elemeket
absztrakt
Az amiloid β fehérje (Aβ) összegyűjtése és tárolása az Alzheimer-kór (AD) és az agyi amiloid angiopathia korai szakaszában fontos esemény. Egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy a gangliozidok kóros platformot képeznek az Aβ-hoz kötött gangliozid képződéséhez, ami megkönnyíti az oldható Aβ összegyűjtését; azonban az agyban a gangliozidokhoz kötődő Aβ molekuláris mechanizmusai továbbra sem tisztázottak, mivel nincs in vivo rendszer, amely megoldaná ezt a problémát. A rovarokban, köztük a Drosophila melanogaster gyümölcslégyben, a gangliozidok természetesen nem találhatók kimutatható szinten. Itt bemutattuk, hogy a gangliozid expresszió indukálható a Drosophilában a gangliozid szintézis enzimek transzgénjeinek expresszióján és az exogén sziálsav leadásán keresztül, és azt is, hogy a gangliozid szintézis indukciója jelentősen felgyorsítja az Aβ in vivo összeillesztését. Eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a gangliozidok felelősek az Aβ in vivo összeállításáért, és lehetőséget nyújtanak az alapkutatás értékes modelljének, valamint az AD terápiás stratégiájának kidolgozására is.
A GAp hipotézis vizsgálata során a hangsúly a genetikailag öröklődött Aβ változattípusok területspecifikus lerakódása volt. Például egy holland típusú mutáció (E22Q) főként az 5, 6 agyi érfalban okozza az amiloid lerakódást, ami azt sugallja, hogy ez a főleg vaszkuláris simaizomsejtekből álló fal egyedi gangliozidokat fejez ki, amelyek kedvezően kezdeményezik a holland sejtek aggregációját. típus Ap. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatához elemeztük a vaszkuláris simaizomsejtekben található gangliozidokat, és megállapítottuk a GM3, és kisebb mértékben a GM2 exkluzív expresszióját. Ezenkívül a várakozásoknak megfelelően a holland Aβ típusú szerelvény jelentősen megnőtt a GM3 7 jelenlétében .
A tanulmány célja a GAp hipotézis további vizsgálata volt a Drosophila modell felhasználásával, amelyben a holland típusú GM3 és Aß indukcióját manipulálták. Itt bebizonyítottuk, hogy a holland típusú Aß összeállítás jelentősen felgyorsult a GM3 által indukált legyeknél.
az eredmény
A GalT6 és SAT1 transzgenikus indukciója a LacCer termeléséhez
A gangliozidok glikoszfingolipidek, és evolúciósan konzerválódnak emlősökben; a gerinctelenek többsége, beleértve a rovarokat is, nem tartalmaz sejtjeiben gangliozidokat. Az emlősök gangliozid szintézisének kezdeti lépésében a GM3 glükozilceramidból (GlcCer) állítható elő laktozilceramidon (LacCer) keresztül (1. ábra). A GM3 szintézis (1. ábra) felelős az 1,4-galaktoziltranszferázért, a LacCer ß1, 4-galaktoziltranszferáz (GalT6/5) és az α2,3-szialiltranszferáz GM3 szintázért (SAT1, más néven ST3GAL5 vagy GM3S).
Gangliozid indukciós séma. Az emlős gangliozid szintézis útja (bal oldalon), az endogén Drosophila útvonal (8. közepén) és a transzgénikus Drosophila útvonal (ebben a tanulmányban jobbra). A kitöltött dobozok cukoradományozókat vagy SA-t jelölnek. A gerinceseknél az első gangliozid, a GM3 glükozilceramidból (GlcCer) képződik laktozilceramidon (LacCer) keresztül. Az endogén Drosophila útvonalban a GlcCert a mannosiltranszferáz Egghead és a GlcNAc transzferáz Brainiac módosítja. GM3 expressziót indukáltunk transzgenikus (Tg) konstrukciók és donor SA legyek táplálásával. Ezenkívül a CMP-SA szintézis útja részben konzerválódott Drosophila-ban (lásd az S2. Kiegészítő ábrát).
Teljes méretű kép
Mivel a GalT6/5 és SAT1 nem volt kimutatható a Drosophilában, létrehoztunk egy GM3 indukciós rendszert transzgénikus legyekkel, amelyek emberi GalT6-ot és SAT1-t hordoztak (1. ábra). Ezeket a transzgéneket a C155-Gal4 pánneuronális hajtóval expresszáltuk, és a teljes lipideket kivontuk a felnőtt repülő fejekből. Folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS) segítségével azonosítottunk hexóz-hexóz-Cer (Hex-Hex-Cer) jeleket GalT6-expresszáló legyekben, de nem GalT6-expresszáló legyekben (S1. Kiegészítő ábra). Mivel az endogén Man-Glc-Cer (MacCer) gyorsan metabolizálódó köztitermék, és a transzgénikus GalT6 felelős a LacCer bioszintéziséért, ezek a jelek a Gal-Glc-Cer (LacCer) termelésének tulajdoníthatók, ami arra utal, hogy az exogén GalT6 indukálja a LacCert Drosophilában. mint a fenti 8 (2a., c. ábra).
A LacCer és a GM3 LC-MS elemzése. A Drosophila fejekből kivont lipideket LC-MS MRM-rel elemeztük. Feltételeztük, hogy a LacCer és a GM3 összes ceramidszerkezete jelen volt egy korábbi tanulmány alapján, amely azt mutatta, hogy a Drosophila leggyakoribb ceramidfajai szfingozint tartalmaznak ( d14: 1 ) 17. A lárva CNS együtt expresszáló transzgének lipidjei ( a ) GalT6 és SAT1 vagy ( b ) GalT6, SAT1 és GNE. Lipidek a felnőtt legyek fejéből ( c ) együtt expresszálják a GalT6 és SAT1 transzgénjeit vagy d ) együtt expresszálják a GalT6 és SAT1 transzgénjeit, és táplálják a Neu5Ac-t.
Teljes méretű kép
A GM3 kísérleti indukálása legyekben
A SAT1-et gyümölcslegyekben is kifejeztük GalT6-tal; A GM3 azonban nem szintetizálódott ezekben a legyekben (2a., C. Ábra és 1. táblázat). Feltételeztük, hogy a rovarok SA-metabolizmusa eltérhet az emlősök metabolizmusától 9. Ennek az elképzelésnek az alátámasztására korábbi tanulmányok azt találták, hogy az SA donor citozin-5'-monofoszfát (CMP) -Neu5Ac nem volt kimutatható a gyümölcslegyekben, bár funkcionális szialiltranszferázt Drosophila 10, 11, 12, 13 publikáltak. Úgy véltük, hogy a CMP-Neu5Ac nem biztos, hogy elérhető a glikolipid módosításokhoz, és felvetettük, hogy ez az oka annak, hogy a gyümölcslegyekben a gangliozid termelés hiányos. A probléma megoldására genetikai és kémiai megközelítéseket alkalmaztunk.
Asztal teljes méretben
Az Aβ összeállítás gyorsulása in vivo GM3 által indukált legyekben
Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a GM3 erős affinitást mutat a holland Aβ típushoz, és a GM3 és a holland Aβ típus közötti kapcsolat felgyorsítja az Aβ 7,18 in vitro összeépülését. Ezen megállapítások megerősítésére GM3 indukciós rendszerünkkel olyan transzgén legyeket generáltunk, amelyek holland Aβ40 vagy Aβ42 típusú (a továbbiakban Dut40 vagy Dut42) hordoztak. Humán betegeknél és holland típusú mutánssal rendelkező transzgenikus egerekben az Aβ40 főleg az amiloid lerakódásokban található meg 19. Vad típusú Aβ42-et (WT42) használtunk kontrollként az Aβ-termelési útvonalra, mivel szórványos AD típusú és A típusú prekurzor fehérjék-transzgénikus egerekben domináns Aβ42-lerakódások voltak, a vad típusú Aβ-ban pedig szignifikánsan gyengébb affinitás mutatkozik, mint a Dut40-ben a GM3-hoz. 18. .
A transzgénikus GalT6, SAT1 és WT42 vagy Dut40 folyamatosan expresszálódtak a légy idegrendszerében, és a GM3 ezekben a legyekben a Neu5Ac etetésével indukálódott a fent leírtak szerint. A felnőtt uszonyok teljes kivonatait TBS-ben oldódó és oldhatatlan frakciókra osztottuk. A GM3 szintézis felgyorsította az agyukban a Dut40 összeépülését (3a. Ábra, c). Ezzel szemben a WT42 ilyen körülmények között nem gyorsította fel az összeszerelést (3b. Ábra, c). A Neu5Ac etetése csak a nem GalT6/SAT1-expresszáló legyeknél növelte a Dut40-gyülekezést (3d. Ábra), ami azt sugallja, hogy a Dut40 hajlamosabb a GM3 jelenlétében történő akkumulációra in vivo, és hogy a GM3 nem befolyásolja az Aβ-t ezen a szinten. Termelés.
Amellett, hogy részt vesznek az AD kialakulásának kóros folyamatában, a gangliozidok az emberek egyéb betegségeiben is szerepet játszanak, pl. 2-es típusú cukorbetegség, süketség, daganatinvázió és Parkinson-kór (PD) 22, 28, 29, 30. 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegeknél az emelkedett GM3-szint az inzulinreceptor inaktiválódását okozza a membrán mikrodoménjeinek megzavarása révén, ami inzulinrezisztenciához vezet 28. Ezzel szemben a GM3 elvesztése hallási diszfunkciót vált ki, mivel a cochleáris szőrsejtek megfelelő szerkezetének fenntartásához szükséges 22. Kimutatták, hogy a csökkent GM3 indukció összefügg a rosszindulatú transzformációval 29. Ezenkívül egy nemrégiben készült tanulmány arról számolt be, hogy a ganglioziddal végzett in vitro kezelés az α-Synuclein felgyorsult felhalmozódását eredményezte, amely a PD31 egyik fő okozó tényezője. Így a Drosophilában indukálható GM3 indukciós rendszerünk hozzájárulhat ezen emberi betegségek kialakulásának hátterében álló mechanizmusok megértéséhez.
mód
Légykészlet
A legyeket standard agar táptalajon tartottuk kukoricadarával és élesztővel 25 ° C-on, 12 órás világos/sötét ciklusban. Az elav-GAL4 c155 vonalat (C155-Gal4) a Bloomington Drosophila Stock Center-től (Indiana University) szereztük be. A w1118 törzs vad típusként szolgált. UAS-sec: Korábbi 32. vizsgálatunkban vad típusú ß 1-42 (UAS-WT42) keletkezett. UAS-GalT6, UAS-SAT1, UAS-GNE és UAS-sec: Ebben a vizsgálatban (alább ismertetve) Api- 40 E22Q (UAS-Dut40) generált.
A transzgének felépítése
Az Aβ transzgén felépítését korábban már leírták 32. Röviden, az Aβ szekvenciát HeLa sejt cDNS-ből PCR-rel amplifikáltuk, és a proenkefalin-A prekurzor szignálpeptidhez 33, 34 fuzionáltuk. A holland típusú Aβ mutációt (aláhúzva) PCR-amplifikációval (Pfu DNS-polimeráz, Promega) vezettük be a klónozással primerekkel együtt: 5 'GTGTTCTTTGCACAAGATGTGGGTTCAA 3' (előre) és 5 'TTGAACCCACATCTTGTGCAAAGAACACkkkk 3) ( '(újra) a pUAST 35 vektorba Bgl II helyekkel.
Az emberi GalT6, SAT1 és GNE kódoló szekvenciáit emberi agy cDNS-ből (Takara) amplifikáltuk, klónoztuk a pCR-Blunt II-TOPO vektorba (Life Technologies), majd egyedileg szubklónoztuk a pUAST vektor EcoR I helyeire. A következő primereket használtuk. GalT6 klónozás: 5 'ATGTCTGTGCTCAGGCGGAT 3' (előre) és 5 'CTTGCCACGACAGCCACTTC 3' (fordított); SAT1 klónozás: 5 'CATTAGTATGCGGACGAAGG 3' (előre) és 5 'GCTCTCAGAGTTAGAGTTGC 3' (fordított); GNE klónozás: 5 ′ CATGGAGAAGAATGGAAATAACCGA 3 ′ (előre) és 5 ′ CTAGTAGATCCTGCGTGTTG 3 ′ (fordított). Mindegyik transzgént sárga fehér embriókba injektáltuk, majd kereszteztük a w 1118 törzzsel .
GM3 indukció és tömegspektrometria
A felnőtt legyek ad libitum hozzáférést kaptak a szűrőpapírhoz, amelyet 10 mM N-acetil-neuraminsavban (Neu5Ac, Sigma) 150 mM szacharózban áztattak, minden második napon, egy héten keresztül. Megfigyeltük, hogy a Neu5Ac-t legyek fogják el, ételfesték hozzáadásával a Neu5Ac-oldathoz (az adatokat nem mutatjuk be). A lipidek extrahálását a fent leírtak szerint végeztük 36. 200-1000 lárvaagykorong-komplexet és felnőtt kifejlett fejeket távolítottunk el a legyekből, mindegyik szervcsoportot egyesítettük és TBS-ben (50 mM Tris-HCl, pH 7, 6, 150 mM NaCl) homogenizáltuk, majd a homogenizátumokat elpárologtatta. centrifugális koncentrátor (Tomy) segítségével. Az üledéket kloroform: metanol 2: 1 (v/v) elegyben szuszpendáljuk és 17 800 x g-vel 20 ° C-on 2 percig centrifugáljuk. A két oldószeres extraktumot egyesítettük és 42 ° C-on szárítottuk N2-gáz alatt.
Western blotok
köszönöm
Ezt a tanulmányt a Hosszú élettartamú Tudományok Kutatási Alapjai támogatták (a KY-nek 25-19., Az LT-nél a 28-46-os támogatási számok) támogatta a Japán Nemzeti Geriatrikai és Gerontológiai Központ.
Elektronikus kiegészítő anyag
További információ
Hozzászólások
Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.