elemeket

absztrakt

A klasszikus galaktozémia a galaktóz-anyagcsere örökletes recesszív rendellenessége, amelyet a galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz (GALT) enzim hiánya okoz, amelyet a GALT gén mutációi okoznak. Ebben a vizsgálatban 56 galaktozémiával diagnosztizált török ​​beteget vizsgáltak GALT génmutációkra Affymetrix szekvenciájú mikrosávok segítségével. Ezekben a betegekben tizenegy típusú mutációt azonosítottak, köztük két új mutációt (R258G és G310fsX49) és kilenc visszatérő mutációt. Ebben a tanulmányban hat beteget azonosítottunk, akik homozigóta voltak az E340 * mutáció és az N314D, L218L néma szubsztitúciók (Duarte-1 variáns) szempontjából. Az E340 *, N314D és L218L haplotípusokról csak török ​​betegeknél számoltak be, ami arra utal, hogy az E340 * mutáció a lakosságunkra jellemző, és a török ​​előd terjesztheti őket. A Duarte-1 allélt a betegeknél 10,71% -os gyakorisággal találták, míg a Duarte-2 allélt nem sikerült kimutatni. Megállapították, hogy a Duarte-1 és Duarte-2 allélok 2,3% és 1,4% gyakorisággal voltak jelen 105 egészséges egyén szűrésén. Az összes talált mutációra tekintettel nagyon fontos megállapítani, hogy a GALT gén 6. és 10. exonja a török ​​populáció összes mutáns alléljának 79% -át képviseli. A leggyakoribb mutáció a Q188R, amelynek gyakorisága 55, 35%.

populációban

A galaktozémia a galaktóz metabolizmusának autoszomális recesszív rendellenessége, amely a galaktokináz, a galaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz (GALT) és az UDP-galaktóz-4'-epimeráz enzimek elégtelen vagy hiányos aktivitásából ered, amelyek szerepet játszanak a galaktóz metabolizmusában Leloira-ban. Az uralkodó forma a klasszikus típusú galaktozémia, amelyet a GALT enzim súlyos csökkenése vagy hiánya okoz, és amelynek előfordulási gyakorisága 1/40 000-60 000 az európai újszülötteknél. Több mint 150 mutációról számoltak be a GALT génben. 3

A csökkent GALT enzimaktivitás a gal-1P felhalmozódásához vezet a különféle szervekben. A betegség általában az élet első napjaiban fordul elő az anyatej vagy a termék bevétele után. A betegség legkorábbi klinikai eredményei a hányás, hasmenés, a boldogulásra való képtelenség és a sárgaság. Bár ezek közül a tünetek közül sok megszűnik a korlátozott galaktóz-tartalmú étrend mellett, hosszú távú szövődmények, például mentális retardáció, beszéd- vagy tanulási rendellenességek és a korai petefészek-elégtelenség továbbra is fennállhatnak női betegeknél. 4

Az I. típusú galaktozémiát a maradék GALT aktivitás alapján súlyos klasszikus és enyhe Duarte fenotípusokba sorolják. A klasszikus galaktozémia gyakran társul az S135L, Q188R és K285N mutációkkal a GALT génben. A GALT gén funkcionálisan semleges N314D változása a Duarte galactosemiával társul, és világszerte elterjedt a populációk között. A Duarte-1 variáns normális vagy megnövekedett GALT enzimaktivitással rendelkezik, míg a Duarte-2 variáns alacsony GALT enzim aktivitással rendelkezik. A Duarte-1 allél az N314D mutációhoz kapcsolódik az L218L polimorfizmushoz kötődő egyensúlyhiányban. A Duarte-2 allél az N314D mutációval társul kötési egyensúlyhiányban három intronális polimorfizmussal, IVS4nt-27 g-> c, IVS5nt-24 g-> aa IVS5nt + 62 g-> a és a c-119 deléciójával -> - 116delGTCA az 5 'lefordítatlan területeken. 6, 7 A Duarte-1 típus nem okoz semmilyen klinikai vagy biokémiai rendellenességet, mert az L218L polimorfizmus növeli az N314D GALT fehérje transzlációs sebességét. 5 Az 5'-nem transzlált-119 -> - 116delGTCA régió törlése a GALT gén promoter régiójában (Duarte-2 variáns) a GALT gén transzkripciójának csökkenését okozza. 8.

Ebben a jelentésben beszámolunk a GALT génmutációkról Törökországból származó galaktozémia 56 olyan esetében, amelyeket DNS-mikroarray resekvencióval azonosítottak. Ezenkívül 105 egészséges egyént teszteltek a Duarte-1 és Duarte-2 allélvariánsok gyakoriságának meghatározására a török ​​populációban.

Anyagok és metódusok

betegek

A Hacettepe Egyetem, Gyermekgyógyászati ​​Tanszék, Metabolizmus osztályának ötvenhat galaktozémiában szenvedő török ​​beteget vettek be egy vizsgálatba, amelynek célja a GALT gén mutációinak kimutatása mikroarray szekvencia módszertan alkalmazásával. Az érintett felektől írásbeli, tájékozott beleegyezést kaptak. A klasszikus galaktozémiában szenvedő betegek olyan tipikus tünetekkel jártak, mint a kudarc, hányás, hepatosplenomegalia és májelégtelenség. A galaktozémia diagnózisát egy glükóz-oxidáz-reagensekkel nem reagáló redukálószer és a cukor papírkromatográfiás azonosításával gyanították.

DNS-izolálás és PCR

A perifériás vérből genomi DNS-t izoláltak ammónium-acetátos kicsapással. A GALT gént két töredékként amplifikáltuk nagy hatótávolságú PCR-rel, az 1F5'-CACGGCCCTGCAGATTTTCC-3 ', az 1R5'-fragmentum-1R5'-CTTCATCACCCCCTCCCTGC-3' (PCR termékhossz 1348 bp) és a 2F5'CTCTAG 'AG fragmens primereinek felhasználásával., fragmens-2R5'-AGTTGTAGCTGGAGCTATGC-3 '(PCR termékhossz 2878 bp). Az összes primert az Oligo Primer Analysis Software (Oligo 6.71 verzió, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, USA) felhasználásával terveztük. A PCR-reakciókat 32 cikluson keresztül hajtottuk végre, mindegyik ciklus 10 napos 94 ° C-os denaturálást, 30 ° s-os 60 ° C-os hőkezelést és legalább 5 percig 68 ° C-os kiterjesztést tartalmazott, végső meghosszabbítással 68 ° -on. 15 percig.

Mutációs szűrés

az eredmény

Ebben a tanulmányban 56 beteg GATT génjének mutációs elemzéséről számolunk be, amelyet a klasszikus galaktozémia és a Duarte-1 típus klinikai eredményei képviselnek. A nukleotid szubsztitúciókat a GALT génben detektáltuk szekvencia mikrosávokon, kivéve a nukleotid változások delécióját vagy inszercióját. Az inszerciós/deléciós mutációkat közvetlen DNS-szekvenálás segítségével detektáltuk. A mutációs szűrés 112 mutáns allélből 109-et azonosított a GALT génben. Ezekben a betegekben tizenegy típusú mutációt detektáltak, köztük kilenc visszatérő mutációt (c.425T> C; M142K, c.536G> A; G179D, c.563A> G; Q188R, c.692G> A; R231H, c.855G > T, K285N, c.881T> A, F294Y, c.958G> A, A320T, c. A); R258G és c.928delG; G310fsX49). Az új G310fsX49 mutációt közvetlen DNS-szekvenálással detektáltuk, szemben más mutációkkal.

Negyvenkilenc beteg volt homozigóta, négy betegnél pedig heterozigóta mutáció volt. Három betegnél csak egy mutáns allélt azonosítottak. A mutáció kimutatási aránya 97,3% volt. A Q188R volt a leggyakoribb mutáció ebben a vizsgálatban, 55,35% -os gyakorisággal. A Q188R-t 29 betegnél és négy betegnél egy allélban mutattuk ki. Az A320T (7, 14%), az E340 * (10, 71%) és az M142K (6,25%) a második leggyakoribb mutáció. Az E340 * -t hat homozigóta betegnél detektálták az N314D és L218L variánsokkal együtt (Duarte-1 allél). Duarte-1 allélt találtak 10,71% gyakorisággal. A Duarte-2 allélt ebben a vizsgálatban nem sikerült kimutatni.

A Duarte-1 és Duarte-2 allélok 2,3% -os és 1,4% -os gyakorisággal voltak jelen a török ​​lakosság 105 egészséges egyedének szűrésén. Az összes azonosított mutációt és azok allélfrekvenciáját az 1. táblázat foglalja össze.

Asztal teljes méretben

vita

Ezt a vizsgálatot a GALT gén kórokozó mutációinak spektrumának genetikai szűrésével és jellemzésével végeztük 56 galaktozémia esetén (50 klasszikus és 6 Duarte-1 típusú). Ezenkívül meghatározták a török ​​populációban a Duarte-1 és Duarte-2 allélok gyakoriságát. Különböző populációkban végzett felmérések kimutatták, hogy a klasszikus galactosemia előfordulása 1: 30 000 és 60 000 között van. 2, 3, 11 A klasszikus galactosemia azonban Törökországban gyakoribb volt, 1:23 775 előfordulással.

A GALT génben világszerte több mint 250 mutációt írtak le különböző etnikai populációkban. 11 különböző genetikai mutációt találtunk, amelyek közül kettő új volt, köztük az R258G és a G310fsX49. A mutációk enzimaktivitásra és fehérje szerkezetére gyakorolt ​​hatásának részletes elemzése a korábbi publikációkban található. 13., 14. Itt csak az új mutációk fehérje szintre gyakorolt ​​lehetséges hatásait tárgyaltuk, amelyeket ebben a genetikai szűrővizsgálatban ismertettek. Az egyik egy új R258G mutáció, amelyet a Q188R vegyület heterozigóta vegyületében találtunk. Lehetséges, hogy a fehérje felületén található R258-csoport részt vesz egy sóhíd kialakulásában, ezáltal megváltoztatva a molekula felületi tulajdonságait. Az R258G mutációban található glicin maradék oldallánca szintén nagyon kicsi. A mutáció befolyásolhatja a dimer összeépülését és a monomer stabilitását vagy stabilitását. A G310fsX49 keretrendszer-eltolódási mutáció egy stopkodonhoz vezet a 49-es aminosav pozícióban a törölt nukleotid mögött.

A GALT gén leggyakoribb Q188R mutációját a török ​​populáció 55,35% -ában találták ebben a vizsgálatban. E tanulmány Q188R gyakorisági eredményeink kompatibilisek a török ​​galaktozémiában szenvedő betegek korábban publikált tanulmányaival, amelyek 57 és 47% -os gyakoriságot jelentettek. 15, 16

A Q188R mutáció a leggyakoribb allél minden európai országban, és gyakorisága jelentősen eltér a populációtól. A mutációk gyakoriságáról (45 és 93,6% között) a következő országokban számoltak be a következő esetekben: Írország, 93,6%; 17 Egyesült Királyság, 77%; 3 Portugália, 57,8%; 18 Hollandia, 58,5%; 19 Spanyolország, 50%; 18 Németország, 69%; 20 Ausztria, 60%; 21 Lengyelország, 51,3%; 22 Cseh Köztársaság és Szlovák Köztársaság, 46%; 7 és Magyarország, 45%. Mint ezekben az európai országokban, úgy találták, hogy ez a török ​​populációban a leggyakoribb betegséget okozó mutáció, és a bemutatott adatok megerősítik azt a megfigyelt mintát, hogy a Q188R mutáció gyakorisága nyugatról keletre és északra csökken. délen az európai kontinensen. 24.

A török ​​lakosságnak ebben a tanulmányában a K285N-t a lakosság mindössze 3,57% -ában rögzítik. A K285N mutáció a második leggyakoribb mutáció a legtöbb európai országban. Ennek a mutáns allélnak a gyakorisága 19 és 33,8% között mozog különböző európai populációkban. 7, 20, 21, 22, 23 A fenti megfigyelt és említett fent említett frekvenciákkal ellentétben egyes populációkban alacsony az allél gyakorisága ennek a mutációnak, eloszlása ​​2, 4 és 9, 8% között van az európai országokban. 18, 19, 25

Ez a három mutáns allél, az A320T (7, 14%), az E340 * (10, 71%) és az M142K (6,25%) a második a gyakoriságban a török ​​betegeknél, és gyakrabban figyelhető meg, mint más populációkban. Az A320T-t és az M142K-t ritka változatokként írták le más vizsgálatokban. 26.

A GALT-ban eddig kimutatott mutációk spektruma a következő: M142K, G179D, Q188R, L218L, R231H, R258G, K285N, F294Y, N314D, G310fsX49, A320T, R328H és E340 *; mindegyik a török ​​populációban a GALT génhibák miatt kialakuló galaktozémiát okozó betegségeket okozó allélok túlnyomó részét képviseli. A GALT-ban a betegséget okozó variációk többségét meghatározták, és ennek a vizsgálatnak az eredményei kompatibilisek a korábbi eredményekkel. 15, 16

A GALT gén összes mutációját a gén 5., 6., 8., 9. és 10. exonjában gyűjtjük össze. Az összes kimutatott mutációt tekintve a 6. és 10. exon az összes mutáns allél 79% -át képviseli populációnkban. Fontos megfigyelés az ezekben az exonokban található mutációk magasabb gyakorisága a török ​​galaktozémiában szenvedő betegeknél. Ezek a megállapítások hasznosak lennének molekuláris diagnosztikai vizsgálatokban az allélok osztályozásához a mutációs szűrés prioritása szempontjából a galaktozémiát okozó patogén mutációk között, amelyek száma jelenleg meghaladja a 250-et.

Érdekes módon, amint azt már az irodalomban is megállapítottuk, megfigyeltük, hogy nyolc, az E340 * mutációt hordozó beteg török ​​eredetű volt, és ezt a mutációt N314D és L218L ciszban hordozták. Gathof és mtsai. 27 először egy török ​​fiúról számolt be E340 *, N314D és L218L betegséggel. Schuster és mtsai. 28 beszámolt két török ​​testvérről, valamint Seyrantepe et al. 15 Törökországból megemlített egy másik genotípusú török ​​beteget; vizsgálatunkban hat beteget azonosítottunk, akiknél az E340 * mutáció volt a cis-ben N314D és L218L.

Az E340 *, N314D és L218L haplotípus valószínűleg a törökök őseiből származik. Összegzésként meg kell határoznunk a mutáció eredetét; azonban nem lehet bizonyítékokon alapuló megközelítést bemutatni a haplotípus megalapozó hatásáról a török ​​populációban, mivel jelenleg korlátozott számú betegtől állnak rendelkezésre adatok.

Ebben a tanulmányban a Duarte-változatok jelenlétét is értékeltük a török ​​populációban. Összesen 105 egészséges (n: 210 allél) egyént vizsgáltunk meg a GALT gén Duarte-variánsainak jelenlétére, és összesen 8 allélt (3,8%) detektáltunk az N314D-re: öt (2,3%) Duarte-1-t azonosítottunk Változat és három (1,4%) Duarte-2 változatként. A Duarte allél gyakorisága Európában szignifikáns különbséget mutatott régiótól függően. A frekvenciaeloszlás a következő: Észak-Európa, 7,9%; Kelet-Európa, 5, 3%; Nyugat-Európa, 6, 1%; és Dél-Európa, 2, 0%. Az afroamerikai és ázsiai populációkban a Duarte allél gyakoribb, 1,3, illetve 1,5%. A Duarte allél gyakorisága népességünkben alacsonyabb, mint a várt gyakoriság (% 3, 8) Kelet-Európához képest. Ha az E340 * mutáció közös ősből származik, akkor lehetséges, hogy ez az ős a Duarte-1 allélt is hordozza, és ezért a Duarte allélek nagy része együtt van az E340 * -vel. Ennek az allélnak a gyakorisága azonban egészséges egyéneknél alacsonyabb, mert nem hordozza az E340 * betegségét okozó haplotípusát *. Egy másik lehetséges magyarázat a Duarte allélek közötti sokféleségre és eloszlási különbségekre, különösen a GALT génben előforduló közös mutációk között, Törökország földrajzi elhelyezkedése lehet, amely keresztezi a két kontinenst, Ázsiát és Európát.

Magas, 97,3% -os mutáció-kimutatási arányt értünk el egy szekvencia-szekvenáló mikroarray alkalmazásával ebben a mutációs szűrővizsgálatban. Ez a módszer gyors és költséghatékony megközelítést biztosít az örökletes betegségek mutációinak szűrésére. A rendelkezésre álló klasszikus genetikai szűrési módszerekkel összehasonlítva a mikroarray-korlátozás alkalmasnak tekinthető a sebesség, a reprodukálhatóság és az alkalmazhatóság szempontjából több ezer nukleotid elemzésére egyetlen mező platformon. Ez a tanulmány az első jelentés a klasszikus galaktozémiában szenvedő betegek genetikai szűrésében történő felhasználásáról.