elemeket
absztrakt
Mycobacterium avium subsp. a paratuberculosis (MAP) és az Epstein-Barr vírus (EBV) epitópok következetes humorális választ váltanak ki a sclerosis multiplexben szenvedő betegek szérumában, de a homológ mielin bázikus fehérje (MBP) és a humán interferon 5 szabályozó faktor (IRF5) keresztreakciója nem volt agyi spin CSF-ben). Értékeltük az SM-ben és más neurológiai betegségekben (OND) szenvedő betegek szérumát és CSF-jét az EBV/MAP peptidek és az IRF5/MBP elleni humorális válasszal. Adataink azt mutatták, hogy az EBV és a MAP peptidek képesek specifikus humorális immunválasz kiváltására SM-ben szenvedő betegeknél, összehasonlítva az OND kontrollokkal a szérumban és a CSF-ben. SM-ben szenvedő betegeknél az IgG intratekális specifikus szintézisét figyelték meg az MBP ellen, valamint az EBV és MAP homológjukat, amint azt az antitestindex jelzi. Az EBV, MAP, MBP és IRF5 elleni humorális válasz szignifikánsan magasabb volt MS-ben szenvedő betegeknél, mind a szérum, mind a CSF OND esetén. Az anti-MBP antitestek, valamint a CSF-ben homológ MAP és EBV nagyobb mértékű jelenléte relapszusok idején a kórokozók lehetséges szerepére utal a gyulladás fokozásában.
az eredmény
CFS/szérumalbumin arány és Link index
Valamennyi minta esetében a Link-indexet az intrathecalis IgG-szintézis általános markerként, a CSF/szérumalbumin (Q Alb) arányát, mint a BBB integritásának markerét, valamint a különböző típusú BBB-károsodást mutató minták százalékos értékeként értékeltük. 1. táblázat: A BBB MS csoportokban nem figyeltünk meg statisztikailag szignifikáns károsodást a többi csoporthoz képest, amit a Link index és a CFS/albumin arány bizonyít.
Asztal teljes méretben
Elisa
A látens és lítikus EBV fehérjék elleni hasmenést az EBNA1 és BOLF1, a MAP és az emberi homológ peptideket monitoroztuk SM-ben szenvedő betegek szérumában és CSF-jében, valamint az IND, NIND, UND 5 kontrollokban. Az abszolút versus EBNA1 400–413-at 43 (60%) SM-beteg közül 26-ban találták, míg a 17 (18%) IND kontrollból 3, a 11 (18%) NIND közül 2 és csak egy UND volt pozitív a szérumban (AUC = 0,74, p = 0,001) (1A. Ábra). A CSF-ben a 43 (40%) MS-ből 17, a 33 (10%) IND-ból 3, a 11 NIND és 5 UND beteg közül egyik sem (AUC = 0,80, p = 0,001) talált pozitívnak (1B ábra). . A MAP_106c esetében 121–132, 43-ból (63%) SM-ből 27, 17-ből 4 (17%) IND, 4-ből 11 (36%) NIND és 1 UND volt pozitív (AUC = 0,73, p = 0, 008) szérumban (1C. ábra), míg SM-ben szenvedő 43-ból 23 (54%) 23, 3-ból 17 (18%) IND, 2-ből 11 (18%) NIND és egyik UND-kontroll sem reagált a MAP_106c 121-132-re. CSF (AUC = 0,71, p = 0,02) (1D. Ábra). Az MBP 85-98 iránti pozitivitást 43-ból (63%), SM-ben szenvedő betegből 27-ben, 5-ből 17-ben (29%) IND, 4-ben 11 (36%) NIND-ből és csak egy UND-t találtak a szérumból (AUC = 0, 71, p = 0,03) (1E. ábra). Az MS betegek körében a CSF-ben hasonló helyzetet figyeltünk meg, az SM 33% -ában, 27% IND-ban, 10% NIND-ben és 0% UND-ben szenvedő betegeknél az MBP pozitivitás 85-98 volt (AUC = 0,7, p = 0,03) (1F ábra ).
Negyvenhárom beteget, tizenhét IND-ot, tizenegy NIND-t és 5 UND-t vizsgáltak az EBNA1 400-413, MAP_0106c 121-132, MBP 85-98, szérum ( A, C, E ) és a CSF. ( B, D, F ). A vízszintes fekete sávok az átlagértéket képviselik, míg a p értékeket két nyíl mutatja, amelyek mindegyik eloszlás tetején olvadnak. Az ROC elemzéssel kiszámított pozitivitási határokat szaggatott vonalak jelzik.
Teljes méretű kép
Negyvenhárom beteget, tizenhét IND-ot, tizenegy NIND-t és 5 UND-t teszteltünk a reaktivitásra a BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 és IRF5 424-434 szérummal bevont lemezek ellen ( A, C, E ) és a CSF ( B, D, F ). A vízszintes fekete sávok az átlagértéket képviselik, míg a p értékeket két nyíl mutatja, amelyek mindegyik eloszlás tetején olvadnak. Az ROC elemzéssel kiszámított pozitivitási határokat szaggatott vonalak jelzik.
Teljes méretű kép
Asztal teljes méretben
Asztal teljes méretben
Korrelációs elemzések
A peptid pozitivitás közötti összefüggés meghatározására korrelációs elemzéseket végeztünk. Jó korrelációt találtunk az EBNA1 400-413 peptiddel a szérumban található MAP_106c 121-132 homológ peptiddel (R2 = 0,57; P 2 = 0,4; p
Scatter diagram, amely az EBNA1 400-413 és a MAP_0106c 121-132 közötti összefüggéseket mutatja a szérumban A ) a CSF-ben ( B ). EBNA1 400-413 és MAP_0106c 121-132 szérum MBP 85-98 ( C, E ) a CSF-ben ( D, F ) SM-ben szenvedő betegeknél. A Pearson-korrelációt a Graph Pad 6 segítségével számoltuk ki.
Teljes méretű kép
Jobb összefüggést találtunk a Absol BOLF1 305-320 és a MAP_4027 18-32 peptid között CSF-ben is (R2 = 0,54; p
Scatter diagram, amely a BOLF1 305-320 és a MAP_4027 18-32 közötti szérumban mutat korrelációt ( A ) a CSF-ben ( B ). BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 szérum IRF5 424-434 ( C, E ) a CSF-ben ( D, F ) SM-ben szenvedő betegeknél. A Pearson-korrelációt a Graph Pad 6 segítségével számoltuk ki.
Teljes méretű kép
Verseny teszt
A MAP/EBV és maguk az epitópok közötti keresztreaktivitás bemutatásához két kompetitív vizsgálatot dolgoztunk ki: az egyik MBP 85-98 bevonatot a lemezen, a másik IRF5 424-434 bevonatot a lemezen (5A, B, ill. Ábra). Az MBP 85-98 bevonatú versenyvizsgálathoz (5A. Ábra) minden CSF alanyban (MS # 1, MS # 2 és IND) mind az EBNA1, mind a MAP106 hatékonyan gátolta az antitestek kötődését az MBP-vel bevont peptidhez. Az IRF5 424-434 (5B. Ábra) kompetitív vizsgálatában mind a BOLF1, mind a MAP 4027 hatékonyan gátolta az IRF5 424-434 bevonatú kötődést minden CSF alanyban (MS # 1, MS # 2 és IND), míg a MAP 2694 kontroll peptidek nem okoz semmilyen jelcsökkenést (5A, B ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az Abs anti-EBNA1 és az anti-MAP106 ugyanazt a konformációs MBP epitópot célozza meg, és azt is bizonyítják, hogy az azonos antiformális IRF5 epitópra célzott Abs anti-BOLF1 és anti-MAP 4027 keresztreaktívak a CSF-ben.
Versenypróba MBP-vel bevont ELISA lemezekkel ( A ) és IRF5 ( B ). ( A ) 2 SM-es és 1 IND-os beteg CSF-ét éjszakán át inkubáltuk [10 μM] MAP2694 38-46 (negatív kontroll), EBNA1 400-413, MAP 106 121-132 és MBP 85-98 (pozitív kontroll) telítő koncentrációval, Az első oszlop egy reguláris ELISA (1: 2 CSF PBS-T-ben) peptidet mutat. ( B ) Ugyanezt a CSF-et előinkubáltuk MAP2694 38-46 (negatív kontroll), BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 és IRF5 424-434 (pozitív kontroll) módszerekkel. Az első oszlop egy reguláris ELISA (1: 2 CSF PBS-T-ben) peptidet mutat.
Teljes méretű kép
Peptid IgG specifikus antitest index (AI) SM-ben szenvedő betegeknél
Az összes SM-beteg antitestindexét (AI) a következő képlettel számítottuk: AI = QlgG [spec]/Qlim 7. Az MS csoportban a kiválasztott peptidekkel szembeni pozitív minták magas száma AI> 1, 5 volt, ami intratekális IgG-specifikus antitesttermelést mutatott az EBNA1 400–413, MAP 106, MBP 85–98 és BOLF1 305–320, MAP_4027 18– 32, IRF5 424-434 peptidek, a 4. táblázat szerint.
Asztal teljes méretben
vita
Az eredmények pontosságát korrelációs eredmények igazolták, az a tény, hogy hármas pozitivitást találtak a szérumban és a CSF-ben BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 és IRF5 424-434 ellen SM-ben szenvedő betegeknél, összehasonlítva az IND/NIND/Az UND alanyok megerősítették azt a hipotézisünket, miszerint a MAP és az EBV meggyulladhat az SM-ben az autoimmun folyamat, és a CSF-ben a különböző peptidek (EBNA1 400-413, MAP_106c 121-132 és MBP 85-98) pozitivitása összefüggésben lehet a relapszusos betegek SM-jével a betegekkel SM-rel relapszus nélkül.
Anyagok és metódusok
elemeket
peptidek
Az EBV antigénekből (BOLF1 305-320, EBNA1 400-413), MAP antigénekből (409-188, MAP_0106C 121-132) és humán homológokból (MBP 85-98, IRF5 424-434) származó szintetikus peptideket a 3. vizsgálatba bevontuk, 4; a peptideket kereskedelemben szintetizálták (LifeTein, South Plainfield, NJ 07080 USA), tisztaságuk meghaladja a 90% -ot, és fagyasztva, egyszer használatos alikvotokban [10 mM] -80 ° C-on tárolták.
ELISA
Versenyteszt
Két MS-t és egy IND CSF-et ELISA-nak vetünk alá MBP 85-98 vagy IRF5 424-434 bevonattal ellátott lemezeken. A kompetitív vizsgálatokat úgy végeztük, hogy a CSF-et egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on peptidek telített koncentrációjával [10 μM] (MBP 85-98; EBNA1 400-413; MAP 106) és (IRF5 424-434; BOLF1 305-320, Sero). - negatív peptidet (MAP 2694) használtunk negatív kontrollként [10 μM], és a CSF ELISA, MBP 85-98 vagy IRF5 424-434 [10 μM] volt pozitív kontroll.
IgG-specifikus antitest index (AI)
Az EBNA1 400-413, MAP 106, MBP 85-98 és a BOLF1 305-320, MAP_4027 18-32 és IRF5 424-434 IgG-re specifikus antitestek intratekális szintézisét 7, 19, 20 antitestindex (AI) segítségével határoztuk meg. Az adatokat normalizáltuk az összes kísérletben szereplő erős pozitív kontrollhoz képest, amelyek reaktivitását 10 000 önkényes egység (AU)/ml értékre állítottuk be. Az antitest index, beleértve a szérum albumin és a CSF koncentrációit, normális vér/CSF gátat mutatott (QIgG [összes]> Qlim) 7. A következő képletet használtuk: AI = QIgG [spec]/Qlim, mert QIgG esetén [spec] = IgGspec [CSF]/IgGs [szérum] és Qlim 21 = 0,93 * √ (Qalb) 2 + 6 2 x 10 −6 - 1, 7 2 * 10 −3 7, 21 .
Statisztikai analízis
A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 6.0 szoftver (San Diego, Kalifornia, USA) segítségével végeztük. Az egyszeri elemzésben a különböző kategóriák összehasonlításához használt P-értékeket Mann-Whitney U teszttel számoltuk. Különbségek p