azonosítása

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • ZooMS-szűrés hominin-maradékok után
  • Mikro-CT-vizsgálat DC1227
  • Radiokarbon elemzés DC1227
  • Mitokondriális DNS (mtDNS) szekvenciák a DC1227 mintából
  • következtetések
  • mód
  • ráközelíteni
  • CT vizsgálat
  • Mitokondriális DNS elemzés
  • DNS kivonás és könyvtár előkészítés
  • Mitokondriális befogás és szekvenálás
  • A szekvencia feldolgozása és feltérképezése
  • Filogenetikai elemzés
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Excel fájlok
  • Kiegészítő információk 1
  • Hozzászólások

elemeket

  • régészet
  • Tömegspektrometria

absztrakt

A DNS-szekvenálás forradalmasította az archaikus emberek megértését a közép- és felső paleolitikum alatt. Sajnos, bár sok paleolit ​​hely nagyszámú csontot tartalmaz, a legtöbb nem rendelkezik a hagyományos morfológiai azonosításhoz szükséges diagnosztikai elemekkel. Ennek eredményeként az emberi pleisztocén maradványok regenerálása nagyon ritka. Ennek a problémának a kiküszöbölésére olyan módszert alkalmaztunk, amellyel több mint 2000 töredezett csonton eltávolítottuk a kollagént az oroszországi Denis-barlang területéről, hogy megkönnyítsük az emberi maradványok felfedezését. Elemzésünk eredménye egyetlen hominin csont (Denisova 11) azonosítása volt, amelyet mély peptidanalízis támaszt alá, és kiderült, hogy nem indertertalis mitokondriális DNS-t tartalmaz. Az ezt követő széndokumentáció azt mutatta, hogy a csont több mint 50 000 éves volt. Itt hatalmas potenciális kollagén ujjlenyomatot mutatunk be a hominin maradványok azonosítására az erősen széttöredezett régészeti egységekben, javítva ezzel a szélesebb emberi fejlődési vizsgálatokhoz rendelkezésre álló erőforrásokat.

A Denis-barlang hominin-kövületei ezért nagyon értékesnek bizonyultak az archaikus hominin-populációk megértésében. Ezt kiemeli az ősi DNS-molekulák kivételes megőrzési állapota a helyszínen megszerzett egyes csontokban. Például a Denisovan fhalanx (Denisova 3)> 70% -ban tartalmazott endogén DNS-t, amely nagy lefedettségű (30x) genomot biztosított 7. A Denis-barlangban végzett intenzív feltárás ellenére azonban csak néhány homininmaradványt találtak a több ezer feltárt csont között. Akár fogakat, akár kis méreteket azonosítanak, általában falanxokat, amelyeknél kevésbé valószínű a széttöredezés, ami diagnosztikai jellemzők elvesztéséhez vezet. Az ilyen széttöredezettség, amelyet a környezeti tafonomia és a húsevő vagy emberi tevékenység okoz, ebből és sok más régészeti lelőhelyből származó csontok helyreállításának magas százalékához vezet, amelyek morfológiájuk alapján nem azonosíthatók 3, 8. Csak a Denis-barlang keleti galériájában a 2005 és 2013 közötti ásatások körülbelül 135 600 csontot eredményeztek; 128 591-et azonban nem sikerült azonosítani 8 .

Itt alkalmazzuk a faj-azonosítási módszert egy kollagén peptid tömegpásztázásával, amelyet Zooarchaeology néven tömegspektrometriával (ZooMS) ismerünk, 2315 archivált, azonosíthatatlan csonttöredékre a Denis-barlangból. Ezeket a nem diagnosztikai csontokat a barlang keleti galériájából 2014-ben kinyert anyagból választották ki. A maradványok mérete változó volt, általában 3–5 cm között, a csontok pedig elég nagyok ahhoz, hogy hasznosak legyenek a további elemzésekhez (pl. Szén és DNS-elemzés) előnyösen kiválasztott. A közelmúltban a ZooMS elemzése sikeresen megkülönböztette az emlősök különböző csoportjait, ideértve a háziasított 9, 10, a vad szárazföldi taxonokat 11, 12 és a tengeri fauna 13, valamint néhány nem emlős taxont 13, 14 között. ezt a ZooMS elemzi a csontban lévő domináns fehérje, egy peptid ujjlenyomat, 1-es típusú kollagén (COL1) elemzésére, amely hosszú élettartamáról ismert, különösen hidegebb éghajlaton. Ez a módszer kollagén ujjlenyomatokat eredményezett a mintákban, legfeljebb

az eredmény

ZooMS szűrés hominin maradványok után

Az eddig megjelent emberi markerek jelölése A-G. Az összes számozott csúcs az emberi kollagénben megfigyelt megerősített szekvenciaillesztési peptideket reprezentálja (kivéve az E-t, amely csak más fajok homológ markereivel való hasonlóságáról ismert 9).

Teljes méretű kép

A mintát, amelyet DC1227 homininnek azonosítottak, a Keleti Galéria 12. rétegének A-2 négyzetéből tártuk fel. A mintavétel előtt a csont súlya 1,68 g, maximális hossza 24,7 mm, szélessége 8,39 mm. Körülbelül 36 mg-ot gyűjtöttünk a ZooMS-elemzéshez (2. ábra). A csont meglehetősen elhanyagolhatónak tűnik, morfológiai jellemzők és a cél módosulásának bizonyítékai nélkül, ezért az oszteológiai elemzés során könnyen figyelmen kívül hagyta.

Teljes méretű kép

Mikro-CT-vizsgálat DC1227

A mikroszámítógépes tomográfiát (mikro-CT) a roncsolásos mintavétel előtt végezzük a szén- és mitokondriális DNS-elemzéshez. E megállapítás ritkasága miatt a mikro-CT-t alkalmasnak ítélték a látható lebomlás által érintett területek azonosítására, ezért a jövőbeni elemzések során kerülni kell. Az eredmények azt mutatták, hogy a minta nagyon sűrű volt, és hosszában át nem haladó diagenetikus mikrorepedés-sorozat volt, csontromlás jelei nélkül. Ezek közül a mikrometrikus repedések közül három a csonton keresztül egymás közvetlen közelében fut, de nem képez repedést, és úgy tűnik, hogy nem zavarja a csont szerkezetét. A felvétel rávilágított a marás és a csontfelszínen való bedagadás mértékére is, ami a húsevők emésztőrendszerén való áthaladásnak tudható be (3. ábra). Számos ragadozót jelölnek ki a helyszínen; a hiénák előfordulása miatt a Denisova-barlangban valószínűnek tűnik, hogy a csont savval maródott a 8., 20. hiéna gyomorsavain keresztül. .

Teljes méretű kép

Radiokarbon elemzés DC1227

A radiokarbon dátumot az Oxford Radiocarbon Acceleration Unit-ban (ORAU) végezték el szokásos eljárások és protokollok szerint 23, becsült életkoruk meghaladja a 49 900 év BP-t (OxA-32241), jelezve, hogy a csont idősebb, mint a radiokarbon-datálás maximálisan mérhető határértéke. . csont kollagén. Az eredmény teljesen összhangban áll a feltételezett geoarcheológiai korral a helyben lévő rétegtani sorrend tekintetében.

A szén és a nitrogén izotópmérése 813C-17,3 ‰, az A515N 16,4 ‰ értéket eredményezett. A homininek ebben a régióban általában 13-15 ‰ közötti nitrogén izotóp értéket adnak vissza, például az Okladnikov 24. barlang neandervölgyiek között. A megnövekedett DC1227-szint különféle táplálkozási rendellenességeket jelezhet, ideértve a magasabb trofikus szintű organizmusokból származó fehérjében gazdag étrendet, például az édesvízi halakat 25, 26. A megnövekedett izotópértékek megfelelő kontextusba helyezéséhez további kutatásokra van szükség, amelyeket a jövőben tárgyalunk. A denisovai hominin és rokon fauna izotópos összetételének ilyen vizsgálata fontos információkat tár fel az Altájban élő paleolit ​​homininek étrendjéről, és ilyen kutatásokat jelenleg az Oxfordi Egyetemen folytatnak.

Mitokondriális DNS (mtDNS) szekvenciák a DC1227 mintából

30,9 mg csontporból kivontuk a DNS-t a DC1227 27-ből. A kivonat egy alikvot részét egyszálú DNS-könyvtárba (28) vittük át, amelyet humán mitokondriális próbákkal 29 dúsítottunk hominin mitokondriális DNS-fragmensekre. Az izolált DNS-fragmenseket szekvenáltuk és feltérképeztük a felülvizsgált Cambridge-i humán mitokondriális referenciaszekvenciára (rCRS). Összesen 282 502 egyedi mtDNS-fragmenst azonosítottunk, amelyek hosszabbak, mint 35 bázispár (S1 kiegészítő táblázat).

Annak értékelésére, hogy az mtDNS-fragmensek egy része ősi eredetű-e, azt a tényt használtuk, hogy a DNS-molekulák végén lévő citozin (C) bázisok hajlamosak az idő múlásával dezaminálódni, ezért a DNS-polimeráz timineknek (T) számít. Így a referenciaszekvenciához igazított ősi DNS-fragmensek hajlamosak a látszólagos C-T szubsztitúciók magas frekvenciáit hordozni az 5'- és 3'-végükön 31, 32, 33. Azoknál a töredékeknél, amelyek az rCRS-bázis C-helyzetében kezdődnek vagy végződnek, 32, 2% és 31, 3% -uk 5 és 3 'végén Ts-t hordoz (S13. Kiegészítő ábra), jelezve, hogy az ősi hominin DNS-molekulák DC1227.

Annak eldöntésére, hogy az endogén DC1227 mtDNS a legközvetlenebb-e a modern emberi, neandervölgyi vagy denisovan mitokondriális genomokkal, az elemzést C-T szubsztitúcióval rendelkező szekvenciákra korlátoztuk, szemben az egyik végén lévő rCRS-sel 34, hogy csökkentsük a feltételezett adatok hatását. szennyeződés a jelenlegi emberi DNS-sel (további információk). 36 665 ilyen szekvencia (S1 kiegészítő táblázat) felhasználásával rekonstruáltuk a DC1227 minta mitokondriális genomját, átlagosan 130-szoros lefedettséggel, 63 pozíciót kettő vagy kevesebb szekvencia fedett le, és négy, ahol a szekvenciák kevesebb mint kétharmada tartalmazta ugyanazt. bázis. Így 67 pozíciót nem lehetett pontosan megnevezni.

Összehasonlítva a DC1227 mtDNS-t az eddig meghatározott teljes neandervölgyi mtDNS-sel, öt alapvető különbség adódik az Okladnikov 2 33 neandervölgyi mtDNS-től, amely körülbelül 60 km-re található Denis-barlangtól, 12-17 eltérés van a nyugat- és dél-európai neandervölgyiektől, és 31 különbség van. a Kaukázustól 35 és a neandervölgyiektől a Denis 5. barlangban. Összehasonlításképpen: a DC1227-ből származó mtDNS 174 és 354 bázis között különbözik más hominincsoportok mtDNS-étől (S2. Kiegészítő táblázat). Így a filogenetikai elemzés során (4. ábra) a DC1227 mitokondriális genom tíz neandervölgyi változatba esik, kivéve 311 kortárs embert, tíz ősi modern embert, két denisánt és Spanyolországból származó középső pleisztocén hominint. Arra a következtetésre jutunk, hogy az egyedi DC1227 neandervölgyi típusú mitokondriális genomot hordoz, és most Denisova 11-nek nevezik.

Csimpánz mtDNS-t (nem látható) használtunk outgroupként. Az egyes ágak támogatása 500 bootstrap replikáción alapul. Az ősi példányok földrajzi eredetét az S2. Táblázat tartalmazza.

Teljes méretű kép

következtetések

mód

ráközelíteni

A csoport minden csontjából 20-50 mg csontot vettünk, és 18 órán át 0,6 M sósavban (HCl) demineralizáltuk. A képződött maradékot 30 kDa molekulatömegű cut-off (MWCO) ultraszűrőbe távolítottuk, és 1 órán át 3700 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A szűrletet ezután kétszer mossuk 500 μl 50 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal (AmBic), majd tovább centrifugáljuk 3700 fordulat/perc sebességgel. Minden kezelés után fél órán át. A végső maradékot további AmBic-lel (200 μL) szuszpendáltuk, amelynek felét eltávolítottuk, és emésztés előtt tartalék mintát képezünk. A fennmaradó 100 μl-t ezután 0,2 μg tripszinnel kezeltük (szekvenálási lépés; Promega UK), és 18 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A kapott oldatot ezután 1 μl α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav-oldat (10 mg/ml 50% acetonitrilben (ACN)/0,1% trifluor-ecetsavban (TFA)) mátrixoldatával összekeverjük és hagyjuk kokristályosodni. és egy Bruker Ultraflex II tömegspektrométerrel (Bruker Daltonics, Bremen) MALDI Tof/Tof elemeztük. Az így kapott tömegspektrumokat a 9, 12 humán markerekre szűrjük a FlexAnalysis szoftver segítségével.

CT vizsgálat

A CT-vizsgálatot egy Nikon XT H 225 mikro-szkennerrel végeztük, átviteli céllal. Megpróbálták a lehető legkisebb dózist tartani a minta károsodásának elkerülése érdekében, így a letapogatást 70 kv és 80 μA feszültségen hajtották végre. Összesen 1448 projektet hajtottak végre vetítésenként két képen, az expozíciót 100 ms-ra, a nagyítást pedig × 7, 2-re állítva. Az adatokat CT Pro 3D szoftverrel rekonstruáltuk és a VG Studio Max 2.1 szoftverrel dolgoztuk fel.

Mitokondriális DNS elemzés

DNS kivonás és könyvtár előkészítés

30,9 mg csontport távolítottunk el a DC1227-ből fogászati ​​fúróval. A DNS-t szilícium-dioxid-alapú eljárással extraháltuk, hogy rövid, 27, 36 DNS-molekulákat kapjunk. 10 μl DNS-kivonatot (E3128) egyszálú DNS-könyvtárrá (A9301) alakítottunk át, amint azt a 28, 36. A könyvtárban lévő DNS-molekulák számát digitális csepp PCR-rel (BioRad QX 200) értékeltük, 1 μl-t használva bemenetként az EvaGreen-elemzéshez (BioRad) IS7 és IS837 primerekkel. A könyvtárat két egyedi 36, 38 index kódolta, és AccuPrime Pfx DNS polimerázzal (Life Technologies) 39 amplifikáltuk. Az amplifikációs termékeket a MinElute PCR tisztító készlet (Qiagen) segítségével tisztítottuk; és NanoDrop ND-1000 fotópektométerrel (NanoDrop Technologies) számszerűsítve.

Mitokondriális befogás és szekvenálás

Az amplifikált könyvtárat (A9317) egy 29-es hibridizációs protokollal dúsítottuk a gyöngy befogásához 52 dimenziós 40 szondákkal, amelyeket egyetlen alap páros burkolatokban terveztünk az rCRS-en (az Országos Biotechnológiai Információs Központ [NCBI] NC_012920 hivatkozása) két rögzítési fordulóban, 1 μg, illetve 0,5 μg bemenő DNS felhasználásával. A rögzített könyvtárat (L5502) MiSeq platformon (Illumina) szekvenáltuk párosított végek (2 x 76 ciklus) felhasználásával, kettős indexkonfigurációval, 38-mal. Az eljárás során negatív kontrollként egy vak DNS kivonási és egy üres könyvtár előkészítési futtatást végeztünk.

A szekvencia feldolgozása és feltérképezése

Az alap hívás Bustard (Illumina) segítségével történt. Az adapter szekvenciákat megcsonkítottuk, és az előre és hátra olvasásokat egyesítettük az egyes 41 szekvenciákba. Azokat a sorozatokat, amelyekből hiányzott a tökéletes vonalkóddal való megfelelés, elvetették. A referenciagenomra való leképezést a BWA 42 alkalmazásával "-n 0, 16500-01-02-1 16500" 7 paraméterekkel hajtottuk végre. A PCR duplikátumokat azonos kezdési és vég-koordinációs koordinátákkal rendelkező szekvenciák összevonásával távolítottuk el a bam-rmdup alkalmazásával (//github.com/udo-stenzel/biohazard). További elemzés céljából 35 bázisnál hosszabb szekvenciát hagytunk, 30-nál magasabb feltérképezési minőséggel.

Filogenetikai elemzés

A terminális C-T szubsztitúciót hordozó szekvenciákat használtuk a DC1227 mtDNS rekonstrukciójához. Az egyes szekvenciák első vagy utolsó pozíciójában lévő Ts terminált N-vé alakították, hogy csökkentse a konszenzusos híváskárosodásból származó szekvenciahibák hatását. A konszenzus bázist akkor határoztuk meg, ha a pozíciót legalább három szekvencia fedi le, és ha a szekvenciák legalább 67% -a, azaz az átfedő szekvenciák több mint kétharmada azonos bázist tartalmaz 34 .

Az MtDNS-t összehasonlítottuk mtDNS 311 jelenlegi emberekkel 43, 10 régi modern emberekkel 31, 44, 45, 46, 47 tíz neandervölgyi 5., 33., 35., 48., 49., két denizovánnal 3, 4 és középső pleisztocén homininnel 34 és csimpánzsal, NC_001643 50 a MAFFT 51-től. Ezen különbségek alapján a szekvenciák és az 500 bootstrap replikációhoz 52 összekötő fa közötti alapvető különbségek számát a MEGA6 generálta 53 .

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Brown, S. és mtsai. Új hominin csont azonosítása a szibériai Denis Cave-ból kollagén és mitokondriális DNS ujjlenyomat-elemzéssel. Sci. ismétlés. 6., 23559; doi: 10, 1038/srep23559 (2016).

Hozzáférési kód: A DC1227 (Denisova 11) minta mitokondriális genomiális szekvenciáját a GenBankban tároltuk (hozzáférési szám: KU131206).

További információ

PDF fájlok

További információ

Excel fájlok

Kiegészítő információk 1

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.