elemeket
absztrakt
A szubkután és intramuszkuláris zsírlerakódások a főtt marhahús-termékek fontos jellemző értékelése. Az intramuszkuláris zsírtartalomként azonosított márványozás hozzájárul a hús érzékenységéhez, lédússágához és ízéhez, amelyek fontosak a marhahús minősége szempontjából. Általánosságban elmondható, hogy a szubkután szövet elsőbbséget élvez az adipocitákkal való kitöltés, majd az intramuszkuláris területek után, ami kevesebb márványváladékhoz vezet. A szubkután zsír csökkentése és az intramuszkuláris lipidek felhalmozódásának javítása a modern marhahús-termelésben továbbra is nagy kihívást jelent 1. Az adipogenezis, az a folyamat, amelynek során az elő-adipociták differenciálódnak adipocitákká, döntő szerepet játszik a zsírszövet felhalmozódásában az állatokban 2, 3. A kiváló minőségű főtt marhahús előállításához elengedhetetlen a marhahús zsírraktározásának molekuláris mechanizmusainak pontos megértése.
Az elmúlt években a mély transzkriptóm szekvenálás fokozottan alkalmazzák a differenciálisan expresszált miRNS-ek azonosítását, valamint új transzkriptumok felfedezésének lehetőségét, beleértve az új alternatív izoformákat és a mi 4, 5, 6, 7 miRNS-eket is. A következő generációs szekvenálás (NGS) gyors fejlődésével a miRNS-ek tanulmányozása egyre elérhetőbbé válik, mint korábban 8, 9, 10, 11. A zsírlerakódás egy összetett biológiai folyamat, ahol a miRNS-ek szabályozó szerepet játszhatnak. A zsírszövetben a felhalmozódó bizonyítékok egyértelműen azt jelzik, hogy a miRNS-ek fontos szerepet játszanak a zsírsejtek differenciálódásában és a lipid anyagcserében 12, 13. Számos miRNS-ről, mint például let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-17-5p 18, miR-14 19 és miR-33 20, 21, 22, kiderült, hogy különböző jelátvitel útján szabályozzák az adipocita differenciálódást és a lipogenezist. útvonalak, beleértve a Wnt, a MAPK, a sejtciklus szabályozását és az inzulin útvonalakat. Fontosak azok a nukleáris receptorok is, mint a CCAAT/enhancer-kötő fehérjék (C/EBP), a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptorok (PPAR) és a kötő fehérjéket szabályozó szterin elemek (SREBP-k). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miRNS-ek részt vehetnek a szarvasmarha-lipidek zsírszövetben és izomban történő felhalmozódásában.
Életképes stratégiának bizonyult az adipogenezis és a zsírszövet felhalmozódásának mechanizmusainak vizsgálata a miRNS és/vagy mRNS expressziós mintázatok összehasonlításával a különböző szarvasmarhafajták között. Wang és mtsai. A 23. összehasonlítja az intramuszkuláris zsírgénexpresszió modelljét Wagyu × Hereford és Piedmontese × Hereford hibridek, valamint az adipogenezissel és lipogenezissel kapcsolatos gének együttesével, mint például az Adiponectin (ADIPOQ), Stearoyl-CoA desaturase (SCD) és a pajzsmirigy-induktor hormon. fehérje (THRSP), a Wagyu × Hereford 23 csoportban felfelé szabályozva voltak. Egy másik tanulmány összehasonlította a 24. ágban lévő számos hibrid szubkután zsírszöveti miRNS expressziós profilját. A különböző zsírraktározási jellemzőkkel rendelkező fajtatiszta szarvasmarhák összehasonlítása új információkkal szolgál a különböző miRNS-ek szerepéről.
A wagyu szarvasmarhák híresek magas márványosodásukról, vagyis az intramuszkuláris lipidek magas szintű felhalmozódásáról, míg egy másik ismert szarvasmarha-gazdaságban, a holsteini szarvasmarhákban sokkal kevesebb a márványozás, mint a Wagyu 25, 26-ban. A szarvasmarha-adipogenezis és a lipogenezis összehasonlító mechanizmusának kutatása során a Wagyu és Holstein szarvasmarhák közötti zsírraktározási különbség nagy figyelmet kelt. A Wagyu és a Holstein szarvasmarhák közötti zsírraktározási különbségről szóló korábbi tanulmányok főként olyan specifikus gének differenciális expressziójára koncentráltak, mint az SCD 27 és a preadipocita faktor 1 (Pref-1) 25. A miRNS expressziós mintázatában a mai napig nincs különbség a Wagyu és a Holstein marha között. Jelen tanulmányban nagy áteresztőképességű szekvencia-szűrést végeztek a szubkután zsírszövet miRNS expressziós szintjének összehasonlítására Wagya és Holstein között. Célunk a zsírszövet felhalmozódásának lehetséges miRNS-szabályozóinak azonosítása és új betekintést nyújtunk a szarvasmarha zsírtartalmának lehetséges mechanizmusaiba.
az eredmény
Kis RNS könyvtárak építése
A Wagyu (W) és a Holstein (H) szarvasmarhák közötti visszafelé növekvő zsírszövet differenciálisan expresszált miRNS-ek azonosításához W és H kis RNS könyvtárakat készítettünk. Az Illumina szekvenálás segítségével összesen 12 435 335 és 10 962 269 nyers adatot nyertünk a W és H könyvtárakból. Alacsony minőségű szekvenciák, polyA, 18-nál rövidebb vagy 45 nt-nál hosszabb szekvenciák, valamint 10, 974, 628 (88, 32) szekvenciák után %) és 9, 417, 372 (85, 96%) tiszta leolvasást kaptunk a W és H könyvtárakból további elemzés céljából (1. táblázat). A két könyvtár kis RNS-hosszeloszlása azt mutatta, hogy a leggyakoribb fajok 21-22 nt hosszúak voltak, ami a Dicer-származékok termékeinek tipikus mérettartománya (1. ábra). Ezeket a megtisztításokat azután összehangolták az Rfam adatbázissal, hogy kiszűrjék a nem kódoló RNS-eket, mint például a tRNS, rRNS, snoRNS és snRNS. Összességében a W és H könyvtárak összes kis RNS-jének 35, 28% és 33, 46% különböző értékét azonosítottuk konzervált miRNS-ként, ami azt jelzi, hogy a szekvenálás ebben a vizsgálatban sikeres volt (2. ábra).
Asztal teljes méretben
Teljes méretű kép
Teljes méretű kép
Ezután a szűrt számlálókat a szarvasmarha-genomhoz igazítottuk, és a leképezett miRNS-szekvenciákat úgy választottuk ki, hogy a BLAST és miRBase összehasonlítva konzervált miRNS-eket azonosítottak, és kiszámították azok expressziós szintjét. 208 konzervált miRNS-t sikerült sikeresen azonosítani mind a W, mind a H könyvtárban. Ezenkívül 48 miRNS-t expresszáltak specifikusan a holsteini szarvasmarhák hátsó zsírjában, 14 miRNS-t pedig csak Wagyu szarvasmarhákban (3. ábra). Azokat a szekvenciákat, amelyek nem egyeztek a konzervált miRNS-ekkel, új myRNS-ek előrejelzésére használták. A milliliterenkénti transzkriptumértékek (TPM) elemzése kimutatta, hogy a W és H könyvtárakban az első tíz nagyszámú miRNS a teljes miRNS-ek 60% -át tette ki, beleértve a let-7 14-et, miR-143 15, 16, 17, miR-21-5p 28, miR-27b 29, 30, 31 és miR-378 32, amelyek állítólag korábban részt vettek az adipocita differenciálódásban (4. ábra).
Teljes méretű kép
Teljes méretű kép
Differenciálisan expresszált miRNS-elemzés Wagyu és Holstein szarvasmarhák között
Ebben a szekvenálási vizsgálatban a mindkét könyvtárban expresszált miRNS expresszió szintjét TPM-rel számszerűsítettük, ha a TPM | log2FC | ≥ 1 és FDR-korrigált p-érték
Teljes méretű kép
A miRNS célgének GO és KEGG útvonalainak feljegyzése
A miRNS-fehérje kölcsönhatás elemzése
A miRNS-fehérje interakciós hálózatot azért hoztuk létre, hogy feltárjuk a jósolt célgének kapcsolatát a PPAR jelátviteli útvonalon, és a miRNS-eket a potenciális szabályozók azonosítására irányítottuk (6. ábra). Ábrán bemutatott adatokkal összhangban. Az 5. eredmény azt mutatja, hogy a PPARα és az RXRα központi szerepet játszott a PPAR jelátviteli útvonalban, és célpontok lehetnek a bta-miR-196b és a bta-miR-874 által szabályozottak.
Teljes méretű kép
A miRNS szekvenálás validálása qPCR segítségével
4 különböző módon expresszált miRNS expressziós szintjét választottuk ki és igazoltuk qRT-PCR-rel (7. ábra). A miRNS szekvenálási adatokkal összhangban a 4 véletlenszerűen kiválasztott miRNS qRT-PCR eredményei hasonló expressziós mintát mutattak a két könyvtárban, ami megerősítette, hogy szekvencia adataink megbízhatóak voltak.
A relatív kifejezésértékek összehasonlítása ( A ) és a TPM ( B ) négy kiválasztott, differenciálisan expresszált miRNS-ből. ( A ) A kiválasztott miRNS-ek relatív expressziós szintjét kvantitatív valós idejű PCR-rel mértük, az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki. **, *** 35. o. A miRNS-ek pontos szerepe a szarvasmarha-zsír lerakódásában azonban korántsem egyértelmű. Ebben a tanulmányban nagy áteresztőképességű RNS szekvenálást végeztünk a Wagyu és Holstein szarvasmarhák között különböző zsírtartó tulajdonságokkal társuló miRNS azonosítására. Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a miR-142-3p, miR-379 és miR-196a expressziós szintje magasabb volt a Wagyu szarvasmarha zsírszövetében, mint Holsteiné (2. táblázat). Chartoumpekis és mtsai tanulmányai. (2012) és Meale és mtsai. (2014) arról is beszámolt, hogy ezek a miRNS-ek szabályozzák a lipogenezist és a zsír tárolását más állatokban 36, 37. Összességében ez a tanulmány azt mutatja, hogy a Wagyu szarvasmarhákban az intramuszkuláris zsír magasabb szintje részben ennek a 3 erősen expresszált miRNS-nek tulajdonítható.
Érdekes módon a bta-miR-320a a tíz legmagasabb mennyiségben elterjedt miRNS-ben is szerepelt, és szignifikánsan eltérő expressziós profilt mutatott a Wagyu és a Holstein szarvasmarhák között (P 38. A MiR-320 család elősegíti az adipogenezist azáltal, hogy blokkolja más MSC (azaz osteoblast) differenciálódást Egy másik tanulmány azt is megállapította, hogy a miR-320 az inzulin-PI3K jelátviteli útvonalon keresztül szabályozza az inzulinrezisztenciát. Jelenlegi eredményünk mellett a miR-320 fontos szerepet játszik az adipogenezisben és az ebből adódó különbségben a Wagyu és Holstein szarvasmarhák közötti zsírraktározásban.
Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a miR-136, miR-190a, miR-411a, miR-708, miR-1940 és miR-2887 expressziós szintje szignifikánsan magasabb volt Wagyuban a holsteini szarvasmarhákhoz képest (P 40. A Notch jelátviteli út kulcsfontosságú út a sejtek ontogenezisében és differenciálódásában. 41. Számos korábbi tanulmány rámutatott a Notch útvonal szerepére az adipocita előtti differenciálódásban, és arra utalt, hogy a Notch jelátviteli út aktiválása gátolhatja a 42, 43, 44, 45 adipocita differenciálódását. a jelen vizsgálatban 8 miRNS célgén, köztük Delta-szerű protein 1 (DLL1), polaritási szegmens homológ fehérje homológ DVL-3 (DVL3), hiszton-acetil-transzferáz KAT2A (KAT2A), gamma-szekretáz PEN-2 alegység (PSENEN), transzkripció HES-5 faktor (HES5), hiszton-dezacetiláz 1 (HDAC1), E3 ubiquitin-protein ligáz DTX4 (DTX4) és E3 ubiquitin-protein ligáz DTX2 (DTX2) részt vett a Notch jelátviteli útvonalban, ami arra utal, hogy néhány miRNS szabályozza az adipocita differenciálódást. a Notch útvonalon keresztül.
következtetés
Ebben a tanulmányban nagy áteresztőképességű kicsi RNS-szekvenálást használtunk, hogy összehasonlítsuk a Wagyu és Holstein szarvasmarhák közötti zsírtartalmú miRNS szintjét. Eredményeink alapján ez az első tanulmány a zsírszövet miRNS profiljairól a Wagyu és a Holstein szarvasmarhák között a zsírraktározás lehetséges mechanizmusainak vizsgálatára. Vizsgálatunk során számos miRNS-t azonosítottak, amelyek az adipogenezist a célpontjaikon és a kapcsolódó útvonalakon keresztül szabályozni tudják. Közülük a felfelé szabályozott bta-miR-196b és a lefelé szabályozott bta-miR-874 befolyásolhatja a PPAR útvonal jelátalakítását az útvonalba bevont célpontok által, és ezután szabályozhatja a zsírraktározást. Eredményeink olyan mikroRNS-ekről nyújtanak információkat, amelyek két különböző szarvasmarhafajta szubkután zsírjában eltérő módon expresszálódtak, különböző márványlerakódási szintekkel, jobb megértést nyújtva a szarvasmarhazsír-lerakódás molekuláris mechanizmusairól.
Anyagok és metódusok
Kísérleti állatok és a minta előkészítése
Valamennyi kísérletet a vonatkozó irányelveknek és rendeleteknek megfelelően hajtották végre, amelyet a Kínai Népköztársaság Mezőgazdasági Minisztériuma indít. Az összes kísérleti protokollt a Kínai Agrártudományi Akadémia Állattudományi Intézete hagyta jóvá, ahol a kísérletet elvégezték.
Ebben a tanulmányban a Wagyu és Holstein szarvasmarhákat a Beijing Huairou Wagyu Technology CO (Peking, Kína) és a hústermelő cég, a Langfang Xingcheng (Hebei, Kína) biztosította. Öt hím Wagyu és öt hím, körülbelül 30 hónapos holstein szarvasmarhát szelektáltunk a hátsó bőr alatti zsírszövet gyűjtésére a 12. és 13. borda között. A zsírszövetet az állatok leölése után azonnal eltávolítottuk és azonnal folyékony nitrogénben tároltuk a további RNS-ek extrahálásához.
Kis RNS könyvtárak felépítése és szekvenálása
A teljes RNS-t a zsírszövetből TRIzol (Invitrogen, USA) alkalmazásával extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Öt Wagyu vagy Holstein szarvasmarha összes RNS-jének (10 μg) alikvot részeit egyenlő mennyiségben összekevertük, hogy összegyűjtött mintát képezzünk, mint W könyvtár (Wagyu szarvasmarhák) és H (Holstein szarvasmarhák). A teljes RNS-koncentrációt NanoDrop 2000 spektrofotométerrel (GE rendszer, USA) és Agilent 2100 bioanalizátorral (GE rendszer, USA) mértük. A kis RNS-eket PEG-8000 (Sigma, USA) alkalmazásával izoláltuk, az RNS-t 3'-adapterrel ligáltuk, majd denaturáló poliakrilamid-gélelektroforézissel 15% -os méret szerint frakcionáltuk. 36-44 nt frakciókat kapunk, és az 5'-adapterhez kötjük. A kis RNS-frakciókat reverz átírással írtuk le, majd PCR-rel amplifikáltuk, az amplikonokat 3,5% -os agarózgélre töltöttük, könyvtárként 140-160 bp-os frakciókat kaptunk. A kis RNS-könyvtárakat qPCR-rel szűrtük, és a koncentráció nagyobb volt, mint 2 nM, ami azt jelzi, hogy a könyvtárak megbízhatóak. A W és H könyvtárakat ezután Hiseq-2000 alkalmazásával szekvenáltuk.
Kis RNS-szekvenciák bioinformatikai elemzése
A könyvtárakból nyert nyers olvasmányokat először Cutadapt szoftverrel és a FASTX eszköztárral dolgozták fel, hogy tiszta olvasást kapjanak a FASTQ fájlokban. A szekvencia adatminőségének értékelését, beleértve az alapeloszlást, a GC arányt, a PCR duplikációt és a törzs frekvenciáját, FastQC szoftver segítségével értékeltük. Az RNS szekvenciák hosszeloszlásának elemzésére a FASTX eszköztár FASTQ Information funkcióját használtuk. A könyvtárakból nyert tiszta kicsi, 18 és 45 nt közötti RNS-szekvenciákat összehasonlítottuk az Rfam adatbázissal (Rfam 10.0), Rfamscan és Blastn alkalmazásával az rRNS, scRNS, snRNS, snoRNS és tRNS-ek eltávolítására 51. A különbözõ szekvenciák többi részét felhasználtuk a miRBase (miRBase19.0) keresésére a miRDeep2 alkalmazásával az 52, 53 konzervált miRNS azonosítására. Az új miRNS-jelöltek előrejelzéséhez szekvenciákat térképeztek fel a szarvasmarha-genomban az ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/bos_taurus/dna/ oldalról bowtie2 segítségével, és kiszámoltuk a miRDeep2-t.
Differenciálisan expresszált miRNS azonosítás és cél előrejelzés
A miRDeep2-ből a W és H könyvtár között azonosított konzervált miRNS-ek számát használtuk az 54 expresszió elemzésére. A miRNS expresszióban mutatkozó különbség jelentőségének értékeléséhez a számlálási adatsor kiszámításához az R csomaghoz tartozó "edgeR" 55 programot használtuk. Érdemes megjegyezni, hogy elkerüljük a hamis pozitív eredményeket, csak a TPM s | log2FC | ≥ 1 és FDR-korrigált p-érték 56 .
Gén ontológia (GO) és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) miRNS célgénjeinek megjegyzései és a miRNS-fehérje interakció elemzése
A szkrínelt miRNS célgének GO-analízisét az Annotation, Visualization and Integration Database (DAVID) 57 segítségével becsültük meg a potenciális biológiai folyamatok és funkciók előrejelzésére, amelyekre a miRNS valószínűleg hatással volt. A legfontosabb GO-kategóriákat, biológiai funkciókat és különféle kanonikus útvonalakat elemeztük a miRNS-specifikus célok, valamint az összes tesztelt cél esetében, szignifikáns gén-túlzott expresszió alapján, Fisher-teszt segítségével. Ezután a miRNS célgéneket annotáltuk a KEGG útvonalban a DAVID 58 alkalmazásával. Ezenkívül a String adatbázist (//string-db.org/) használtuk a célgén miRNS-mRNS interakciós hálózatának előrejelzésére.
qPCR validálás az azonosított miRNS-ekről
A 3 differenciálisan expresszált miRNS, a bta-miR-320a, a bta-miR-874 és a bta-miR-1247-3p, valamint a jósolt új miRNS expressziós szintjét véletlenszerűen választottuk ki, és qRT-PCR-rel ellenőriztük. Röviden, a szarvasmarha hátsó zsírjából kivont teljes RNS-t reverz átírással kaptuk a cDNS-hez. Ezután valós idejű PCR reakciót hajtottunk végre a miRNS expressziós szintek mérésére. Valamennyi reakciót három példányban hajtottuk végre 10 μl reakciótérfogattal (5 μl 2 x LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 0,2 μl PCR primer, 0,2 μl PCR reverz primer, 1 μl cDNS és 3,6 μl nukleáz). H20) és inkubáljuk (95 ° C 10 percig, majd 40 ciklus 95 ° C-on 10 másodpercig, 60 ° C-on 30 másodpercig). Az összehasonlító Ct módszert és az U6 belső kontroll miRNS gént alkalmaztuk a relatív génexpressziós szintek kiszámításához. Valamennyi qPCR reakció egyetlen csúcsot adott a disszociációs görbén, ami specifikus amplifikációkat jelzett.
Statisztikai analízis
TPM-et alkalmaztunk a miRNS expressziós szintek értékelésére, és a képlet alapján számítottuk ki. A képletben a könyvtárosítás az összes azonosított miRNS teljes számát jelenti, a miR_readscounts pedig a specifikus miRNS-ek számát.
A megcélzott géndúsítási elemzés feldolgozásakor a hiperggeometrikus eloszlást és a pontos Fisher-vizsgálatot használtuk a p-értékek kiszámításához az alábbi képlet segítségével. Az a képlet a célgének számát jelenti a GO vagy a detektálandó út kifejezésben, b nem nem cél géneket, a nem cél gének száma helyettesíti az azonos kifejezés nem cél gének számát, c a számot a célgének későbbi kifejezéseiben, más dátumokban. Mivel ez egy többszörös teszt, a p értékeket a hamis felfedezési arány (FDR) módszerrel állítják be.
Az összes qPCR adat átlag ± SD. Amikor összehasonlításokat végeztünk, a Student t-tesztjét SPSS 17.0 (IBM, USA) és p