elemeket

absztrakt

A tehéntejjel történő enterális táplálkozás az újszülöttek nekrotizáló enterocolitissal (NEC) és a szepszissel társul. Az étrendi antigén szenzibilizálás szerepet játszhat a gyulladás elősegítésében és/vagy fenntartásában mindkét állapotban. A tehéntejfehérje (CMP) -specifikus citokinválaszok vizsgálatához koraszülött csecsemőknél, NEC-szel és szepszissel, 14 csecsemővel, NEC-vel, 14 konszenzusos egészséges kontrollral és 10 szeptikus kontrollal. Az IFN-y, IL-4, IL-10 és TGF-β1-t szekretáló stimulálatlan és stimulált perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) egyetlen sejt enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISPOT) számoltuk meg. A NEC akut fázisában a betegek a citokin szekréció magas szintjének általános mintázatát mutatták, amikor mitogének [fitohemagglutinin (PHA)] és CMP: béta-laktoglobulin (β-Ig) és kazein nem stimulálták őket. Ezek a válaszok kifejezettebbek voltak a p-Ig-n IFN-γ, IL-4 és IL-10 esetében, mint a TGF-β1. A szepszisben a citokin válaszok alacsonyabbak voltak, mint a NEC-ben (legalacsonyabb az egészséges kontrollokban, minimális TGF-β1 válasz mellett). Idővel alacsonyabb frekvenciájú citokint szekretáló sejtek indukálódtak, mint az akut fázisban, kivéve a TGF-β1-szekretáló sejteket, amelyek idővel (PHA és CMP válaszként) főleg NEC után, de szepszis után is növekedtek.

specifikusak

A fő

Az újszülöttek nekrotizáló enterocolitis (NEC) és a szepszis a NICU leggyakoribb szövődményei közé tartozik (1). Mindkét esetben a betegség előfordulása fordítottan arányos a születési tömeggel és a GA-val (2). A NEC a bélbetegségek heterogén csoportja, amely számos klinikai megjelenést és változó fokú bélgyulladást tartalmaz (3). A NEC patogenezise multifaktoriálisnak tekinthető, de nem teljesen ismert. Számos hajlamosító tényezőt azonosítottak, ideértve a korai fogyasztást, a tej etetését, a bél hipoxiáját/iszkémiáját és a baktériumok transzlokációját. A NEC általában koraszülötteknél fordul elő (4), akik szintén különösen hajlamosak a szepszisre (5).

A NEC legtöbb esete enterálisan táplált gyermekeknél fordul elő. Az enterális takarmány jellege fontos patogén tényezőnek tűnik. Az epidemiológiai vizsgálatok szerint a tehéntejjel táplált csecsemőknél megnő a NEC kockázata, összehasonlítva az anyatejjel (anya vagy donor) kezeltekkel (6). A NEC és a tej alapú tej közötti potenciális kapcsolatot eddig nagyrészt az anyatejben lévő immunvédő elemek azonosításával és a tejtípus (recept vagy mell) hatásának meghatározásával vizsgálták a bél mikrobiózisának kialakulására (7). A béta-laktoglobulin (β-Ig), amelyről nem tudni, hogy normálisan létezik-e az emberi anyatejben, a tehéntej-fehérjék (CMP) fehérje-összetételének 8,5% -át teszi ki, míg a kazeinek a CMP 80% -át (8).

Bár a koraszülöttek immunrendszerét viszonylag "éretlennek" tekintik a felnőtt csecsemők immunrendszeréhez képest, a koraszülöttek megfelelően reagálhatnak az antigén ingerekre. Kevéssé ismert azonban ezeknek a gyermekeknek az étrendi antigénekre adott immunológiai reakciói (9), vagy "egészséges" állapotban, vagy ami még ennél is fontosabb, olyan betegségekben, amelyek tartalmazhatnak nyálkahártya-gátat, például NEC és szepszis.

Korábban kimutattuk a CMP szenzibilizációját NEC-ben szenvedő gyermekeknél, ahol a perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) kazeinnel és β-Ig-vel történő stimulálása mindkét T segítő sejttípus (Th) effektorválaszt váltott ki: Th1 (IFN-γ) ) és Th2 (IL). -4 és 5) (10).

Ebben a tanulmányban az érzékeny enzim immunospot módszert (ELISPOT) alkalmaztuk, amely lehetővé teszi a citokin szekréció detektálását egyetlen sejt szintjén, és ezt a jelenséget tovább vizsgáltuk. NEC-vel rendelkező gyermekeket, egészséges kontrollokat és szepszisben szenvedő csecsemőket értékeltünk. Az IFN-γ és IL-4 szekréciójának újbóli vizsgálata mellett jellemeztük az IL-10 (Th típusú 1 szabályozó sejtek által szekretált) és a TGF-β1 (Th3 által szekretált) szabályozó citokineket is PBMC-k által. Ezenkívül megismételtük az összes értékelést abban az időben, amikor az újszülöttek felépültek a NEC-ből és a szepszisből, az egészséges kontrollokhoz képest, hogy mérjük a citokin-válaszok időbeli változását.

TÁRGYAK ÉS MÓDSZEREK

Tárgyak.

Harmincnyolc koraszülött csecsemő került be a Chelsea & Westminster Kórház NICU-ba 2006 februárja és 2007 augusztusa között három vizsgálati csoportba: 14 koraszülött NEC-vel [módosított Bell (11) II. Fokozat: nyolc eset és III. Fokozat: hat eset] akiket a diagnózis után 24 órán belül azonosítottak és kaptak; 14 egészséges kontroll beteg, akiknek anamnézisében nem volt NEC vagy szepszis, és akiket egyedileg igazítottak a párhuzamos szelekcióra a posztkoncepciós életkor (PCA) és a posztnatális életkor (PNA) alapján, szemben a NEC-ben szenvedő betegekkel; és 10 újszülött, későn megjelenő (> 1 éves kor) pozitív szepszis vérkultúrával (szeptikus kontrollok), amelyek egyenként nem, PCA és PNA-nak felelnek meg NEC-vel és egészséges kontrollokkal rendelkező betegeknél.

PBMC izolálás.

Körülbelül 0,5 ml heparinizált vért gyűjtöttek a csecsemőktől három csoportban a diagnózis felállításakor, majd a vizsgálat során. A PBMC-ket sűrűség-gradiens centrifugálással izoláltuk, standard eljárásokkal. A sejteket teljes tápközegben (R10) mostuk, amely RPMI 1640 7-t (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Gillingham, Egyesült Királyság), 50 E/ml penicillint, 50 ug/ml sztreptomicint, 10 ug/ml gentamicint, 2 mm glutamint, nátriumot tartalmazott. piruvát, 10 mmol 4- (2-hidroxi-etil) -1-piperazin-etánszulfonsav-puffer (HEPES) és 10% hő-inaktivált FCS. A PBMC koncentrációt Z1 részecskeszámlálóval (Beckman Coulter, High Wycombe, Egyesült Királyság) határoztuk meg. Az életképes sejtek százalékos arányát tripánkék szekrécióval határoztuk meg.

Fedjük le a lemezt befogó antitestekkel.

Egy nitrocellulóz alsó mikrotiter lemezt (MAIPS 4510; Millipore, Watford, Egyesült Királyság) előnedvesítettünk 20 μl/lyuk 70% -os etil-alkohollal 5 percig szobahőmérsékleten. Az alkoholt dekantáltuk, és a lyukakat háromszor 200 μl PBS-sel mostuk, és 100 μl PBS-ben citokinspecifikus monoklonális befogó antitesttel vontuk be (IFN-γ, IL-4 és IL-10 esetében 1 μg/üreg és 0,3 μg/üreg). ). TGF-β1 esetén). A lemezt legalább egy éjszakán át és 1 hétig inkubáltuk 4 ° C-on, zárt tasakban. Közvetlenül a felhasználás előtt az adszorbeálatlan antitestet dekantáltuk, és a lyukakat háromszor PBS-sel mostuk, és 200 μl/R10 üreggel blokkoltuk 2 órán át 37 ° C-on, 5% CO 2-os nedvesített atmoszférában.

PBMC-k inkubálása.

A blokkoló táptalajt dekantáltuk, és PBMC-ket adtunk lyukanként 0,5x105 sejtenként három példányban minden ingerre. A sejteket 20-24 órán át inkubáltuk 5% CO 2 atmoszférában, 37 ° C-on, megfelelő antigének vagy mitogének hiányában vagy jelenlétében: kulcslyuk-limpet hemocianin (KLH; 500 μg/ml), β-Ig (500 μg)/ml), kazein (500 μg/ml) és fitohemagglutinin (PHA; 10 μg/ml; Sigma Chemical Co.-Aldrich).

A citokint szekretáló sejtek kimutatása.

A lyukakat hatszor mostuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (200 μl/üreg; Sigma Chemical Co.). 0,4 μm szűrt biotinilezett citokin-specifikus monoklonális antitestet (MAb) adtunk hozzá 100 μl térfogat/üregben (0,1 μg/üreg, PBS-ben hígítva/0,5% BSA) és 4 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten.

A MAb elfogását és detektálását IFN-γ-n és IL-4-en a MAbtech AB-től (Nacka Strand, Svédország) szereztük be, míg a BD Biosciences (San Diego, Kalifornia) IL-10 elleni antitestjeit és a TGF-β1-en lévő antitesteket (Ab: rekombináns humán TGF-βRII/Fc kimérát és biotinilezett anti-TGF-β1 antitestet) kaptunk R&D rendszerekből (Egyesült Királyság). Az inkubációs periódus végén a lyukakat hatszor mossuk PBS/0,05% Tween 20 és 100 μl avidin-biotin-peroxidáz komplex (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA) gyártók utasításai szerint elkészítve. 1-2 óra szobahőmérsékleten. A lyukakat háromszor mossuk 200 µl PBS/Tween 20-mal, majd háromszor 200 µl PBS-sel, végül 100 µl aminoetil-karbazol szubsztrátot (AEC) (Sigma Chemical Co.-Aldrich) adunk minden egyes üregbe. A folt szobahőmérsékleten 4 percig fejlődött, mielőtt csapvízzel mosott és egy éjszakán át száradt. A foltokat ELISPOT lemezolvasóval (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, Egyesült Királyság) számláltuk. A végeredményeket festett sejtekként (SFC) fejeztük ki 105 PBMC-ben.

Statisztika.

A három csoport adatait az eloszlás normalitására teszteltük, és nem paraméteresnek találtuk. Különböző elemzési készletek négy citokin-válasz különbséget vizsgáltak mindegyik csoportban mind akut, mind időtartam alatt. Az eredményeket medián és interkvartilis tartományban (IQR) fejezzük ki az egyes csoportokra, vagy számként és százalékban. A NEC és az egészséges kontroll csecsemők összehasonlítását párosított adatokként (Wilcoxon páros teszt) elemeztük, a termikus és az akut minták összehasonlítása céljából. A szeptikus gyermekekkel végzett összehasonlítások nem egyeztek meg (Mann-Whitney-teszt). A lényegességi szintet 1% -ban határozták meg; csak p szepszis; p szepszis; p szepszis; 4-10 alkalommal; p ötszörös növekedés; ÁBRA. 1).

A PBMC-szekretáló citokinek gyakorisága megnövekedett NEC-vel, szeptikus kontrollokkal és egészséges kontrollokkal (AELISPOT) szenvedő betegeknél p-Ig stimuláció után bemutatáskor (akut) és távon (kifejezés). Az IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) és a TGF-β1 (D) szekretáló sejtek frekvenciáját AFCS-ben fejezzük ki 105 MNC-on (ASFC 105 PBMC-nél), ami a az antigénnel kezelt és a stimulálatlan üregekben lévő foltok átlagos száma az egyes mintavételi szakaszokban. Minden sor egy témát képvisel. * p szepszis, 3-5-szeres; p ötszörös növekedés; ÁBRA. 2). A KLH-val való stimuláció elhanyagolható reakciókat váltott ki az összes mintában (NEC, szepszis és egészséges kontrollok bemutatáskor és a vizsgált négy citokin szempontjából).

A PBMC-szekretáló citokinek gyakorisága megnövekedett NEC-ben, szeptikus kontrollokban és egészséges kontrollokban (AELISPOT) szenvedő betegeknél a kazein stimulálása után, bemutatáskor (akut) és távon (kifejezés). Az IFN-γ (A), IL-4 (B), IL-10 (C) és a TGF-β1 (D) szekretáló sejtek frekvenciáját AFCS-ben fejezzük ki 105 MNC-on (ASFC 105 PBMC-nél), ami a az antigénnel kezelt és a nem stimulált üregekben lévő foltok átlagos száma az egyes mintavételi szakaszokban. Minden sor egy témát képvisel. * p β-lg