túlzott

  • elemeket
  • absztrakt
  • célok:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Szubjektumok és emberi gastroduodenalis biopsziák
  • vadállat
  • Fizikum
  • Orális glükóz tolerancia tesztek
  • A vér biokémiai paraméterei
  • Szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatok
  • In vivo a leptin hatása szintek mRNS Tph1 a Pax4
  • Kvantitatív valós idejű PCR elemzés
  • Radioimmun teszt leptinre és inzulinra
  • Az 5HT bél LEPR-B KO egerek nyombél nyálkahártyájának tartalma ( IECLEPR-B KO)
  • Statisztikai analízis
  • az eredmény
  • A gyomor leptin fokozott expressziója elhízott egyéneknél
  • MRNA TPH1 a PAX4 elhízott személyek antrális biopsziáiban fokozódnak
  • A megemelkedett gyomor leptin megelőzi a plazma leptint (adipocita termelést) HFD-vel táplált egerekben
  • EC sejtek száma és szintje Pax4 Az mRNS-ek egerekben növekedtek az elhízás megjelenése előtt
  • Szintek mRNS Pax4 a leptinhiány csökkenése és növekedés az orális leptin beadása után
  • vita

elemeket

  • Sejtjelzés
  • Elhízottság
  • patogenezis

absztrakt

célok:

Az elhízás tekintetében, míg a hiperleptinémia erősen korrelál a zsírfelesleggel, a gyomor leptin állapota továbbra sem ismert. Itt megvizsgáltuk a leptin expresszióját elhízott emberek gyomorbiopsziáiban, és elemeztük a gyomor leptin expressziójának időbeli változásait az étrend okozta elhízás hatására és annak hatását az 5-hidroxi-triptamint (5HT) termelő sejtekre.

mód:

Az enterokromaffin (EC) sejteket és a leptin expressziót, a PAX4-et (kritikus tényező az EC specifikációhoz), a triptofán-hidroxiláz-1-et (TPH1, perifériás sebességet korlátozó enzim az 5HT-hoz) és az 5HT-t immunfluoreszcenciával, kvantitatív valós idejű PCR-rel, radioimmun-analízissel és gyomorbiopsziával vizsgáltuk. 19 elhízott és 14 normál testsúlyú egyének duodenuma és C57B16/J étrend okozta elhízott egerek, leptinhiányos elhízott egerek és leptin receptor B izoformhiányos egerek nyálkahártya-kaparásai, amelyek specifikus jellegűek.

az eredmények:

Bár az elhízott egyének és az elhízás állatmodelljeiben a hiperleptinémia korrelál a megnövekedett leptint termelő zsírtömeggel, a gyomor leptin állapotát még meg kell határozni. Ebben a tanulmányban először elhízott és nem elhízott egyének gyomorbiopsziás mintáiban vizsgáltuk a leptin expresszióját, majd elemeztük a gyomor leptin expressziójának időbeli változását egerekben magas zsírtartalmú étrend (HFD) során.

A központi idegrendszeren belül számos tanulmány arról számolt be, hogy a leptin-függő 5-hidroxi-triptamin (5HT; más néven szerotonin) étvágyszabályozás, 22, 23, 24, míg mások szerint a leptin nincs közvetlen hatással a központi idegrendszer 5HT neuronjaira idegsejtek: idegrendszer, hogy befolyásolja az étvágyat., 25, 26, 27

Mivel a test 5HT-jának nagy részét (95%) egy enterochromaffin (EC) sejt termeli a bélben (főleg az antrumban és a duodenumban), és mivel a bélből származó 5HT nem lépi át a vér-agy gátat, ezért azt javasolták hogy 28 meghatározza, hogy létezhet-e gyomor leptin útvonal - 5HT. Ennek érdekében az elhízás kialakulása során megvizsgáltuk az antrális nyálkahártya EC-sejtjeinek számát, valamint az 5HT, 29 és Pax4 mRNS termelésének perifériás sebességét korlátozó enzim, a triptofán-hidroxiláz-1 (TPH1) expresszióját. átírás. faktor az EC sejt specifikációhoz. 30

Anyagok és metódusok

Szubjektumok és emberi gastroduodenalis biopsziák

A kevés rendelkezésre álló, nem elhízott egyének miatt biopsziát nyertek olyan normál testsúlyú személyektől, akik endoszkópián estek át a diagnózis érdekében. Ezek az alanyok írásos beleegyező nyilatkozatot adtak a felső endoszkópiához, és mindegyikük normál endoszkópiát és normál gyomornyálkahártyát igazolt rutinszerű szövettani elemzéssel. Az endoszkópos vizsgálat során biopsziás mintákat vettünk a gyomor fundusából és antrumából, valamint a duodenumból. Néhányat a klasszikus szövettani vizsgálatra használtak fel, másokat azonnal nitrogénfolyadékban lefagyasztottak, és -80 ° C-on tárolták, amíg a teljes RNS és fehérjék kivonására nem használták.

A C57BL/6J egereket, ob/ob 6-8 hetes korban (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Franciaország), egyedi ketrecekben állati ketrecekben (12:12 világos/sötét, 21 ° C) helyeztük el szabadon vízhez való hozzáférés. Normál étrendet (normál étrend (ND), 2900 kalória g -1) tápláltak, amelyek 3% zsírt, 48% komplex szénhidrát primer keményítőt és 16% fehérjét vagy HFD-t (4400 kalória g -1) tartalmaztak 45% zsírt, 35% szénhidrátok és 20% fehérje (C1090-45, Genestil, Altromin Royaucourt, Franciaország). Mérték az ételfogyasztást és a testtömeget hetente kétszer, 12 héten keresztül.

Fizikum

A zsírmentes tömeget és a sovány tömeget (amely a vizet és a fehérjéket képviseli) kettős röntgenabszorpciós energiával határoztuk meg Piximus készülék (GE Lunar Prodigy Corporation) segítségével, a fentiek szerint. 31 egeret vizsgáltak az étrendi beavatkozás kezdetétől számított 1 és 12 hét elteltével és után.

Orális glükóz tolerancia tesztek

Az egereket 16 órán át éheztettük 2 g glükóz/testtömeg-kg orális dózisban. A farok vérmintáit glükométerrel (Accu-Chek; Roche Diagnostics, Meylan, Franciaország) értékeltük a glükózterhelés előtt és 15, 30, 60 és 120 perccel azután, és kiszámoltuk a görbe alatti területeket (AUC 0-120 perc). .

A vér biokémiai paraméterei

A diéta után 12 héttel az egereket altattuk; vért gyűjtöttünk glükóz, triglicerid, teljes és nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin, alanin aminotranszferáz és aszpartát aminotranszferáz szintekre. Ezeket a paramétereket AU400 automatizált analizátorral (Olympus Diagnostics, Rungis, Franciaország) mértük. Az egerek plazma leptin és inzulin szintjét a Linco Research Inc. radioimmun assay kitjeivel határoztuk meg. (Labodia, Franciaország). Feláldozás után a gyomrot és a nyombélet eltávolítottuk, és két részre osztottuk: az egyiket a nyálkahártya metszetekre, a másikat szövettani, immunhisztokémiai és immunfluoreszcencia elemzésre.

Szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatok

Röviden: a paraffinba ágyazott 10% semleges formalin-fixált bazális biopsziákat, az egér gyomor és a nyombél szöveteit 5 μm-re osztottuk, és a szokásos szövettani és immunreaktív festéshez használtuk, az előzőekben leírtak szerint. A viaszmentesítés és a hidratálás után a metszeteket szobahőmérsékleten 10 percig 3% H 2 O 2 -val előkezeltük, és az antitesteket egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban. Az immunfluoreszcencia vizsgálatokhoz soros metszeteket inkubáltunk nyúl 5HT antitesttel (szerotonin), 1: 10 000 hígítással (Immunostar, Hudson WI, USA) és kecske nyúlellenes szekunder antitestekkel, Alexa 488 Fluor IgG (Molecular Probes; Invitrogen, Saint Aubin, Franciaország). Az 5HT-pozitív sejtek számát úgy határoztuk meg, hogy Calopix képelemző szoftverrel (TRIBVN, Chatillon, Franciaország) legalább 5 jól orientált antrális mirigyben (20x) számoltunk állatonként (négy állat/csoport). Az eredményeket a mirigyenkénti hámsejtek számaként fejezzük ki.

A leptin in vivo hatása a Tph1 és Pax4 mRNS szintekre

Tizennyolc órás éhgyomri egereknek foszfáttal pufferolt sóoldatot (kontroll) vagy 0,2 μg egér leptint adtak testtömeg-g-onként, 7 napig. A 8. napon altattuk őket, a vért összegyűjtöttük, centrifugáltuk és a plazmát -20 ° C-on tároltuk. Az egereket feláldoztuk, a gyomrot és a nyombélet kinyitottuk, kétszer öblítettük foszfáttal pufferolt sóoldatban, és a nyálkahártyát feldarabolták és folyadékban azonnal lefagyasztották. nitrogént és -80 ° C-on tároljuk, amíg a teljes RNS kivonására nem használjuk fel valós idejű kvantitatív PCR-analízishez.,

Kvantitatív valós idejű PCR elemzés

A teljes RNS-t biopsziákból és a gyomor, a nyombél nyálkahártyájából extraháltuk Trizol reagenssel (Invitrogen, Saint Aubin, Franciaország). A valós idejű kvantitatív PCR-t Light Cycler System 480-on (Roche Diagnostics) hajtottuk végre, a 32. leírás szerint, specifikus primerek alkalmazásával: egér Tph1 (NM_001276372.1), egér Pax4 (NM_001159925.1) esetében; humán PAX4 (NM_006193.2) és humán TPH1 (NM_004179.2), mindegyiket az Eurogentec szintetizálja (Angers, Franciaország). Az adatokat a korábban leírtak szerint elemeztük. 32

Radioimmun teszt leptinre és inzulinra

Homogenizátumokat készítettünk fagyasztott bázikus biopsziákból Krebs-Ringer-HEPES-ben (1 mg ml -1), amelyek proteázgátlókat (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) tartalmaznak, teflonüveg homogenizátorral. A homogenizátumokat 10 000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A leptint szöveti homogenátumokban és plazmában határoztuk meg a Linco Research Inc. humán leptin radioimmunassay kit segítségével. A plazma inzulint mennyiségileg meghatároztuk egér inzulin radioimmun assay kit alkalmazásával. 33

Az 5HT bél LEPR-B KO egerek nyombél nyálkahártyájának tartalma (IEC LEPR-B KO)

A 6–8 hetes vad típusú és IEC LEPR-B KO egereket 12:12: sötét fény ciklusban helyezték el, és ad libitum táplálékkal és vízzel látták el. Az egyik napról a másikra éheztetett egereket feláldoztuk, és laparotomia után a nyombélet gyorsan eltávolítottuk, hideg vízzel leöblítettük, és a nyálkahártyát folyékony nitrogénben történő fagyasztás után azonnal eldobtuk, és felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. pufferolt sóoldat jeges üveg homogenizátor alkalmazásával. A homogenizátumokat 5000 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszókat összegyűjtöttük és az 5HT meghatározásához felhasználtuk az 5HT enzim immunoassay kit segítségével (Abnova Corporation, Tajvan).

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± sem értékben fejezzük ki. Az összehasonlítás típusától függően a nem paraméteres Mann-Whitney-tesztet vagy a Tukey-Kramer-rel végzett egyirányú varianciaanalízist többszörös összehasonlító utóvizsgálatokon hajtották végre a GraphPad Prism 5.00 for Windows verziójával, (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA) ). 34 elhízott páciens P20 értékét, szignifikánsan megnövekedett plazma leptinnel (1c. Ábra) és az összes ghrelint alkalmaztuk a statisztikai szignifikancia határértékeként, míg a keringő PYY szintek szignifikánsan csökkentek a sovány egyedekhez képest. (az adatok nem láthatók). Elhízott egyéneknél a LEP mRNS fundális nyálkahártya-szintje ötször megemelkedett, a leptin fehérje szintje pedig kétszer magasabb volt (P

A gyomor leptinje nőtt az elhízott, szemben a szegény egyénekkel. A teljes RNS-t vagy fehérjéket extrahálták elhízott bariatrikus sebészjelöltek és szegény egyének alapvető biopsziáiból, és ezeket használták a leptin mRNS szintjének meghatározásához ( a ) és fehérje ( b ). Az adipociták által termelt leptin szintjét ugyanazon személyek vérében tesztelték ( c ). TPH1 mRNS szintek ( d ) és PAX4 ( e ) elhízott és szegény egyének antrális biopsziáiban. Az eredményeket varianciaadatokként mutatjuk be, az átlagot, P-t nem-parametrikus Mann-Whitney teszttel határoztuk meg.

Teljes méretű kép

Az elhízott egyének antrális biopsziáiban megemelkedik az MRNA TPH1 és PAX4

Az elhízott egyének antrális biopsziáiból származó TPH1 mRNS-szintek (1d. Ábra) kétszer olyan magasak voltak (1, 75–2, 73, 95% konfidencia intervallum (CI)), mint (0,38–0,67, 95% CI);

A normál étrenddel (ND) és a magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplált egerek jellemzői. Kalóriabevitel ( a ), súlygyarapodás b ), plazma glükóz ( c ), trigliceridek, d ) koleszterin ( e ) és a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterinszint ( f ) ND-vel vagy HFD-vel táplált egerekben értékeltük 3 hónapig. Az adatokat átlag ± sem értékként vagy mezőként és bajuszként fejezzük ki. A P értéket kétirányú varianciaanalízissel határoztuk meg, hogy összehasonlítsuk a kapott tömeg időbeli lefutását és a többi adat Mann-Whitney tesztjét. NS, jelentéktelen.

Teljes méretű kép

A vér inzulin és a gyomor leptin szintjének korai és egyidejű növekedése az elhízás megjelenése előtt. Plazma inzulin ( a ), gyomor leptin ( b ), testzsír ( c ) és az adipociták által termelt plazma leptin ( d ) meghatároztuk ND-vel vagy HFD-vel táplált egerekben 7, 14, 28 és 92 napig. Az adatokat átlag ± sem, statisztikai szignifikancia * P 20 értékkel fejezzük ki

Az EC sejtszám és a Pax4 mRNS szint növekedett az egerekben az elhízás megjelenése előtt

Annak megvizsgálására, hogy a gyomor és a duodenum 5HT-tartalma ugyanolyan korai növekedést követ-e a HFD alatt, mint a gyomor leptin-tartalma, immunfluoreszcencia vizsgálatokat végeztünk 5HT-val antralis és duodenalis szakaszokon 1 hetes ND és HFD táplált egerekből. Amint a 4. ábra mutatja, az 5HT-pozitív sejtek száma magasabb volt a HFD antrumában és a duodenumban, mint az ND-vel táplált egerek sejtjeiben. Továbbá az EC-sejtek megnövekedett száma (4b. Ábra) az antralban megnövekedett Pax4 mRNS-szinttel társult (1,5-szeres; P

Az EC-sejtek száma és a Pax4 mRNS-szint 7 napig nőtt a HFD-vel táplált egerek antrumában. ( a ) Az 5HT-pozitív sejtek (EC-sejtek) reprezentatív fotográfiái az ND-vel (bal oldali panel) és a HFD (jobb oldali panel) táplált egerek antrumában 7 napig. b ) ES sejtek mennyiségi meghatározása, mirigyenként ES sejtek számában kifejezve. ( c ) Pax4 mRNS szint az ND-vel és HFD-vel táplált egerek antrális és duodenális nyálkahártyájában 7 napig. Az eredmények átlag ± sem, n = 4 egér volt minden csoportban, és a csoportokat összehasonlítottuk nemparametrikus Mann-Whitney teszttel.

Teljes méretű kép

A Pax4 mRNS szintje csökken a leptinhiányban és emelkedik az orális leptin beadása után

Annak eldöntésére, hogy a Pax4 szint változásai részben kapcsolódhatnak-e a leptin változásokhoz, elemeztük a Pax4 mRNS szintjét a leptinhiányos ob/ob egerek antrális és duodenális nyálkahártyájában. Az ob/ob egerek szignifikáns csökkenést mutattak a Pax4 mRNS-ben (50%, P

Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy a gyomor leptin korai HFD-indukálta túlzott expressziója mind az elülső, mind a nyombél nyálkahártyáján megnövekedett számú 5HT-tartalmú EC-sejtet kísér. Ezek az adatok megegyeznek azokkal az eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy a nyugati étrenddel táplált egerek megnövelték az 5HT hozzáférhetőségét a vékonybélben. A GI-rendszeren belül az 5HT többnyire EC hámsejtekben termelődik, és az enterális idegrendszer idegsejtjeiben is előfordul. A periférián termelt 5HT nem jut be az agyba 29, ami korlátozza biológiai hatásait az agyon kívül, bár egyes hipotalamusz neuronok hozzáférhetők lehetnek. Az agyban bár az 5HT szerepet játszik a leptin energia homeosztázis szabályozására gyakorolt ​​hatásának közvetítésében, az 5HT közvetíti, de alaposan tanulmányozták, de hatása még mindig ellentmondásos. 24., 26. Ezt a kérdést még soha nem oldották meg a gyomor-bél traktusban, ahol mind a leptint, mind az 5HT-t előállítják. Az 5HT újrafelvétel (SERT) hiányában szenvedő egereknél, amelyek hiperleptinémiát mutatnak, és jelentősen megnövekednek az agyi 5HT 43-ban, beszámoltak arról, hogy csökkent táplálékfelvétel ellenére glükóz-intolerancia, inzulinrezisztencia és elhízás alakul ki. 44.

Ebben a jelentésben azt találtuk, hogy elhízott egyéneknél a perifériás sebességet korlátozó 5HT enzim, TPH1 és a PAX4 transzkripciós faktor megnövekszik. A Pax4 kritikus az EC-sejtek specifikációja szempontjából, mivel ezek a sejtek teljesen hiányoznak Pax4-hiányos egerekben. 30 Úgy gondoljuk, hogy a leptin útja szerepet játszik az EC sejtvonal specifikációjában, mert (i) az elhízott db/db egerek vékonybélében csökken az EC sejtek száma, hiányosak a leptin receptorok, 45 (ii) hiányos egerek a LEPR-B-ben a bél hámsejtjeiben a jelátvitel 5HT-tartalma csökken, és (iii) az egerek orális kezelése leptinnel (utánozva a gyomor leptint) növeli a Pax4-t az antrumban és a duodenumban. Az embrionális neuroepithelialis sejtekben már felvetették a leptin szerepét a sejtek differenciálódásának szabályozásában, mert fenntartja az idegi progenitorokat, és elősegíti a glia és a neuron fejlődését az embriókban. 46 Ezenkívül kimutatták, hogy a leptin indukálja a neurogenin-1, -2 és a NeuroD1/BETA 2, három bHLH transzkripciós faktor expresszióját, amelyek szintén szerepet játszanak az enteroendokrin sejtek specifikációjában.

Most kiderül, hogy az 5HT felszabadulása az EC sejtek által a luminalis tápanyagok hatására fontos szerepet játszik a bélgyulladás kialakulásában. 47, 48, 49 Azt is felismerték, hogy az elhízás alacsony fokú krónikus gyulladással jár. Nemrégiben felvetették, hogy a bélgyulladás a HFD korai következménye lehet, ami hozzájárul az elhízáshoz és az ezzel járó inzulinrezisztenciához. Bár az elhízással járó korai bélgyulladás hátterében álló mechanizmusok nincsenek teljesen meghatározva, egyértelműen a bél mikrobiotikumait tartalmazzák. A leptin szignalizációt követően a bél 5HT szintjének korai növekedése, amelyet a HFD során észleltek, szintén szerepet játszhat a bélgyulladás és elhízás kiváltásában; ezt azonban még világosan be kell mutatni.

Röviden: ez az első bizonyíték arra, hogy az elhízott egyéneknél a gyomor-leptin szabályozása fel van javítva, és hogy a túlzott expresszió az elhízás megjelenése előtt, a zsírtömeg-bővülés előtt és az egerekben az adipociták által termelt leptin növekedésében következett be. Az adatokból azt sugalljuk, hogy a gyomor leptin HFD által kiváltott elhízás során történő felpörgetése mechanizmust jelenthet a bélhámsejtek magas kalóriabevitelhez való alkalmazkodásához, amely hozzájárulhat a zsírbővítéshez és az elhízáshoz. A "leptin-5HT" eredetű bélrendszer megléte ronthatja ennek a magas kalóriatartalmú étrendnek a hatását.