elemeket
absztrakt
A CC kemokinek blokádja vonzó, de még nem használt terápiás stratégia. Humán IgG1 Fc-hez fuzionált széles spektrumú vaccinia vírus (35 K) vaccinia vírus kemokin fehérje in vivo farmakokinetikáját közöljük. Megmutattuk, hogy egy fehérje in vivo aktivitása lekérdezhető egy standard emlős expressziós plazmid hidrodinamikai génbejuttatásával. A 35 K-Fc fehérje magas plazmaszintje a génátvitel után legalább 14 napig fennmarad, és a fehérje 5 hét után is kimutatható. Megerősítjük, hogy a fehérje biológiai aktivitással rendelkezik az akut gyulladásban, ami a monocita-toborzás jelentős csökkenését okozza a zymosan által kiváltott peritonitis során. A 35-K-Fc komplexebb patológiák blokkolására való képességét aorta emésztésekkel mutatják be, hogy meghatározzák az angiotenzin II által közvetített leukociták toborzását az aortába. Az angiotenzin II az mCCL2 upregulációját okozza az aortában, ami CCR2 + sejtek felhalmozódását okozza. Az aortába történő monocita-toborzás csúcsa 3 napon belül következik be, és ez a folyamat a CC kemokinektől függ, míg a 35 K-Fc hidrodinamikai beadása jelentősen csökkenti.
A krónikus gyulladásos betegségek, például az érelmeszesedés és a reumás ízületi gyulladás a halálozás és a morbiditás fő okai. A citokinek és kemokinek a gyulladás fontos mediátorai ezekben az állapotokban, és bár a citokinbiológiát olyan biológiai terápiák modulálják, mint például az Etanercept, egy TNF-receptort tartalmazó Fc-fúziós fehérje, amely csali receptorként működik, engedélyezett kemokin-célzott terápiák vannak. nagyon korlátozott 1. Noha a CCR5 antagonizmus a maraviroc blokkolja a HIV-bejutást, a krónikus gyulladásos megbetegedésekre a mai napig nincs engedélyezett kemokin-célzó gyógyszer 2 .
A kemokinek kicsi, oldható fehérje mediátorok, amelyek szabályozzák a leukocita transzmissziót. Ezeknek a molekuláknak a gyulladás vagy fertőzés helyén történő termelése szabályozza a leukociták toborzását. Ha ez a folyamat túlzóvá válik vagy nem megfelelően indul, krónikus gyulladás és kóros szövetkárosodás léphet fel 2. Számos kórokozó expresszálja azokat a fehérjéket, amelyek megkönnyítik a gazdaszervezet immunmenekülését azáltal, hogy semlegesítik a gazdaszervezet szempontjait, például a kemokin-termelést 3. A vaccinia vírus egy oldható 35 kDa fehérjét kódol, 35 K, amely minden emberi és egér CC-kemokinhez kötődik, tipikusan nagyobb kötési affinitásoknál, mint a natív 4-es, 5-ös, 6-os receptor kötő affinitása. Korábban kimutattuk, hogy az adenovírus vagy lentivírus által közvetített 35 K géntranszfer hatékonyan csökkenti az érelmeszesedést és a vénás graft betegségeket 7, 8. Más csoportok beszámoltak az allergiás gyulladás elnyomásáról a tengerimalac bőrén és a légúti gyulladás 5., 9. modelljén. Míg a vírusszállítás bebizonyította az anti-CC kemokin blokkolás hasznosságát a preklinikai betegségmodellekben, nem képes kezelni a dózis kérdéseit, és valószínűleg nem engedélyezik humán terápiára, ha génátadásra van szükség.
Az Fc-fúziós fehérjék terápiás gyógyszerként már jól beváltak, az FDA által jelenleg jóváhagyott kilenc. Az Fc domén, a humán IgG1 hozzáadása a jelenleg engedélyezett Fc-fúziók esetében számos előnnyel jár az új biológiai ágensek felépítésében. Az Fc domén képes kötődni az újszülött Fc receptoraihoz (FcRn), amelyek az endotheliális, epitheliális és bizonyos leukocita sejtekben expresszálódnak. A molekula FcRn-hez való kötődése megvédi a molekulát a lizoszómás bomlástól, ehelyett a molekulákat klathrinnel bevont üregeken keresztül fogják el, miközben továbbra is kötődnek az FcRn-hez, amely endoszomális rekeszekhez irányítja őket, amelyek lehetővé teszik számukra, hogy visszatérjenek a sejt felszínére és visszatérjenek a keringésbe. 11. Ez a tulajdonság drámai hatással van a szérum felezési idejére, az emberi IgG felezési ideje 23 nap. Az abatacept, egy CTLA-4 Fc fúziós fehérje felezési ideje meghaladja a 10 napot 10 .
Az Fc-fúziós fehérjék megkönnyítik az új biológiai anyagok tisztítását is, lehetővé téve standard antitest-tisztítási technológiák alkalmazását és azok kimutatását farmakokinetikai vizsgálatokhoz nagyon specifikus Fc-detektáló reagensekkel 12. Bár ez megkönnyítheti az új molekulák felépítését és előállítását laboratóriumi, nem pedig ipari körülmények között, az a képesség, hogy nagy mennyiségű fehérjét termeljen minimális endotoxin-szennyezettség mellett, mégis költséges és időigényes. Kisméretű fehérjetermelési kísérleteket kombináltunk annak érdekében, hogy bemutassuk 35 K-Fc fúziós fehérjénk egyszeri dózisú farmakokinetikáját és szisztémás biohasznosulását, ugyanazon emlős expressziós plazmid hidrodinamikai bejuttatásával, amelyet a fehérje előállításához használtak, lehetővé téve a fehérjék hatékonyságát Először is, több adagolási stratégiát kell kidolgozni, vagy nagy mennyiségű tisztított fúziós fehérjét kell előállítani. Hidrodinamikai adagolással bemutattuk CC-kemokin kötő fehérjénk, az R89A 35 K-Fc mutáns in vivo alkalmazhatóságát, amelyet először bemutattunk, hatékony az érgyulladás akut modelljében.
Anyagok és metódusok
anyagok
Hacsak másként nem jelezzük, az összes sejttenyésztő táptalajt és puffert az Invitrogen (UK) cégtől szereztük be. Az összes laboratóriumi vegyszer Sigma-Aldrich-től (Gillingham, Egyesült Királyság) származott, hacsak másképp nem jelezzük.
Minden állatkísérletet a Helyi Etikai Felülvizsgálati Bizottság etikai jóváhagyásával és az Egyesült Királyság 1986. évi Home Office Animals (Scientific Procedures) Actjével összhangban végeztek. Az egereket egyedileg szellőztetett ketrecekben helyezték el, 12 órás fény/sötét ciklus és szabályozott hőmérséklet mellett ( 20 ° C). C-22 ° C). Normál takarmány (Harlan, Egyesült Királyság) és víz ad libitum volt elérhető. A C57bl/J egereket a Harlan UK-től szereztük be, vagy homozigóta B6.129P2-Apoe tm1Unc/J-t használtunk, amelyeket beltérben helyeztünk el.
35 K-Fc fehérjetermelés és farmakokinetika
A 35 K-Fc fehérjét úgy állítottuk elő, hogy expressziós plazmidokat transzfektáltunk 293T sejtekbe, és protein A affinitással tisztítottuk, amint azt a fentiekben publikáltuk. A farmakokinetikai vizsgálatokat 5 μg 35 K-Fc fehérje ip injekcióval, majd peritoneális lemosással és plazma mintavétellel végeztük a gyűjtési időpontokban. A peritonealis öblítést úgy kaptuk, hogy a hashártyát öblítettük 5 ml PBS/5 mM EDTA-val post mortem.
35 K-Fc plazmid előállítása injekcióhoz
35 K-Fc és mutáns változatot állítottunk elő a pSecTag2 (C) vektorban (Invitrogen, Paisley UK), ahogyan azt korábban publikáltuk 13. Az injekcióhoz való DNS-t egy Maxi-prep alacsony enodtoxin tartalmú DNS-készlettel (Qiagen, Egyesült Királyság) készítettük, pirogénmentes eldobható műanyag felhasználásával. A plazmid DNS-t szövetkultúrában endotoxinmentes vízben oldjuk, alikvotáljuk és -20 ° C-on tároljuk. Az endotoxin szennyezettség szintjét a Limulous Amoebocyte Assay (QCL-1000) (Lonza, Egyesült Királyság) alkalmazásával értékeltük.
Hidrodinamikus szállítás
5 μg 35 K-Fc-t injektáltunk ip-ben a C57bl/6J egerekbe. A hashártya-üreget PBS-sel öblítettük, és az injekció után 7 napig gyűjtött egerekből plazmát készítettünk (n = 3 per időpont). 35 K-Fc koncentrációja a peritoneális öblítésben, az állatonkénti maradék mennyiségként számítva ( A ) és a plazmakoncentrációk ( B ) ELISA módszerrel határoztuk meg. A 35 K-Fc bioaktivitását kemotaxikus biológiai vizsgálattal határoztuk meg. Plazmát (10%) használtunk kemoattraktánsként a Boyden-kamra kemotaxis vizsgálatban. A plazmamintákba vándorló sejtek számát úgy számítottuk ki, hogy a vándorlási index normalizálódott a csak a puffer által megfigyelt véletlenszerű migráció mennyiségére ( C ). A RANTES 5. plazmakoncentrációt ELISA-val mértük ( D ). A 35 K-Fc plazmakoncentrációja korrelál a plazma bioaktivitásával ( E ). n = 3 per idõpont, statisztikai elemzés egyirányú ANOVA-val és Dunnett többszörös összehasonlító tesztje. * o
Az egereknek 1 vagy 10 ug 35 K-Fc plazmidot injektáltunk. A plazmát az injekció beadása után 72 órával összegyűjtöttük és protein A/G gyöngyökkel immunprecipitáltuk. A kapott kivált fehérjéket Western-blot segítségével azonosítottuk anti-Fc és anti-35 K antitestekkel, tisztított 35 K-Fc pozitív kontrollként és sóoldattal injektált állatokban. negatív kontrollként ( A ). Az egerek 1 μg 35 K-Fc-plazmid hidrodinamikus bejuttatását kapták, az egerek egyedi kohorszait összegyűjtötték az injekció beadása után 2–14 nappal, valamint izolált plazma- és májmintákat (n = 3-5 per időpont). A 35 K-Fc plazmaszintjét ELISA-val azonosítottuk ( B ) és a 35 K-Fc üzenetet specifikus 35 K taq-man szondák alkalmazásával értékelték valós idejű RT-PCR kísérletben ( C ) (* o
vita
Bemutattuk a 35 K-Fc reagensek in vivo alkalmazhatóságát a CC kemokinek patológiában betöltött szerepének tesztelésére. Megmutattuk, hogy a CC-kemokinek szisztémás, széles spektrumú gátlása hatékonyan csökkenti a myeloid sejtek toborzását a zymosan peritonitis hatására. Kimutattuk azt is, hogy a 35K-Fc blokkolhatja a monociták érkezését az AngII által vezérelt érgyulladás korai fázisában, és hogy a monociták preferenciális blokádja figyelhető meg, nem pedig a neutrofil visszanyerés. Ezenkívül bebizonyítottuk platformunk hasznosságát az új Fc-fúziós fehérjék tesztelésére anélkül, hogy nagy mennyiségű tisztított fehérjét kellene előállítani. Korábbi munkánk azt mutatta, hogy 35 K-Fc mutáns megváltoztatta a CC kemokinek blokkolásának képességét in vitro és lokálisan in vivo, amikor a gyulladás helyére szállították. Bebizonyítottuk, hogy 35 K-Fc fehérje jó egyszeri dózisú farmakokinetikával rendelkezik, és szisztémás aktivitással rendelkezik a megalapozott CC-kemokin-függő patológiákban.
A biológiai aktivitás bizonyítékainak megszerzése nagy mennyiségű fehérje termelése nélkül lehetővé teszi a gyorsabb előrehaladást, és elvileg a fehérjék nagyobb tartományának szűrését az aktivitás szempontjából. A kollagén által kiváltott arthiritis modellben tesztelt hasonló kemokin, amely gátolja a vaccinia vírus 35 K Fc fúziós fehérjét (vCCI), 200 μg-os többszöri adag beadását igényelte a biológiai hatás bizonyítása érdekében A kísérlet során ehhez egérenként 2 mg fehérje leadására volt szükség. Ez az adagolási rend a hatékonyság elvesztésével és a vCCI-Fc elleni erős testellenes válasz kialakulásával járt a kezelés megkezdését követő 14 napon belül 29. 35 K lentivirust expresszáltunk, és legalább 3 hónapig figyeltük meg a betegség funkcionális gátlását, sokkal hosszabb ideig, mint amennyi a vCCI-Fc7 alkalmazásával történt. Ha egy Fc-fúziós fehérje termelése fokozott immunválaszt eredményez, potenciálisan neo-antigének előállítása révén, ez ismét olyan dolog, amelyet át lehet szűrni a módosított plazmidok felhasználása érdekében, anélkül, hogy módosított fehérjéket alkalmazó többadagos kísérletekre lenne szükség.
A hatékony immunmoduláló terápiák, mint például a TNFα inhibitorok, erősen gátolják az immunbetegségeket, például a reumás ízületi gyulladást, de hatékonyságuk idővel elveszhet, ami második vonalbeli terápiát igényel. A citokinek, mint például a TNFα és a CC kemokin családok hatékonysága az alapvető immunfunkciókban, például a fertőzés elleni védekezésben, valódi aggályokat vet fel a betegségre gyakorolt jótékony hatások költség-haszon viszonyában, szemben a szervezet fertőzések és rákos megbetegedések kezelésének képességével. A TNFα-Fc terápiák sikere azonban azt jelzi, hogy a jól megfigyelt betegek nagy hasznot húzhatnak az anti-citokin terápiákból. A CC kemokinek olyan sok krónikus állapottal való összefüggése, mint az érelmeszesedés, az ízületi gyulladás és a gyomor-bélrendszeri betegség azt jelzi, hogy a CC-kemokin inhibitorok, mint például a 35 K-Fc mutánsaink, mind kísérleti eszközként hasznosak lehetnek e csoport molekula és mint potenciális terápiás szerek .
További részletek
Hogyan lehet idézni ezt a cikket: McNeill, E. és mtsai. A CC kemokin kötő Fc fúziós fehérjék hidrodinamikai génszállítása az akut vaszkuláris gyulladás megcélzásához in vivo. Sci. ismétlés. 5., 17404; doi: 10.1038/srep17404 (2015).