variáns

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Klinikai exoma szekvenálás
  • Sejtkultúra és transzfekció
  • RNS extrakció és cDNS szintézis
  • Hülyeség által közvetített szétesés
  • Kvantitatív RT-PCR
  • DNS expressziós konstrukciók és hely-irányított mutagenezis
  • SDS-PAGE és Western blot
  • Fluoreszcens mikroszkópia
  • Luciferáz riporter vizsgálatok
  • Biolumineszcens rezonáns energiaátadás (BRET)
  • Statisztikai jelentőség
  • az eredmény
  • Klinikai fenotípus
  • Új a FOXP1 variáns variánsa, amelyet exoma szekvenálással azonosítottunk
  • Egy szekvenciaváltozat funkcionális jellemzése FOXP1 emberi sejtekben
  • vita
  • növekményekkel
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ
  • Képfájlok
  • További 1. ábra
  • További 2. ábra

elemeket

  • Funkcionális genomika
  • Az idegrendszer genetikája
  • A neurológiai fejlődés zavarai
  • Új generációs szekvenálás

absztrakt

A FOXP1 (elülső box P1 fehérje) egy transzkripciós faktor, amely részt vesz számos szövet, köztük az agy fejlődésében. A fehérjebontó FOXP1 variánsok kialakulóban lévő fenotípusa globális fejlődési késést, mentális fogyatékosságot, valamint enyhe vagy súlyos beszéd-/nyelvi hiányosságokat tartalmaz. Olyan gyermekről beszélünk, amelynek kórtörténetében súlyos hipotenzió, autizmus spektrumzavar és enyhe mentális fogyatékosság áll fenn, súlyos beszéd-/nyelvi károsodással. A klinikai exoma szekvenálás a FOXP1 c.1267_1268delGT heterozigóta de novo variánsát azonosította (p.V423Hfs * 37). Sejtmodellekkel végzett funkcionális elemzések azt mutatják, hogy a variáns megzavarja az FOXP1 aktivitás számos aspektusát, beleértve a szubcelluláris lokalizációt és a transzkripciós represszív tulajdonságokat. Eredményeink rámutatnak a funkcionális jellemzés elvégzésének fontosságára, hogy segítsen feltárni a genomi megközelítések által azonosított variánsok biológiai jelentőségét, és ezáltal betekintést nyújtsunk a komplex idegfejlődési rendellenességek hátterébe. Ezenkívül adataink alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a de novo variánsok jelentős ok-okozati tényezőket képviselnek súlyos szórványos rendellenességekben, és kiterjesztik a FOXP1 haploinsufficiency egyénekben megfigyelt fenotípust.

A FOXP1 (P1 villafehérje; OMIM 605515) a FOX transzkripciós faktor fehérje géncsaládjába tartozik, amelyet egy jellegzetes, villás dobozként (FOX) ismert DNS-kötő domén jelenléte határoz meg. 1 Az egér ortológusa, a Foxp1 a szív, a tüdő és a nyelőcső normális fejlődéséhez szükséges, 2, 3, és a Hox transzkripciós faktorok kiegészítőjeként működik a motoros neuronok vetületeinek és az izmokhoz való kapcsolódásának szabályozásában. 4, 5 A Foxp1 fontosságát az idegsejtek fejlődésében rávilágítanak a Foxp1 agyspecifikus deléciójú egereken végzett vizsgálatokkal. 6 Ezek a mutáns egerek károsodott neuronális fejlődést és autista viselkedést mutatnak. Az elmúlt években FOXP1 variánsokról számoltak be olyan betegeknél, akiknél szórványos autizmus (ASD), mentális fogyatékosság (ID), globális fejlődési késés és mérsékelt vagy súlyos beszédkésés volt jellemző, ahol az expresszív beszéd a leginkább érintett (OMIM 613670)., 7, 8 A beszéd- és nyelvi rendellenességek jelenléte a FOXP1 elégtelenség szindróma jellemzőjeként érdekes, mert a FOXP1 leginkább hasonló génje a FOXP2, amely a beszéd és a nyelvi rendellenességek ritka formájában megszakad (OMIM: 605317 gén, 602081 rendellenesség ).,

Az ASD-ben és/vagy ID-ben szenvedő betegeknél azonosított FOXP1 variánsok közé tartozik a teljes gének deléciója, 7, 9, 10, 11, 12 transzlokáció, 13 hülyeségváltozat, 14 missense-variáns 15 és a kereteltolás-variáns. A teljes gén delécióinak azonosítása arra utal, hogy a patogenitás mechanizmusa a haploinsufficiency. A fenotípus súlyossága azt sugallja, hogy ezek a mutációk nem öröklődhetnek, és minden olyan esetben, amikor a szülő DNS-ét tesztelték, de variánsok de novo előfordulását tapasztalták. A következő generációs szekvenálás segítségével azonosítottuk és jellemeztük a FOXP1 de novo variánsait egy olyan lánynál, akinek kórelőzményében súlyos hipotenzió, ASD és enyhe ID volt, súlyos beszéd/nyelvi hiányokkal.

Anyagok és metódusok

Klinikai exoma szekvenálás

A proband és nem érintett szülei klinikai exoma szekvenálását az UCLA Klinikai Genomikai Központban végeztük (az UCLA klinikai exoma pipeline részletes leírását lásd Lee és mtsai 17). Csak egy, a FOXP1 gént befolyásoló, kiváló minőségű, nem szinonim, de novo kódoló változatot azonosítottak egy betegnél. Ennek a szekvenciaváltozatnak a minőségi pontszáma ≥ 500 volt, a szülőknél az olvasó nem támogatta az alternatív allélt, és soha nem figyelték meg az általános populációban (az 1k Genomes Project, dbSNP135, NHLBI ESP alapján). Nem találtak klinikailag jelentős örökletes homozigóta, hemizigóta, homoplazmatikus vagy kombinált heterozigóta variánsokat a betegben.

Sejtkultúra és transzfekció

Az Epstein-Barr vírussal transzformált élő limfoblaszt sejteket apától, anyától, probandtól és egy érintetlen testvértől kaptuk. A tenyészeteket RPMI-1640-ben (Lonza, Verviers, Belgium) 10% magzati szarvasmarha-szérummal kiegészítve növesztettük (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A HEK293 sejteket DMEM-ben és SHSY5Y-ben növesztettük DMEM-F12-ben (Invitrogen). A táptalajt 10% szarvasmarha-magzati szérummal (Invitrogen) egészítettük ki. A transzfekciókat a GeneJuice alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint (Merck-Millipore, Amszterdam, Hollandia).

RNS extrakció és cDNS szintézis

Az összes RNS-t RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Hollandia) segítségével immortalizált limfoblasztokból extraháltuk, és az első szálú cDNS-t nagy áteresztőképességű cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával állítottuk elő (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA).

A szétesést értelmetlenség közvetíti

A nonszensz-közvetített lebomlást (NMD) a korábban leírtak szerint értékeltük. A 16 FOXP1 cDNS-t PCR-rel amplifikáltuk 5'-GTCTACAGAACCCAAAGCCGC-3 'és reverz 5'-GGTTCTGCGCAATATCTGCTG-3' primerek alkalmazásával, majd Sanger szekvenálással.

Kvantitatív RT-PCR

A kvantitatív RT-PCR-t a 18. korábbiakban leírtak szerint hajtottuk végre, a FOXP1 amplifikációra specifikus láncindítók alkalmazásával.

DNS expressziós konstrukciók és hely-irányított mutagenezis

A vad típusú (WT) FOXP1-t és FOXP2-t PCR-rel amplifikáltuk és pCR2.1-TOPO-ba (Invitrogen) klónoztuk. 19 p.V423Hfs * 37 változat A pCR2.1-TOPO.FOXP1 felhasználásával, a QuikChange II Site-Direct mutagenezis készlettel (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) és az 5'-TGGTGGTTGTGATGAGAGGGGGG-3 'sablon segítségével állítottuk elő. 5'-CCCAAGGCCCCTCTCATCACAACCACCA-3 'primerek. A FOXP cDNS-eket BamHI/Xba I restrikciós helyek felhasználásával szubklónoztuk pcDNA4HisMax-ba, egy módosított pmCherry-C1 vektorba (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Franciaország), valamint pLuc és pYFP expressziós vektorokba. Az összes konstrukciót Sanger szekvenálással igazoltuk.

SDS-PAGE és Western blot

A HEK293 sejteket ekvimoláris koncentrációjú FOXP1 expressziós plazmidokkal transzfektáltuk és 48 órán át tenyésztettük. A sejtek lízisét, SDS-PAGE-ját és Western-blot-ját a korábban leírtak szerint hajtottuk végre. 19 membránt vizsgáltunk Clontech egér anti-EGFP-vel (pYFP konstrukciókhoz) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd HRP-konjugált kecske anti-egér IgG-vel inkubáltuk 45 percig szobahőmérsékleten (Bio-Rad, Veenendaal, Hollandia). A blotokat összegyűjtöttük és Sigma anti-β-aktin antitesttel újra teszteltük, hogy azonos fehérjetartalmat igazoljunk.

Fluoreszcens mikroszkópia

A HEK293 és SHSY5Y sejteket fedőlemezre rögzítettük, a korábban leírtak szerint. 19 YFP és mCherry fúziós fehérjét direkt fluoreszcenciával, a magokat pedig Hoescht 33342 (Invitrogen) segítségével vizualizáltunk. A fluoreszcencia képeket Axiovert A-1 fluoreszcens mikroszkóppal készítettük ZEN Image Software alkalmazással (Zeiss, Oberkochen, Németország).

Luciferáz riporter vizsgálatok

A Luciferase-vizsgálatokat a korábban leírt módon hajtottuk végre. 19.

Biolumineszcens rezonáns energiaátadás (BRET)

A BRET vizsgálatokat a korábban leírt módon hajtottuk végre. 19, 20

Statisztikai jelentőség

A luciferáz riporter vizsgálat statisztikai szignifikanciáját egyirányú varianciaanalízissel és Tukey post hoc vizsgálatával elemeztük.

az eredmény

Klinikai fenotípus

A beteg tizennégy éves nő, görcsök nélküli szülők elsőszülött gyermeke. Édesanyja 30, apja 32 éves volt. A C-szakaszban született oligohidramnion és preeclampsia következtében, és születése során kettős hártyás köldökzsinórral és súlyos hipotenzióval találták. Az első évben súlyos motoros késések voltak; 12 hónaposan kezdett kúszni és 20 hónaposan sétált. A betegnek késett a beszéde is, az első szavak 20 hónap után kezdődtek. 3 éves korában expresszív és befogadó kommunikációs rendellenességet diagnosztizáltak nála.

Jelenleg a beteg beszédének csak 50% -a koherens és nem képes tartani a beszélgetést. Pontosabban, beszédének nincs szerkezete, korlátozott a tartalma és az elosztása, és egyszerű kifejezéseket ismétel (echolalia). A kommunikáció előnyös módja az üzenetek küldése elektronikus eszközön keresztül. A beteg rossz nyelvértékelést végzett: 50 pont a beszélt nyelv átfogó értékeléséért (

Teljes méretű kép

Normál eredménnyel végzett vizsgálat magában foglalta az izomdisztrófia, a mitokondriális rendellenességek, a törékeny X szindróma és az SNP mikroarray genetikai vizsgálatát. Az elektroencefalográfia és az idegvezetési vizsgálatok normálisak voltak. A 12 éves korban végzett mágneses rezonancia képalkotás több nem intenzívebb subcorticalis és mély fehérállományi rendellenességet, valamint véletlenszerű vénás angioma megállapítást mutatott a bal elülső lebenyben.

Az exoma szekvenálással azonosított FOXP1 szekvencia de novo változata

Az ASD ritka eseteiben a legújabb génfelfedezési megközelítések a de novo variánsok azonosítására összpontosítottak a teljes exoma szekvenálásával egy szülő-gyermek trióban. Ez a stratégia sikeres volt a populáció kockázatának jelentős részének és a viszonylag nagyobb biológiai hatásokat okozó variációk azonosításának. 21 A feltételezett variánsok azonosítása érdekében, amelyek befolyásolhatják a fehérje működését, 17 kísérleti exoma szekvenálást végeztünk a probandumok és szüleik DNS-jén anélkül, hogy ezt befolyásoltuk volna. Ezzel a megközelítéssel azonosítottunk egy, a probandumban jelenlévő FOXP1-ben egy heterozigóta de novo kétbázisos deléciót, amelyet ezt követően Sanger-szekvenálással validáltunk és megerősítettünk de novo-ként (1b. Ábra). A FOXP1 variáns bekerült az NCBI ClinVar adatbázisába (//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; ClinVar belépési szám SCV000189225).

Ez a változat, a c.1267_1268delGT (az NM_032682.5-ben az első kódoló nukleotidtól számozva) a FOXP1 15. exonjában található (NG_028243.1-től számozva). A változás várhatóan kereteltolódást vezet be a kódolt fehérjébe, ami a DNS-kötő domén és a nukleáris lokalizációs jelek (NLS) idő előtti megszűnését és elvesztését eredményezi (p.V423Hfs * 37, a HGVS ajánlása szerint) (1c. Ábra). A múltban a FOXP1 két potenciálisan okozó heterozigóta de novo csonka változatáról számoltak be ASD (c.1014_1015insA (p.A339Sfs * 4)) és ID (c.1573C> T (p.R525 *)) beszéd esetén és nyelvi hiányosságok (lásd az 1c ábrát a három csonka FOXP1 fehérje variáns összehasonlításához).

Mivel a variáns egy stop kodont vezet be az utolsó exonhatár előtt az FOXP1-ben, a mutáns transzkriptum NMD-n megy keresztül. Ezért értékeltük a FOXP1 transzkriptumok expresszióját a probandumokból nyert limfoblasztokban. Normál sejttenyésztési körülmények között csak a WT allél expresszióját találták (1d. Ábra). Az NMD gátlása után mind a variáns, mind a WT allél expressziója kimutatható volt, ami arra utal, hogy a variáns transzkriptumokat az NMD általában lebontja (1d. Ábra). Annak megállapítására, hogy valamelyik variáns transzkriptum elkerülte-e ezt a folyamatot, kvantitatív RT-PCR-t hajtottunk végre a FOXP1 variáns allélra specifikus primerekkel, és megállapítottuk, hogy a c.1267_1268delGT FOXP1 alacsony szinten expresszálódik a probandumokból nyert limfoblasztokban (1e. Ábra és 1. kiegészítő kép ).

A FOXP1 szekvenciaváltozat funkcionális jellemzése emberi sejtekben

A variáns NMD-szökő transzkriptumok hatásainak vizsgálatához elvégeztük a mutált transzkriptum által kódolt fehérje funkcionális jellemzését. A FOXP1 WT és variáns formáit YFP- vagy mCherry-fúziós fehérjékként fejeztük ki a HEK293 sejtekben. A p.V423Hfs * 37 fehérjeváltozatot a WT fehérjéhez hasonló szinten expresszáltuk, amelyet Western-blot segítségével határozunk meg (2a. Ábra). A magban lokalizált FOXP1-vel ellentétben a p.V423Hfs * 37 variáns fuzionált a citoplazmában lokalizált mCherry-hez, összhangban mindkét nukleáris lokalizációs jel elvesztésével (2b. Ábra). Meg kell jegyezni, hogy amikor a p.V423Hfs * 37 variáns összeolvadt az YFP-vel, aggregátumok képződtek a citoplazmában (2. kiegészítő ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a FOXP1 variáns szubcelluláris lokalizációjának vizsgálatával transzfektált humán SHSY5Y neuroblasztóma sejtekben (3. kiegészítő ábra). A FOX DNS-kötő domén hiánya arra utal, hogy a FOXP1 variáns valószínűleg nem fogja megtartani képességét a DNS megkötésére. A luciferáz riportervizsgálatok kimutatták, hogy a p.V423Hfs * 37 variáns nem volt képes elnyomni a transzkripciót, összhangban a DNS-kötő képesség elvesztésével (2c. Ábra).

vita

Itt egy beteget mutatunk be egy de novo 2 bp-os delécióval a FOXP1-ben. Ez a változás a variáns transzkriptumok lebomlásához vezet, és egy nem funkcionális fehérjét kódol, ami arra utal, hogy a beteg fenotípusa valószínűleg az FOXP1 haploinergia következménye. Bemutatjuk továbbá, hogy a FOXP1 variáns transzkriptumok egy részhalmaza az NMD-ből, a WT FOXP1 és FOXP2 szeksztesztánsokból kerül ki a magból, ami arra utal, hogy a p.V423Hfs * 37 variánsnak domináns negatív hatása lehet a transzlációban. Ebben az esetben a biológiai hatások a mechanizmusok kombinációjának lennének köszönhetők, a fő kóros mechanizmus a haploinformáció lenne. A jövőbeni FOXP1 leütéses vizsgálatoknak (pl. ShRNS konstrukciók alkalmazásával) informatívaknak kell lenniük az FOXP1 haploinsufficiency molekuláris szintű hatásainak felmérésében.

Betegünk számos fenotípusos jellemzővel rendelkezik más olyan személyekkel, akik a FOXP1 olyan változatait hordozzák, amelyek megzavarják a fehérje működését, beleértve az autizmust, az ID-t, a súlyos nyelvi hiányt és a makrocefáliát. 7 Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a FOXP1 haploinsufficiency egy különálló szindrómát eredményez, amely magában foglalja az ID és az ASD aspektusait, valamint egyéb klinikai tüneteket. 7 A FOXP1 variánsok célzott szűrése ezért indokolt a szindrómával összhangban álló klinikai jellemzőkkel rendelkező probandokban.

Noha betegünknél a beszéd és a nyelv érintett volt, nem volt gyermekkori beszédapraxia (a beszédhez szükséges orofaciális izommozgások komplex szekvenciájának összehangolásával kapcsolatos nehézségek), és ez a legfontosabb jellemző patogén FOXP2 mutációk esetén. 26, 27 A FOXP2 variánsokkal rendelkező egyéneknél a beszéd artikulációs problémáihoz rendellenességek társulnak az expresszív és perceptuális nyelv több vonatkozásában. 28, 29 Pácienseinknél a hangsúlyosabb nyelv sokkal szignifikánsabban érintett, mint a befogadó nyelv, összhangban azokkal a fenotípusokkal, amelyeket más egyéneknél figyeltek meg a FOXP1 funkcióvesztés változataival. 7, 11, 14 Eddig a FOXP1 egyetlen olyan változatát sem figyelték meg, amely globális kognitív diszfunkció hiányában nyelvi károsodást okozna. A FOXP1 és FOXP2 haploinergia fenotípusok közötti megfigyelt különbségek tükrözhetik a 23., 24. idegi expressziós modellek és/vagy a megosztott és nem megosztott downstream célok szabályozásának különbségeit.

Vizsgálatunk további bizonyítékokat szolgáltat arra vonatkozóan, hogy a súlyos izolált neurodevelopmentális rendellenességek jelentős része a de novo változatok következménye lehet. Ez a tanulmány tovább hangsúlyozza a következő generációs DNS-szekvenálással kimutatott variánsok kísérleti jellemzésének fontosságát a neurológiai fejlődés fő rendellenességei szempontjából alapvető molekuláris és sejtes hálózatok megértésében.