elemeket
absztrakt
A Q10 koenzim (CoQ 10) fontos szerepet játszik a mitokondriális energia-anyagcserében, mivel a légzési lánc elektronhordozójaként működik. A CoQ 10 endogén bioszintetikus útját megzavaró genetikai hibák súlyos anyagcserezavarokhoz vezethetnek, amelyek kora gyermekkorban jelentkeznek. Végzetes újszülöttkori tejsavas acidózisban és encephalopathiában szenvedő gyermekek exoma-szekvenálásával azonosítottuk a COQ9 funkcióvesztés homozigóta változatát. Fibroblasztos betegeknél végzett funkcionális vizsgálatok azt mutatták, hogy a COQ9 fehérje hiánya a COQ7 erőteljes csökkenésével járt, ami a COQ7 szubsztrát, a 6-demetoxi-ubiquin 10 jelentős felhalmozódásához vezetett. Ugyanakkor a CoQ 10 teljes mennyisége jelentősen csökkent, ami a mitokondriális légzési lánc szukcinát-citokróm-c-oxidoreduktáz (II/III komplex) aktivitásának jelentős csökkenésében mutatkozott meg. A COQ9 lentivirális expressziója helyreállította ezeket a paramétereket, és megerősítette a variáns ok-okozati szerepét. Jelentésünk a második COQ9-es páciensről kibővíti a COQ9 variánsokkal járó klinikai spektrumot, kiemelve a COQ9 fontosságát a prenatális fejlődés során. Ezenkívül a sejtes CoQ 10 szintek és a komplex légzési lánc aktivitás megmentése a CoQ 10 kiegészítésével rámutat a korai diagnózis és az azonnali kezelés fontosságára.
A Q10 koenzim (CoQ 10) zsírban oldódó anyag, egy természetben előforduló anyag, amely nélkülözhetetlen kofaktorként működik a mitokondriális légzési láncban. 1 Elektronvivőként működik az I és II komplextől a III komplexig, és így redoxi cikluson megy keresztül az oxidált (ubikinon) és a redukált forma (ubiquinol) között. Ezenkívül a CoQ 10 összeköti a zsírsavak mitokondriális béta-oxidációját a légzési lánccal, részt vesz a pirimidin bioszintézisében és modulálja az apoptózist. 2 Redukált formájában a CoQ 10 molekula erős antioxidánsként szolgál.
A CoQ 10-et bioszintézissel vagy étrendi bevitel útján nyerik. A bioszintézis azonban a CoQ10 egyik fő forrása, amely magában foglal legalább 13 gén (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ3, COQ4, COQ5, COQ6, COQ7, ADCK3, ADCK4, COQ9, COQ10A és COQ10B) koordinált funkcióját. A mai napig ebből a génből nyolcat állapítottak meg az elsődleges CoQ 10 hiányzavarok (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ4, COQ6, ADCK3, ADCK4 és COQ9) okai, amelyek klinikailag heterogén betegségcsoportok, amelyek gyakran gyermekkorban jelentkeznek. ., 4 Quinzii és mtsai. 5 fő klinikai fenotípus különböztethető meg: (1) encephalomyopathia, (2) súlyos infantilis multisystem betegség, (3) nephropathia, (4) cerebellaris ataxia és (5) izolált myopathia. A CoQ 10 hiányosságának azonosítása azért fontos, mert a CoQ 10 kiegészítés bizonyos körülmények között előnyös lehet.
A mai napig csak egy olyan betegről számoltak be, aki CoQ 10-hiányban szenvedett homozigóta letartóztatási variáns miatt a COQ9 c.730C> T, p.Arg244 * -nál, ami újszülöttkori tejsavas acidózishoz, ellenőrizhetetlen rohamokhoz és globális fejlődési késéshez vezetett. Az exome szekvenálást használva azonosítottunk egy új változatot, amely befolyásolja a COQ9 funkcióját, az újszülött encephalopathiájához és a korai halálhoz társítva. Jelentésünk kiterjeszti a COQ9 variánsokkal járó klinikai spektrumot, és rámutat egy súlyos pre/neonatális kezdeti fenotípusra. A COQ9-hiányos betegek fibroblasztjait részletesen jellemezték, és bemutatták a genetikai hiba funkcionális következményeit.
Esetleírás
Az itt közölt fiú az egészséges, első osztályú török szülők második gyermeke volt. 13 éves testvére egészséges. A terhesség a 27. terhességi hétig normális volt, amikor az oligohidramniót észlelték. Abban az időben a szülők elutasították az ajánlott császármetszést. Végül a baba a terhesség 36. hetében született császármetszéssel anhydramnion miatt. Az APGAR pontszáma 5/4/6 volt. Az újszülött terhességi kora miatt kicsi volt, születési súlya 1440 g, hossza 39,5 cm, fejkörfogata 28,8 cm (az összes érték a 3. percentilis alatt van). Nem figyeltünk meg diszmorf stigmákat. A közvetlen posztnatális időszakban a páciensnek rossz volt a légzése, izom-hipotenziója, bradycardia és generalizált cyanosis volt. A babát intubálták és újszülött intenzív osztályára helyezték át. A laboratóriumi vizsgálatok laktátacidózist (legfeljebb 22 mmol/l; standard: 160) tártak fel, ami a CoQ 10 anyagcsere hibáját jelzi. Az izom- és májszövet szövettani vizsgálata nem volt specifikus.
a ) Újszülött agyi ultrahangja a COQ9 patogén változatával. Bal és középső panel: a jobb és a bal oldali parasagittalis nézet, amely hiperechoikus jelet mutat a bazális ganglionokban (nyíl) és a choroid plexus (csillag) kétoldali cyorosisában. Jobb panel: koronális nézet, amely a hiperechoikus bazális ganglionok szimmetrikus rendellenességeit mutatja, Leigh-szerű újszülött-szindrómára utalva. ( b ) A c.521 + 1 deléció jelenlétében keletkezett transzkriptum vázlatos diagramja. A kromatogram azt mutatja, hogy a deléció a 4. és 5. exon átugrását okozza a beteg fibroblasztjaiban. ( c ) Western blot a betegek és a mitokondriumokkal dúsított kontroll fibroblasztok frakcióin (reprezentatív kép). Nem transzdukált (Q) COQ9 nem mutatható ki a betegek sejtjeiben. A jel helyreáll a vad típusú (+) CQ9 cDNS-sel végzett lentivirális transzdukció után. Ezenkívül a COQ7 antitestet alkalmazták, amely súlyos COQ7 fehérje csökkenést mutatott a betegek sejtjeiben. Porin (VDAC) -t használtunk töltő markerként.
Teljes méretű kép
Anyagok és metódusok
Az ebben a dokumentumban használt anyagok és módszerek részletes leírása megtalálható a kiegészítő anyagban.
Eredmények és vita
A betegség genetikai okának feltárására exoma szekvenálást végeztünk a fent leírtak szerint. 7 Autoszomális recesszív öröklődési módot feltételezve elemzéseink a MAF 9 homozigóta és előre jelzett heterozigóta nem szinonim variánsokra összpontosítottak
Továbbá megvizsgáltuk a variáns hatását a COQ9 expressziójára, mitokondriális dúsítású fehérjék immunmodekációjával, COQ9-re specifikus antitest felhasználásával. Különböző mennyiségű mitokondriális fehérje alkalmazásával nem tudtuk kimutatni a COQ9-et a betegek sejtjeiben, míg a kontrollokban mindig kimutattuk a COQ9-et, jelezve a csonka fehérje lebomlását (1c. Ábra).
Ezenkívül több mitokondriális enzimet mértünk spektrofotometriásan mitokondriálisan dúsított fibroblaszt-frakciók alkalmazásával. A II/III légzési lánc aktivitásának meghatározásához megmértük a citokróm c csökkenését. A komplex IV aktivitás szempontjából a redukált citokróm c oxidációját figyeltük meg, és az 5,5'-ditiobisz (2-nitro-benzoesav) redukcióját követően a mitokondriális mátrix enzimatikus markerének citrát-szintáz aktivitását mértük. A CoQ 10 bioszintézis hibájával és a fibroblasztokban talált hibával összhangban a beteg sejtjei szignifikánsan csökkenték a komplex II/III aktivitást (2a. Ábra).
A COQ9 expressziója a kontroll sejtekben normál vagy csökkent COQ10 szinttel a COQ2 variánsok miatt nem volt hatással a komplex II/III aktivitásra (2a. Ábra). Miután azonban vad típusú cDNS-t expresszáltunk COQ9 variánsokat hordozó betegek fibroblasztjaiban, a komplex II/III aktivitás szignifikáns négyszeres növekedését figyeltük meg.
Mivel a COQ9 részt vesz a CoQ 10 bioszintézisében, a CoQ10 teljes mennyiségét ultranagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, tandem tömegspektrometriával (UPLC-MS/MS) párosítva mértük. Mindkét CoQ 10 beteg sejtvonal jelentősen csökkent CoQ 10 szintet mutatott, 10 pmol/mg fehérje a COQ2 variáns fibroblasztokban és 7,3 pmol/mg fehérje a COQ9 variáns fibroblasztokban (normális tartomány 46, 5-90, 5 pmol/mg fehérje). A transzdukciót követően a COQ9 mutáns fibroblasztok jelentős (körülbelül háromszoros) növekedést mutattak a CoQ 10 szintekben, míg a CoQ 10 szintek változatlanok maradtak a COQ2 mutáns sejtekben (2b. Ábra). Ezek a megállapítások ok-okozati összefüggést bizonyítanak az azonosított COQ9 variáns, a CoQ 10 hiány és a csökkent komplex II/III aktivitás között.
Egérmodellben végzett kutatások és a legújabb, emberen végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a COQ9 egy lipidkötő fehérje, amely szerkezeti homológiát mutat a TFR (bakteriális transzkripciós szabályozók) családdal. 9, 11 Lohman és mtsai. A 9. ábra kimutatta, hogy a COQ9 valószínűleg nem működik transzkripciós faktorként, és azt javasolta, hogy a TFR szerkezeti komponense replikálódjon az evolúció során. Ahelyett, hogy egyedül a CoQ10 specifikus bioszintézis-reakcióját katalizálnák, feltételezzük, hogy a COQ9 vagy CoQ10-hez, vagy CoQ10-prekurzorhoz kötődik, és komplexet képez a COQ7-gyel. A COQ7 katalizálja a 6-demetoxi-CoQ10 hidroxilezését, amely a CoQ bioszintézisének előzetes lépése. A páciens sejtvonalában jelentősen csökkent COQ7 mennyiség, amelyet a COQ9 növekedése ment meg, COQ7 stabilizáló COQ9 funkciót jelez (1c ábra).
Meg kell jegyezni, hogy egy lehetséges CoQ10 bioszintézis köztiterméket leírtak COQ9-mutáns egerekben, valamint emberi fibroblasztokban. 6, 11 Egerekben ezt a metabolitot 6-demetoxi-ubiquinon 9-ként azonosították. A részletes humán vizsgálatok még mindig hiányoznak. Az emberi sejtek metabolitjának jellemzésére különféle UPLC-ESI-MS/MS analitikai technikákat hajtottunk végre, például pásztázást, prekurzor ion-pásztázást vagy többszörös reakciómonitorozást. Az egereken végzett vizsgálatokkal összhangban specifikusan kimutattunk 6-demetoxi-ubikinont 10 a COQ9 fibroblasztokban (2c. És d. Ábra). Mivel a 6-demetoxi-ubikinont 10 a COQ7 hidroxilezésével 6-hidroxi-ubiquinon 10 képződik, ennek a köztiterméknek a felhalmozódása a csökkent COQ7 mennyiséggel magyarázható. A várakozásoknak megfelelően a COQ9 expresszió normalizálta a COQ7 és a 6-demetoxi-ubikinon 10 szintjét (2d. Ábra). A metabolit más sejtvonalakban nem volt kimutatható.
A CoQ 10 pótlása előnyös néhány CoQ 10-hiányos betegnél. Sejtvonalunkban a kezelés hatásának vizsgálatához Lopez és munkatársai szerint 1 hétig 5 μM CoQ 10-tel egészítettük ki őket. A CoQ 10 kezelés megmentette a komplex II/III aktivitást a mutáns COQ9 mutánsok fibroblasztjaiban a legalacsonyabb kontrollérték -80% -áig (2e. Ábra). Szinte ugyanezt a hatást figyelték meg a COQ2-mutáns fibroblasztokban, míg a kontroll fibroblasztokban nem mértek különbséget. A CoQ 10 tartalma a betegek fibroblasztjaiban jelentősen, körülbelül 11-szeresére nőtt a kezelés után, és elérte a kontroll értékeket (2b. Ábra). Érdekes módon a 6-demetoxi-ubikinont 10 nem sikerült kimutatni a COQ9 genetikai hibával rendelkező fibroblasztokkal rendelkező betegeknél a CoQ 10 kezelés után, ami a CoQ 10 elegendő exogén kiegészítésével járó csökkent endogén bioszintézisnek tudható be (2d. Ábra).
Végül tanulmányunk további betekintést nyújt a COQ9 hiány klinikai és sejtes következményeibe. Betegünknél megfigyelt súlyos klinikai lefolyás már a prenatális fejlődés során a COQ9 kritikus funkciójára utal. Az eset Duncan és munkatársai leírásával együtt a COQ9 hiányt a CoQ 10 metabolizmus rendellenességeinek legsúlyosabb formái közé sorolja, összehasonlítva a COQ2 vagy COQ4 rendellenességben szenvedő betegeknél leírtakkal. Ugyanakkor további klinikai leírásokra lesz szükség a COQ9 mutációval rendelkező betegek specifikus klinikai spektrumának értékeléséhez. Duncan et al. 6 A CoQ 10 kezelés hasznos lehet COQ9-hiányos gyermekeknél. Ezért az újszülött/kora gyermekkori mitokondriális betegség tisztázatlan eseteiben empirikus CoQ 10 kezelés javasolt. .