specifikus

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • az eredmény
  • Esetleírás
  • A teljes exom szekvencia az NDUFAF4 variánsait azonosítja
  • Az NDUFAF4 variáns izolált CI-hiányhoz vezet, amelyet a vad típusú NDUFAF4-vel végzett lentivirális komplementációval lehet megmenteni.
  • Az NDUFAF4-hiányos fibroblasztok CI-hiánya megváltozott szuperkomplex sztöchiometriát okoz
  • Az NDUFAF4 hiány CI szerelési köztitermékek felhalmozódásához vezet, amelyek a proximális P modul, a disztális P modul és az N modul komponenseit tartalmazzák
  • vita
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ
  • Képfájlok
  • További 1. ábra
  • További 2. ábra
  • További 3. ábra

elemeket

  • A betegségek genetikája
  • Anyagcserezavarok

absztrakt

Az I mitokondriális légzési lánc komplexum 44 különböző alegységből áll, és három funkcionális modulra osztható: Q-, P- és N-modulra. Az NDUFAF4 (C6ORF66) egy komplex I összeszerelési tényező, amely a Q modul összeszerelésének köztitermékeihez kapcsolódik. Exome szekvenálással azonosítottunk egy homozigóta missense variánst egy komplex, I-hiányos, Leigh-szindrómás betegben. A páciens fibroblasztjainak szuperkomplex elemzése kifejezetten megváltozott sztöchiometriát tárt fel. Az I. komplex összeszerelésének részletes elemzése, az összes szerelési útvonal megjelölésével megmutatta a P- és N-modul egyes részeinek felhalmozódását, a Q-modult azonban nem. A páciens fibroblasztjainak vad típusú NDUFAF4-vel végzett lentivirális komplementálása megmentette az I. komplex hiányát és a szerelési rendellenességet, megerősítve a variáns ok-okozati szerepét. Jelentésünk az NDUFAF4 variáns által érintett második családról tovább jellemzi a fenotípus spektrumot, és rávilágít az NDUFAF4 szerepére az I. mitokondriális komplex biogenezisében.

Az I mitokondriális légzési lánc (CI, NADH: ubikinon-oxidoreduktáz) az oxidatív foszforilációs rendszer (OXPHOS) legnagyobb alkotóeleme. L alakú és három funkcionális modulra osztható: Q-modulra (ubikinon redukció) és N-modulra (NADH dehidrogenáz), amelyek a mátrix karját alkotják, és a P-modulra (protonpumpa), amelyek a membrán- integrált kar.

A CI biogenezise összetett folyamat: 37 mag által kódolt és 7 mitokondriális kódolású alegység számos olyan összeállítási köztiterméket képez, amelyeket több párhuzamos és egymást követő lépésben állítanak össze, így egy teljesen összeállított komplexet alkotnak. Ezt követően a CI integrálódik olyan szuperkomplexekbe, amelyekben vagy a III (CIII) -dimer (I/III 2 -szuperkomplexek), vagy a CIII-dimer és a IV-es komplex (CIV, I/III 2/IV) egy vagy több másolatával társul. n - komplexek komplexei). 1

A CI-összeállítás számos olyan összeszerelési tényező hatásától függ, amelyek kapcsolódnak az összeszerelési köztitermékekhez, de nem részei magának a holoenzimnek.

Az NDUFAF4 (C6ORF66) Q-modul összeszerelési faktor kategóriába került, mivel a biogenezis során társul a Q-modul részegységeihez. 1 Ennek pontos funkciója azonban még nem tisztázott. A mai napig az NDUFAF4 egyik változatát írták le egy családban, amely befolyásolta a fehérje működését. 2 Itt bemutatjuk a beteget az NDUFAF4 új változatával, kibővítjük az NDUFAF4 hiányával járó fenotípust és elemezzük annak szerepét a KI biogenezisében.

Anyagok és metódusok

További információk online.

az eredmény

Esetleírás

A beteg a pakisztáni népcsoport túlélő (első unokatestvérek) szüleinek első gyermeke. A terhesség 38. hetében született a vajúdás kiváltása után a méhen belüli növekedés retardációja miatt. Súlya 2406 g volt.

7 hónapos korában megismertette a helyi gyermekorvosi szolgálatokkal mérföldköveinek csökkentése érdekében. Ritkán mosolygott, képtelen volt felborulni, támogatás nélkül ült és nem mosolygott. Diszmorf, alacsony súlyú, ingerlékeny gyermek volt. Központi hipotenziója volt, normál vagy kissé megemelkedett végtagi tónus, könnyen kiváltott ín térdreflexekkel és klón nélkül.

Az agyi MRI diffúz kétoldalú változásokat tárt fel a szignálban a bazális ganglionokban és a thalamusban, ami Leigh-szindrómára utal. Az EEG általános lassulást mutatott az epileptogén célzásnak megfelelő multifokális tüskékkel. Nem volt szív- és érrendszeri, vese- vagy májbetegség.

A vizeletben levő szerves savak elemzése a laktát, a ketonok és a Krebs-ciklus megnövekedett metabolitjait tárta fel. A plazma laktát 10,6 mmol/l, a CSF laktát pedig 6,1 mmol/l volt (referencia tartomány: 0,8-1,8 mmol/l). A betegből származó bőrfibroblasztokat olyan légzési lánc enzimaktivitás szempontjából vizsgáltuk, amely izolált CI-hiányt mutatott (32 mU/U citrát-szintáz, referencia tartomány: 163-599), a II, III, IV és V komplexek aktivitásával a referencia tartományban.

Két évvel a kezdeti vizsgálat után a páciensnek még mindig mély fejlődési késése van, PEG tubusos táplálás szükséges, és epizódos rohamai vannak.

A teljes exom szekvencia az NDUFAF4 variánsait azonosítja

Az NDUFAF4 gén homozigóta missense variánsát (NM_014165.3) exom szekvenálással azonosítottuk: c.7G> C; o. (Ala3Pro). Ez a változat nem található meg az ExAC adatbázisban (//exac.broadinstitute.org), az 1000 genom adatbázisban (//www.internationalgenome.org) vagy a belső adatbázisunkban. Az új változatot és a korábban közzétett változatot feltöltötték a "Leiden Open Variation Database" -be (//www.lovd.nl/NDUFAF4): Változat-azonosítók # 0000170856 és # 0000174214; # 00104960 és # 00107834 egyedi azonosító számok.

A variáns előrejelző szoftver megjósolta ennek a mutációnak a különböző funkcionális hatásait: Kóstoló mutátor (//www.mutationtaster.org/): 3 'polimorfizmus' (valószínűség: 0,84); PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/): 4 „valószínűleg káros” (pontszám: 0, 991); SIFT (//sift.jcvi.org/): 5 „káros” (SIFT pontszám 0,04). A szekvencia igazítás azt mutatta, hogy az aminosav-szekvencia 3. pozíciójában kicserélt alanin konzerválódott emlősökben (1. ábra).

Az NDUFAF4 variáns izolált CI-hiányhoz vezet, amelyet a vad típusú NDUFAF4-vel végzett lentivirális komplementációval lehet megmenteni.

Lentivirális komplementációt C-terminális V5-jelölt vad típusú NDUFAF4-vel végeztünk annak bizonyítására, hogy az NDUFAF4 variáns befolyásolja a fehérje működését (1. ábra). A CI enzimatikus aktivitást NDUFAF4 komplementerrel szabadítottuk meg, de nem V5-jelölt GFP-vel végzett szimulált transzfekcióval (1a. Ábra). A komplementáció a csökkent holo-Cl szinteket is megmentette, natív kék poliakrilamid gélelektroforézissel (BN-PAGE)/immunblottozással elemezve az 1-dodecil-β-D-maltozid mitokondriális fehérjét (1b. Ábra). A nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elemzett CI alegységek szintje szintén emelkedett a páciens komplementált fibroblasztjaiban (1c. Ábra). Az NDUFAF4 nem volt kimutatható a beteg sejtjeiben.

Teljes méretű kép

Az NDUFAF4-hiányos fibroblasztok CI-hiánya megváltozott szuperkomplex sztöchiometriát okoz

Mivel a CI szuperkomplexeket képez a CIII-val és a CIV-vel, és az utóbbi kettő szintje a CI hiánya ellenére sem változott, elemeztük a szuperkomplex sztöchiometriát. A szuperkomplex interakciók megőrzése érdekében a mitokondriális fehérjét n-ododecil-β-D-maltozid helyett enyhe detergens-digininnel szolubilizáltuk, és BN-PAGE/immunblottozásnak vetettük alá. Az NDUFAF4-hiányos fibroblasztok esetében a CI hiánya az I-III 2- és I/III/IV-n-szuperkomplexek csökkenéséhez vezetett (2a-c. Ábra) a CIII és III 2/IV dimerek megnövekedett szintjével . -superkomplexek (2b. és c. ábra). Figyelemre méltó, hogy a monomer CIV szintje változatlan maradt (2c. Ábra).

Teljes méretű kép

Az NDUFAF4 hiány CI szerelési köztitermékek felhalmozódásához vezet, amelyek a proximális P modul, a disztális P modul és az N modul komponenseit tartalmazzák

2D-BN-PAGE/SDS-PAGE kísérletekkel elemeztük az NDUFAF4 hiány CI-összeállításra gyakorolt ​​hatását a beteg fibroblasztjaiban (3. ábra). A BN-PAGE első dimenziójában natív fehérjekomplexeket (azaz OXPHOS-komplexeket) különítenek el (1b. Ábra). Az SDS-PAGE második dimenzió lehetővé teszi az epitóp elválasztását és jobb hozzáférhetőségét ezen natív fehérjekomplexek egyes komponenseinek, köztük a CI-összeállítási köztitermékek, immundetektálásához. Ezekben a kísérletekben antitesteket használtunk, amelyek az összes funkcionális modul összeszerelési köztitermékeinek reprezentatív komponensei, és így az összes CI összeszerelési út ellen irányultak (2. ábra). Az NDUFAF4 vagy NDUFS3 tartalmú Q modul részegységek már nem voltak kimutathatók a beteg fibroblasztjaiban, és nem halmozódtak fel. Az ACAD9 és ECSIT szerelési tényezőket tartalmazó proximális P-modul részegységek, az NDUFB11 CI alegységet tartalmazó disztális P-modulok és az NDUFV2 CI alegységet tartalmazó N-modul részegységek egyértelműen felhalmozódtak. A készlet ezen hibáit a páciens vad típusú NDUFAF4-gyel kiegészített fibroblasztjaiban mentették meg.

Teljes méretű kép

Az NDUFAF4 szorosan kapcsolódik az NDUFAF3, 1, 6, a CI összeállításának egy másik tényezőjéhez, amelynek hiánya hasonló szerelési hibához vezet. Mivel az NDUFAF3 feltételezhetően részt vesz a β-modul alegységek membránbeillesztésében, 6 több CI alegység eloszlását elemeztük a beteg fibroblasztjainak mitokondriális oldható fehérje frakcióiban és membrán fehérje frakcióiban (3. kiegészítő ábra). A kontroll és a beteg fibroblasztjaiban a detektált P-modul alegységeket a membránfrakcióban, az oldható frakcióban azonban nem.

vita

Jelentésünk előtt az NDUFAF4 egyetlen változatáról (c.194T> C; s. (Leu65Pro)) számoltak be egy olyan családban, amelyben több olyan beteg alakult ki, akiknél a születés után röviddel encephalopathia és tejsavas acidózis alakult ki. A betegek vagy az élet első hetében haltak meg kontrollálhatatlan acidózis miatt, vagy súlyos myopathia alakultak ki, károsodott a neurológiai fejlődés és a visszatérő metabolikus acidózis. Egy beteg agyi MRI-je 16 hónapos korban súlyos generalizált atrófiát és demielinizációt mutatott az agyban. Az újszülött korszakát túlélő betegek 9-18 hónapos korban távoztak instabil acidózis miatt.

Az ebben a kéziratban leírt beteg az NDUFAF4 missense új változatát hordozza, Leigh-szindrómát és fejlődési késést mutat. Ez kiemeli az NDUFAF4 hiány okozta neurológiai fenotípust, hozzáadva a spektrumához a meghatározott mitokondriális betegség Leigh-szindrómáját.

Noha az I komplex hiányhoz más OXPHOS komplexek hiányai is társulhatnak, a 9 CIII és CIV komplex I hiány esetén általában stabil, azonban ezeknek a környezetnek az eloszlását nem vizsgálták a betegek fibroblasztjaiban. Megmutattuk, hogy az I-hez kapcsolódó nem komplex CIII és CIV fajok nem ugyanúgy nőnek, hanem specifikusan megváltoznak, ha az I/III- és I/III/IV-n-helper komplexek képződése károsodik.

Az NDUFAF4 variánsok hatását a CI összeállítására a beteg fibroblasztjaiban nem vizsgálták. 2, 6, 11 Nemrégiben közzétett részletes humán CI összeállítási modellünk megmutatta, hogy a CI összeszerelési folyamata tükrözi annak moduláris felépítését: 1 különféle funkcionális modul alegységeit külön-külön állítják össze, és a legtöbb intermoduláris asszociáció csak a CI biogenezis utolsó lépéseinek lezárultával valósul meg. Az NDUFAF4 a Q-modul összeállításának köztitermékeihez van társítva. 1 Ez az asszociáció a CI korai összeállítása során jön létre, és fennmarad a biogenezis utolsó lépéseig, ahol az NDUFAF4 közvetlenül a CI összeállításának befejezése előtt disszociál.

A frakcionálási kísérletek nem mutattak ki β-modul alegységeket az oldható frakcióban, és így nem találtak bizonyítékot a membrán beépült károsodására a beteg fibroblasztjaiban. Korábbi vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az ND1 β-modul alegység gyorsabban bomlik NDUFAF4 hiányában. 12 Ez a mechanizmus tehát nem zárható ki teljesen, mivel a membránintegráció megszakadása és az alegységek azonnali azonnali lebomlása lehetséges.

Megmutattuk az összes modul egyes részeinek felhalmozódását, kivéve a Q modult, amellyel az NDUFAF4 csatlakozik. Az N- és a P-modul felhalmozódása másodlagos hatás lehet a Q-modul korlátozott összeállítása miatt. Ez azt is jelezheti, hogy NDUFAF4-re van szükség a külön összeállított P-modul és az N-modul összetevőinek a Q-modulhoz történő csatlakoztatásához. Az NDUFAF4 nagy valószínűséggel két szerelési lépéshez szükséges: (i) a P P- b/P D- és a Q/PP-a részhalmazok összekapcsolása a Q/P 1 részhalmaz létrehozásához, és (ii) egy N-modul hozzáadása a CI teljesítéséhez ( További 2. ábra).

Összefoglalva, tanulmányunk kiterjeszti az NDUFAF4 hiányával járó fenotípus spektrumot, és rávilágít az NDUFAF4 szerepére a CI összeállításában. A jövőbeni vizsgálatok az összeszerelési tényezők molekuláris hatásmechanizmusára összpontosítanak.