Absztrakt

A nitrofuránok a hatásos széles spektrumú antibakteriális gyógyszerek csoportja, amelyek szintén antiprotozoális aktivitással rendelkeznek. Világszerte továbbra is számos bakteriális és protozoon fertőzés kezelésére használják az élelmiszertermelő állatokban, különösen a sertések és a baromfi esetében, és képesek rákot, valamint egyéb mérgező mellékhatásokat kiváltani különféle kísérleti modelltervekben. 1, 2, 3 Ezeket a bizonyítékokat számos országban elfogadták az állat-egészségügyi használatuk betiltásának alapjaként.

Az 1980-as évek végén, az amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal arra az elképzelésre építve, hogy a Delaney-kiegészítés megakadályozza a rákkeltő anyag fogyasztását az emberi fogyasztókban, megtiltotta a furazolidon (FZD) és a nitrofurazon (később kiterjesztette a furaltadonra) alkalmazását élelmiszerekben. élelmiszertermelő állatok betegségeinek kezelése. Ez a tilalom azonban megkérdőjelezhető amerikai-külföldi szempontból. Rákindukciót találtak olyan laboratóriumi állatoknál, amelyek közvetlenül nagy mennyiségben kapták a szóban forgó nitrofuránt; 1, 2, 4, de az embereket nem fenyegeti az állati eredetű táplálékból származó nitrofurán-szer elfogyasztása, sokkal inkább a fő metabolitok maradványai: 2-di (2-oxo-oxazolidin-3-il) iminometil-furo-2,3-β-furán, más néven 3-amin-2-oxazolidon (AOZ), és egy kisebb metabolit, N- (5-amino) -2) -furfurilidén) -3-amino-2-oxazolidon (FOZ). A mai napig nincs meggyőző bizonyíték arra, hogy az AOZ/FOZ genotoxikus vagy karcinogén változásokat indukálna.

Az emlősökhöz hasonlóan a halak is a P-450 citokómon keresztül metabolizálják az FZD-t AOZ-vá és FOZ-ra; ezért fel lehet használni azoknak a rákkeltő hatásoknak a tanulmányozására, amelyeket mind az FZD, mind annak AOZ/FOZ metabolitjai képesek produkálni. Dísznövény gynogenetikus halfajok A Poecilia formosa (puhatestűek), amelyeknek őssejtjei és utódai genetikailag azonosak, részben különleges tenyésztési folyamatuk miatt hajlamosak a daganatok fejlődésére. Ez a faj alkalmas modellnek tekinthető a gyógyszerek (9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) karcinogén potenciáljának tesztelésére, és felhasználható az FZD közvetlen karcinogén hatásainak, valamint közvetett hatásainak tanulmányozására. AOZ. Az ilyen hatások összehasonlítását a tilápia (Oreochromis niloticus) esetében is elvégezték.

ANYAG ÉS MÓDSZEREK

Mollies (Poecilia formosa)

Minden esetben 1350 molot használtunk, mindegyik 2 cm hosszú és körülbelül 1,2 g volt. A halakat 40 literes üvegtavakra osztották fel, heti 50% -os vízforgalommal. Mindegyikben 1 liter levegő/perc térfogatot pumpáltunk (Wave Pumps, W Lim Corporation, El Monte, CA, USA), hogy a víz oxigénkoncentrációja 5 ppm legyen. A termosztát hőmérséklete 23 ° C volt. A vízváltozókat (oxigén, hőmérséklet és pH) naponta mértük (Pinpoint digitális oximéter és hőmérő, American Marine Inc., Ridgefield, CT, Cherstertown, MA, USA). Az ammónia, a nitrit, a víz keménységét és a foszfáttartalmat automatizált rendszerrel mértük (Aqua LaMotte, Cherstertown, MA, USA).

Az Am csoportban három 100 mól replikátumot kezeltünk 11 mg FZD/kg takarmány/nap 12 héten keresztül. Minden héten hét mol replikációt csökkentettek és 10% pufferolt formaldehidben tartottak. A halmintákat hisztopatológiai analízishez dolgoztuk fel szokásos viasz-zárvány és hematoxilin-eozin festéssel. 100 kezeletlen moláris kontrollcsoportot (Am kontroll) vettünk fel. A Bm csoportban 300 FZD-vel kezelt nő kapott ugyanolyan adagot, mint fent, és három ismétlésre osztották őket, és a 12. hét végén guppy (Poecilia reticulata) szaporodására ösztönözték őket. Meghatároztunk egy 100 mólos kezeletlen kontrollcsoportot is, és reprodukcióra indukáltuk a fent leírtak szerint (Bm kontroll). A Bm és a kontroll Bm csoportból származó utódokat szokásos kereskedelmi táplálékkal etették, FZD nélkül, és miután elérte az 1 cm-es méretet, 20 replikációs halat leöltünk és feldolgoztunk, mint fent a hisztopatológiai elemzés céljából.

A Cm csoportban 12 hetes gyógyszeres kezelés után 11 mg FZD/kg takarmány 350 kölyköt adott FZD takarmánnyal. Ezt a hallisztet ezután beépítették a kereskedelmi élelmiszerekbe, centrifugálási idő nélkül, 500 g halliszt/kg kereskedelmi takarmány mennyiségével. Összesen 100 puhatestű (Cm1 csoport) etette ezt a dózist 12 héten keresztül. Az AOZ számított dózisa 1,25 μg/kg biomassza puhatestű volt, a takarmányfogyasztás 5 tömeg% biomassza alapján. Ezen időszak végén a halakat a fent leírtak szerint dolgozták fel a daganatok keresése céljából. Létrehoztak egy kezeletlen, 100 puhatestű kontrollcsoportot is (kontroll Cm).

Tilapia (Oreochromis niloticus)

Ebben a szakaszban 325 fiatalkorú hím tilápiát használtak 2 cm hosszúsággal. Az At csoport tartalmazott 65 halat ismétlésenként és három ismétlést, valamint 65 további halat kezeletlen kontrollcsoportonként (At kontroll). Az állatokat a korábban leírt módon rendeltük hozzá. A halak FZD-vel kiegészített kereskedelmi étrendet kaptak 50 mg/kg takarmány adagban 60 napig. Ezen időszak végén ezeknek a halaknak a felét feláldozták és feldolgozták makroszkopikus és hisztopatológiai elemzéshez, a korábban leírtak szerint. A másik fele hallisztből készült, és kereskedelmi táplálékba építették 500 g/kg kereskedelmi takarmányban. Az AOZ számított dózisa 1,6 μg/kg tilápia biomassza volt, a takarmányfogyasztáshoz viszonyítva 5 tömeg% biomassza. A 65 tilápiából álló Bt csoportot 12 hétig táplálékot tartalmazó FZD maradékkal etettük AOZ/FOZ gyógyszer formájában. A kezeletlen csoport kontrolladatait a Bt-csoport kontrollcsoportjának is tekintettük.

A két halfaj csoportjainak megoszlását az 1. táblázat foglalja össze.

Asztal teljes méretben

A vakond és a tilápia hallisztét feldolgoztuk az AOZ és FOZ kimutatására, a Conneely és mtsai. 16 leírása szerint három példányban, Inertsil ODS elválasztó oszlop (150 x 4,6 mm azonos) és 5 mM oxálsav-acetonitril (55: 45) alkalmazásával sejtként. telefon. UV-vis detektálással 265 nm-en (0,04 aufs).

Az adatok statisztikai elemzését Fisher nemparametrikus pontos valószínűségi teszt alkalmazásával végeztük.

AZ EREDMÉNYEK

Az értékelt fizikai-kémiai változók a két fajjal végzett összes vizsgálat során állandóak voltak, a következő átlagértékekkel: hőmérséklet 23,66 ± 1,2 ° C; pH 6,7 ± 0,6; ammónium 0,730 ± 0,09 mg/l; foszfátok 3,0 ± 0,5 mg/l; nitrátok 0,41 ± 0,5 mg/l; oxigén 5,6 ± 0,5 mg/l és vízkeménység (kalciumtartalomra mérve) 120 ± 6,5 mg/l.

A HPLC-analízissel az AOZ jelenléte 25 ± 8, 5 és 32 ± 4,8 μg/kg koncentrációjú lepkékkel és tilápiával előkészített hallisztben is megtalálható. Mindkét hallisztmintában csak nem számszerűsíthető FOZ nyomokat találtak. Ezek az AOZ-koncentrációk 1,25 μg/kg molla biomasszának és 1,6 μg/kg tilapia biomasszának megfelelő AOZ-dózisokat engedélyeztek.

Mollies (Poecilia formosa)

Az anyajegyek kórszövettani vizsgálata egyértelműen megmutatta a máj steatosisát az FZD-vel kezelt halak összes mintájában. A kontroll állatok nem mutattak ilyen elváltozást. A 3. héttől a vizsgálat végéig az FZD-vel kezelt halak jelentős mértékben megnövelték a máj, a hasnyálmirigy, a vesék és az ivarmirigyek melanohistocytómáit. Az 1a. És b. Ábra néhány példát mutat be ezekre a megállapításokra. A vese (a) és/vagy a máj (b) melanohistocytoma tumor megjelenésének heti előfordulása a következő volt: az első 2 hétben egyik sem, azután 10, 24, 30, 36, 36, 44, 46, 48, 46 és 44, 3-tól 12-ig. Fisher pontos valószínűségi tesztje azt mutatja, hogy az 1. és 2. héthez és a kontroll csoporthoz képest az FZD-vel kezelt csoport statisztikailag szignifikánsan növekedett a daganatokban a 3. és a 12. hét között (P

furazolidon

FZD-vel táplált puhatestűek (Poecilia formosa) által kiváltott vese (a) és máj (b) melanohistocytomák 12 héten át napi 0,111 g/kg takarmányban.

Teljes méretű kép

Tilapias (Oreochromis niloticus)

Az FZD-vel kezelt egyik halnál sem daganatot nem tapasztaltak. Ezzel szemben a máj steatosisát az összes FZD-vel kezelt tilápiában megtalálták. A kezeletlen kontrollhalak nem mutatták ezt az elváltozást.

VITA

A vízben értékelt fizikai-kémiai változók egyetlen kísérlet során sem változtak szignifikánsan. Ezért arra a következtetésre jutottak, hogy nagyon valószínűtlen, hogy a nagyon kicsi megfigyelt ingadozások befolyásolják a megfigyelt eredményeket. A kísérleti karcinogenezist a halfajok alternatív modelleként dinamikus, vonzó és értékes kutatási területként írták le. 11, 12 A Poecilia formosa egy élő hal nőivarú sora, amely gyakori mutációkon megy keresztül, klonális transzmisszióval rendelkezik, és legalább két valóban hipervariábilis lókusza van, amelyek bizonyítják, hogy a puhatestűek mind fizikai, mind kémiai ingerek hatására érzékenyek a mutációs változásokra. 13, 14, 15 Valójában ezt a halfajt előnyösebbnek ítélték meg, mint a rágcsálók alkalmazását a lehetséges rákkeltő anyagok tesztelésére. Ezért ennek a kísérletnek az eredményei alátámasztják ennek a halfajnak a felhasználását a potenciálisan rákkeltő anyagok szűrésére.

A kísérlet elsődleges célja az FZD vagy AOZ/FOZ táplálás hatásainak összehasonlítása/szembeállítása két halmodellben: az egyik hajlamos a tumor kialakulására (Poecilia formosa) és a másik (Oreochromis niloticus), amely nem különböztethető meg. A puhatestűek esetében is sorozatos generációkat teszteltek a csírasejtekre gyakorolt ​​lehetséges felhalmozódás vagy genomiális hatás értékelésére. A várakozásoknak megfelelően az e nyomban összegyűjtött bizonyítékok egyetértenek azzal a megállapított ténnyel, hogy az FZD rákkeltő anyag. 1, 2, 4, 17, 18 Ebben a konkrét vizsgálatban az FZD által kiváltott rák típusát melanohistiocytomának definiálták. Ezek a daganatok az FZD-expozíció idején világosabbá és súlyosabbá válnak. Ezzel szemben ezek a daganatok egyikét sem az anyajegyekben, sem az AOZ/FOZ-szennyezett molliával vagy tilápia-liszttel táplált anyajegyekben, sem a tilápiában, sem a 12 hetes FZD-kezelési periódust túlélő anyajegyek utódaiban nem találták.

A fehérjéhez kötött FZD-metabolitok felhasználásával javasolt kihívást a hallisztben (puhatestűekből és tilápiákból) származó AOZ/FOZ-koncentrációknál hajtottuk végre, amelyek szignifikánsan magasabbak voltak az FZD-vel kezelt állatok sertéshúsban jelentett AOZ-koncentrációinál. a halliszt elkészítéséhez szükséges dehidratációs folyamat. Ez a módszertan különbözik az AOZ egyszerű hozzáadásától a takarmányhoz, mivel az FZD-vel kezelt állatok AOZ-ját kovalensen kötik a szöveti fehérjékhez, jobban hasonlítanak egy trofikus láncra.

A kísérlet másik célja az FZD-metabolitok tápláléklánc-felhalmozódásának hatásainak értékelése volt a következő generációkban. Ebben a kísérletben nem észleltünk észrevehető hatást. Valójában az AOZ/FOZ daganat-kiváltó képességének hiánya, amelyet ezekben a vizsgálatokban találtak, legalábbis az anyajegyek és a tilápia esetében, jobban megfelel azoknak a vizsgálatoknak, amelyek a metabolikus aktivációval vagy anélkül, valamint a Salmonella/. mikroszóma vizsgálat, 20 mint azt feltételezve, hogy az AOZ/FOZ potenciálisan mérgező a sejtekre, például az FZD-re. Klee és mtsai. A 21 nem mutatta ki az AOZ vagy az emésztett élelmiszer-maradványok akut toxicitását a bélszegmensekben és a Caco-2 sejtekben olyan koncentrációkban, amelyek szignifikánsan magasabbak voltak az állati eredetű élelmiszerekben a terápiás dózisok beadása után várható maximális maradékanyag-szintnél. Annak érdekében azonban, hogy nagyobb bizonyossággal megállapítsuk, hogy az AOZ/FOZ ártalmatlan-e a fogyasztók számára, hasznos lesz megismételni ezt a kísérletet nagyobb mennyiségű tisztított és fehérjéhez kötött AOZ és FOZ alkalmazásával, valamint az expozíciós idő meghosszabbításával. ezekre a reagensekre.

A melanohistiocytomák a melanomakrofág központok jóindulatú daganatai. Ezeket a központokat tökéletesen beágyazza a rostos kötőszövet, különösen a májban és különféle szervekben, például a hasnyálmirigyben és a vesében. Ezekről a sejtekről ismert, hogy nagy a sejtosztódás aránya; ezért onkogén felelősségük egyre nagyobb lesz. Úgy tűnik, ez a helyzet a Poecilia formosa esetében, amely csak 3 hét FZD-expozíciót igényelt az ilyen daganatok kialakulásához. Bár az AOZ/FOZ kombinált metabolitjai csak kismértékű változást tolerálnak a kémiai szerkezetben, ezek elegendőek ahhoz, hogy drasztikusan kiküszöböljék az FZD rákkeltő aktivitását.

A steaosis minden FZD-vel, tilápiával és puhatestűvel kezelt halban gyakori megállapítás volt, de ezt a megállapítást a kontroll csoportokban nem figyelték meg. Az étrendben a zsír százalékos aránya megfelelő volt, azaz 8% a puhatestűeknél és a tilápia esetében. Mivel a kontrollhalak nem mutattak steatózist, nem valószínű, hogy a kereskedelmi takarmányban található zsírforrás emészthetősége részben felelős lehet e lézióért. Másrészt kimutatták, hogy az FZD képes ilyen változásokat kiváltani. Azonban nagyon valószínűtlen, hogy a steatosisnak bármilyen kapcsolata lenne az FZD tumor-indukáló tulajdonságával, vagy az AOZ/FOZ esetében megfigyelt hatás hiányával.

Tilapia esetében sem a viszonylag nagy adag FZD 90 napig, sem az AOZ/FOZ-tal szennyezett tilapikus étkezés nem váltott ki detektálható daganatokat. Ezek az eredmények arra is utalnak, hogy az FZD alig rákkeltő az élelmiszertermelő állatokra, ha terápiás dózisokban és ésszerűen korlátozott ideig alkalmazzák. Valójában az irodalom alapos áttekintése automatizált adatbankok segítségével nem tárt fel egyetlen utalást sem az FZD közvetlen daganatkeltő hatására az élelmiszertermelő fajokban.

Azok a halak, amelyeket FZD-vel kiegészített étellel adagolnak, majd más halak táplálásához halliszt előállításához használnak, elegendő lépésnek tűnik ahhoz, hogy megszabadítsák az FZD-t rákot okozó tulajdonságaitól. Ez a nézet összhangban van a legújabb bizonyítékokkal, amelyek megkérdőjelezik azokat a veszélyeket, amelyeket az FZD jelenthet az emberi egészségre, ha takarmány-adalékanyagként használják az állatgyógyászatban. Ezeket az eredményeket figyelembe lehet venni azokban az országokban, ahol a nitrofuránokat még mindig használják az állatok egészségében, és amelyek kormányai még vizsgálják ezeket az anyagokat. Ezeknek az eredményeknek a fogyasztói kockázatértékelésekre történő alkalmazása azonban még nem volt tanulmány tárgya, és az érintett országok szabályozó ügynökségeinek feladata.