelyek n-6 PUFA-t, AA-t és lizofoszfolipidet szabadítanak fel. Az iPLA2 katalizálja az n-3 PUFA, DHA és lizofoszfolipid felszabadulását. Az AA részt a COX-1 vagy 2 átalakítja eikozanoidokká, és a felszabadult DHA gátolhatja a COX-2 mRNS expresszióját, vagy katalizálhatja COX-2 vagy lipoxigenáz (LOX), így 13-OH-DHA 60 vagy más bioaktív anyagot kap. metabolitok. Vizsgálatunkban az n-3 PUFA 15 hete csökkentette az agy DHA-hiányát és az iPLA2 expresszióját, miközben növelte a cPLA2, sPLA2 és COX-2 expressziót. További részletekért lásd az áttekintést. 3, 61 * Ez a folyamat a DHA metaboliton keresztül történhet. PL = foszfolipid.

Teljes méretű kép

Számos tanulmány kereszttárgyat mutatott be a cPLA 2 és az sPLA 2 között. A cPLA2 szabályozza az sPLA2-függő AA és PGE2 termelést a lipopoliszacharid által kiváltott aktivált 17 makrofágokban és az sPLA2-hiányos oszteoblasztos sejtekben. A cPLA2 szabályozza az sPLA2 expresszióját és működését a fibroblaszt sejtekben. A 16 cPLA2 gátló blokkolja az sPLA2 által közvetített AA felszabadulást a makrofágokban 48, és patkány mesangiális és humán asztrocitoma sejtekből nyert adatok azt mutatják, hogy az sPLA2 képes aktiválni a cPLA2-t a PKC/Raf-1/MAPK jelátviteli útvonalon keresztül. 18, 19 Jelen tanulmányban az agy DHA-nélkülözése jelentősen megnövelte a cPLA2 és sPLA2, a fehérje és az mRNS aktivitását. Mivel a PLA2 szabályozza az AA felszabadulását/újrafeldolgozását foszfolipidekből, a megnövekedett cPLA2 és/vagy sPLA2 megmagyarázhatja az agy arachidonoyl-CoA fokozott megnövekedését 15 hét n-3 PUFA nélkülözés után. 10 További vizsgálatok az AA kinetikájának vizsgálatára n-3 PUFA nélkülözött patkányokban indokoltak annak tesztelésére, hogy az AA metabolizmus fokozott-e.

Az alacsony n-3 PUFA-tartalmú étrend a bipoláris rendellenesség megnövekedett kockázatával jár együtt 49, és az n-3 PUFA-val történő kiegészítés javítja a bipoláris zavar néhány tünetét. Az antimániás szerek (lítium, karbamazepin és valproát) terápiásán ekvivalens szintje csökkentette az AA, de nem a DHA forgalmát a patkány foszfolipidekben. 34, 50, 51, 52, 53 A lítium és a karbamazepin erre való képességét annak tulajdonították, hogy képesek csökkenteni a cPLA2 transzkripcióját és aktivitását patkányagyban, 34, 38, 50, 54, míg a valproát valószínűleg hosszú láncú acil- CoA. szintetázok. Mindhárom gyógyszer csökkentette a COX-2 aktivitását és az agy PGE2-jét patkányokban. 38, 50, 56, 57 Az n-3 PUFA tizenöt hetes megvonása növeli a depresszió és az agresszió arányát patkányokban, amelyekről úgy gondolják, hogy az emberek viselkedése megfelel a bipoláris rendellenességeknek. A cPLA2 és a COX-2 emelkedett szintje az n-3 PUFA nélkülözött patkányokban a jelen vizsgálatban ellentétes az antimikumokról beszámoltakkal, és alátámasztja azt a hipotézist, hogy ezek az enzimek ezeknek a gyógyszereknek a célpontjai. Ezenkívül a rágcsálók neuroinflammációjának indukciója növeli a cPLA2, sPLA2 és COX-2 expresszióját az agyban. 5, 58 Az étrend n-3 PUFA-val történő kiegészítésével megnövekedett agyi DHA-szint normalizálhatja a megváltozott AA jelátvitelt bipoláris rendellenességben és neuro-gyulladásban.

Végül 15 hetes n-3 PUFA nélkülözés csökkentette az iPLA2 és COX-1 expresszióját és aktivitását, miközben növelte a cPLA2, sPLA2 és COX-2 aktivitását és expresszióját patkány patkány kéregben. Az iPLA 2 csökkenése csökkentheti az agy DHA általi metabolikus veszteségét, meghosszabbítva ezzel felezési idejét. A cPLA2 és a COX-2 változásai ellentétesek az antimániás szer patkányoknak történő beadása után közzétett változásokkal, ami arra utal, hogy az n-3 PUFA nélkülözött patkányok hajlamosabbak lehetnek a gyulladásra és más agyi sérülésekre.