absztrakt
Az aktivin receptor II típusú (ACTRII) gén a mikroszatellit instabil (MSI-H) kolorektális karcinómák 58,1% -ában mutálódik, és közeli rokona a II. Típusú TGFβ-1 receptornak, amelyről ismert, hogy részt vesz az MSI-H-ban és nem - MSI-H kolorektális karcinogenezis. Ezért arra kerestük a választ, hogy az ACTRII részt vett-e nem MSI-H vastagbélrákban. Értékeltük az ACTRII inaktiválását allél delécióval, az mRNS expressziójának elvesztésével vagy szomatikus mutációval 51 nem MSI-H vastagbél karcinómában. A heterozigozitás (LOH) elvesztését az ACTRII lókuszon (2q23,1) 9 (17,6%) 51 primer tumorban találták. Az ACTRII mRNS expressziójának elvesztését figyelték meg hét LOH-pozitív primer daganat egyikében (14,3%), amelyből teljes RNS állt rendelkezésre. LOH-t mutató tumorok DNS-szekvencia-elemzését is elvégeztük. Az egyik elsődleges LOH-pozitív tumor olyan csíravonal-szekvencia-változást mutatott (aminosav-szubsztitúció, 117 Ile-tól Phe-ig), amelyet 23 normális egyénnél nem észleltek, ami azt jelzi, hogy ez a változás nem gyakori polimorfizmus. Megállapítottuk, hogy az ACTRII valószínűleg részt vesz a nem MSI-H és MSI-H kolorektális karcinogenezisében, de gyakrabban a második alcsoportban.
A fő
A vastagbélrák a rákhoz kapcsolódó halálozások második vezető oka az Egyesült Államokban, és a harmadik leggyakoribb rák mindkét nemben, 135 400 új esettel és 56 700 halálozással 2001-ben (American Cancer Society, 2001). Ezért elengedhetetlen az ilyen típusú rák alapjául szolgáló molekuláris utak felfedezése és jobb megértése, ideértve az új tumorszuppresszor gének azonosítását, valamint az inaktiválásukban részt vevő mechanizmusokat.
A II. Típusú aktivin receptor gént (ACTRII) a genom egészére kiterjedő mutációk mutációs szkrínelésével azonosították, mivel egy új jelölt tumorszuppresszor gén nagyon gyakran mutálódott (az MSI-H vastagbél-karcinómák 58,1% -ában, azaz magas mikroszatellit instabilitású daganatokban) a ( A) 8 mononukleotid megismétlődik a kódoló régiójában (Mori és mtsai, 2001). Az ACTRII a transzformáló növekedési faktor β (TGF-β) receptorcsalád tagja és társul az aktivin-SMAD jelátviteli útvonallal, amely viszont szerepet játszik a differenciálódás, a növekedés szuppressziójának és az apoptózis kiváltásában különféle sejttípusokban, beleértve azokat is, amelyek származékai bélhámból származik. (Attisano és mtsai, 1996; Sonoyama és mtsai, 2000). Az ACTRII jelátviteli útba való beavatkozás gátolja a sejtek differenciálódását in vitro (Li et al., 1998; Liu et al., 2000) és az apoptózist (Chen et al., 2000; Choi et al., 2001). A TGF-β-SMAD jelátviteli út, amely megosztja az alulról érkező SMAD2 és SMAD4 effektort az aktivin-SMAD útvonallal, felelős az emberi tumor szuppressziójáért (Attisano és mtsai, 1996; Liu és mtsai, 2000; Sonoyama és mtsai, 2000; Su és munkatársai, 2001). Az ACTRII a heterodimer receptorok aktív komplexét képezi az ACTRI-vel (Attisano és mtsai, 1993). Érdekes módon az ACTRI szomatikus mutációt nemrégiben írták le a hasnyálmirigyrákban (Su és mtsai, 2001).
Annak megállapítására, hogy az ACTRII részt vett-e az összes kolorektális daganatban, és nem azokban, amelyekben gyakori a mikroszatellit instabilitása, az ACTRII inaktiválását vizsgáltuk nem MSI-H daganatokban. A heterozigozitás (LOH) 2q22.1-q23.3 vizsgálatok, az ACTRII géntartalmú régió, részletes elvesztését végeztük 51 nem MSI-H kolorektális daganatban. A LOH-pozitív daganatokat tovább teszteltük az ACTRII szomatikus pontmutációira .
az eredmény
Az allelotipizálás azt mutatta, hogy 17 (33%) 51 kolorektális daganat mutatott LOH-t a 2q23.1 kromoszóma négy vagy több helyének egy vagy többjén. Ezeket az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze. A Locus D2S141 mutatta a legnagyobb LOH arányt (27 informatív esetből 12 vagy 44,4%). Az 51 daganat közül kilenc (17,6%) LOH volt az ACTRII lokusz mellett: ezek között 7 adenokarcinoma és 2 adenoma volt, amelyek közül az egyik magas fokú fokális dysplasia volt.
Asztal teljes méretben
A kvantitatív RT-PCR azt mutatta, hogy az egyik tumornál teljesen hiányzott az ACTRII mRNS expressziója (1. ábra). Ezt a megállapítást több ismételt teszt is megerősítette. A maradék hat tumor DNS-szekvenálása, amelyből RNS volt elérhető, feltárta, hogy egyetlen nukleotidváltozást (TTT ATT-re, aminosav-szubsztitúció Ile-Phe-re) tartalmazott a 117. kodonban az ACTRII extracelluláris doménjében. Ez a szekvenciaváltozás a megfelelő normál mintában is megjelent (2. ábra). Ezenkívül a 6 primer tumorminta 3-ban (50%) csendes polimorfizmust detektáltak a 118 kodonban (CCG-CCA); Megállapították, hogy ezt a polimorfizmust korábban leírták (D'Abronzo et al., 1999). Ezt a polimorfizmust az öt (62,5%) nyolc kolorektális rákos sejtvonalban is megfigyeltük (D'Abronzo et al, 1999). Végül e nyolc sejtvonal közül egy bázis delécióját detektáltuk az (A) 8 ismétlésben a 437. kodonban az SW48 sejtekben, amelyekről ismert, hogy MSI-H (Branch és mtsai, 1995).
ACTRII gén expresszió LOH tumorokban. A heterozigozitás (LOH) + minták veszteségének RT-PCR elemzése. Ez a kép hét LOH-pozitív tumor RT-PCR termékének gélképét mutatja. A β-aktin RT-PCR eredményeit belső kontrollként mutatjuk be. Az RT-PCR-t az Invitrogen/Life Technologies protokoll szerint hajtottuk végre. A PCR körülményeket korábban leírták (Mori és mtsai, 2001). Az ACTRII gén felső, 1100 bp méretű fragmense; dna, a β-aktin gén 436 bp-os RT-PCR terméke. A 6. sáv az ACTRII gén mRNS expressziójának teljes hiányát jelenti .
Teljes méretű kép
A csíkszekvencia változása az ACTRII-ben. Nukleotidváltozás a 117. kodonban. A nukleotid a normál T-ről (balra) A-ra (jobbra) változik a 117. kodonban, aminek következtében az aminosav Ile-ről Phe-re változik a receptor extracelluláris doménjében. Az ábrák az érzékelési szekvenciát mutatják, és a 117-es kodont mindkét panelen feltüntetjük. A nyíl a mutált nukleotidot jelöli.
Teljes méretű kép
vita
Az ACTRII gyakran mutálódik az MSI-H vastagbélrákokban (Mori és mtsai, 2001). Ezenkívül ismert, hogy az aktivin szerepet játszik a bélsejtek növekedésében és differenciálódásában (Attisano és mtsai., 1996; Sonoyama és mtsai., 2000). Végül erős szerkezeti és funkcionális hasonlóságok vannak az aktivin és a TGF-β receptorok között (Attisano és mtsai., 1993), amelyekről ismert, hogy mind az MSI-H, mind a nem MSI-H kolorektális tumorgenezisben szerepet játszanak (Calin et al. al. al., 2000; Grady és mtsai, 1998, 1999; Orimo és mtsai, 1998). Ezen okok miatt tanulmányoztuk az ACTRII gén szomatikus változásait kolorektális rákokban MSI-H nélkül. Az allél deléció előfordulása 2q23.1-nél két adenomában (az egyik fokális diszpláziában), valamint hét adenokarcinómában arra utal, hogy a LOH ezen a lokuszon a colorectalis neoplasia kezdetekor fordulhat elő.
Annak értékelésére, hogy egy ACTRII allél deléciója társult-e a fennmaradó allél inaktiválásával, elvégeztük a teljes ACTRII kódoló régió DNS szekvenálását hét LOH-pozitív primer daganatban, amelyekből RNS volt elérhető, valamint nyolc vastagbél-rákos sejtben. vonalak. Ez a mutációs elemzés a nyolcadik sejtvonal közül ötben a 118-as kodonnál tapasztalható csendes polimorfizmus mellett a hat sejtből három és az ACTRII-t expresszáló hat daganat közül három volt az egyetlen, a daganatban és a megfelelő normál mintákban a 117-es kodonnál az egyetlen új változás.
Nevezetesen, az egyik elsődleges tumorban talált 117-es kodonváltozást (I117F) korábban nem írták le. Annak eldöntésére, hogy az I117F csíravonal mutációt vagy polimorfizmust képvisel-e, 23 másik személy normális genomi DNS-ét szekvenáltuk, az ACTRII gén második exonjára összpontosítva (amely tartalmazza a 117. kodont). Ezeknek a személyeknek egyikén sem volt ilyen változás, ami arra utal, hogy az I117F nem általános polimorfizmus az általános populációban.
Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az ACTRII 117 kodon részvételét az emberi tumorgenezisben általában, irodalmi kutatást végeztünk. Az ACTRII extracelluláris doménjében lévő három aminosav, a 42F, 60W és a 83F ismert, hogy részt vesz az ACTRII-hez kötődő aktivinban és inhibitorban: ezeknek a maradékoknak a teljes hosszúságú receptorban lévő mutációi megzavarják az aktivin és az inhibin kötődését (Gray és mtsai., 2000).
Az ACTRII mRNS expressziójának teljes hiányát a hét LOH pozitív primer nem MSI-H daganat egyikében, de a nyolc colorectalis rákos sejtvonal egyikében sem találtuk. Lehetséges, hogy a promóter hipermetilezése okozta ezt az expresszió hiányát; az ACTRII promóter régióját azonban nem sikerült azonosítani a nyilvános DNS-szekvencia adatbázisokban, és az upstream CpG-szigeteket sem találtuk az ACTRII genomi lokuszban. Végül a 437 kodonnál mutációt figyeltek meg, amely a megjósolt csonka fehérjéhez vezetett, az SW48-ban, az egyetlen vizsgált colorectalis carcinoma sejtvonalban, az MSI-H-ban.
Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ACTRII gén genetikai változásai (azaz missense mutáció, az mRNS és LOH expresszió teljes elvesztése) nem MSI-H vastagbélrákokban fordulnak elő, de alacsonyabb gyakorisággal, mint az MSI-H rákokban. Tehát olyan események, amelyekről úgy gondolják, hogy az ACTRII inaktiválódásához vezetnek, mind az MSI-H, mind a nem MSI-H kolorektális daganatokban előfordulnak, ami tovább alátámasztja az ACTRII jelölését kolorektális tumor szuppresszor génként.
Anyagok és metódusok
A szövet előkészítése, a DNS és az RNS kivonása
Ötvenegy nem MSI-H kolorektális karcinómát kaptunk, amelyek MSI-ket mutatnak az öt konszenzus hely (BAT 25, BAT 26, D2S123, D5S346 és D17S250) közül legfeljebb egynél, a megfelelő normál kontrollszövetekkel. Az összes mintát a műtét vagy az endoszkópia idején vettük, és azonnal fagyasztottuk folyékony nitrogénben. A fagyasztott szövetmintákból DNS-t és RNS-t nyertünk a DNeasy Tissue Kit és a Qiagen (Valencia, Kalifornia) RNeasy Mini Kit segítségével a gyártó protokollja szerint.
Eloszláselemzés
Négy mikroszatellit markert használtunk a 17 Mb-os régióban a 2q22.1-q23.3-on, beleértve az ACTRII gént (2q23.1) is az LOH-vizsgálathoz: D2S127, D2S151, D2S2299 és D2S141 (2. táblázat). Az ACTRII gén a D2S151 és a D2S2299 között helyezkedik el. A PCR-reakciókat 10 μl össztérfogatban hajtottuk végre, amely 20 ng genomi DNS-t, 0,5 μm minden primert, 1 x Taq polimeráz puffert (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), 0,1 mm dNTP-t, 1,5 mm MgCl és 0, 1 NE Taq DNS-polimeráz (Life Technologies). A PCR körülményeket korábban leírták (Mori és mtsai, 2001). Minden egyes PCR-termékből tíz mikrolitert analizáltunk egy automatizált DNS-szekvenszeren (MegaBace 1000; Amersham LifeSciences/Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) a Genetic Profiler szoftver 1.0-s verziójával (Amersham Life Sciences/Molecular Dynamics). A tumor-specifikus változást LOH-ként osztályoztuk, amikor az a tumor allél csúcsmagasságának több mint 50% -ának változását eredményezte a megfelelő normál értékhez képest.
Asztal teljes méretben
Mutációs elemzések
RT-PCR expressziós szintek és cDNS szekvenálás céljából.
RNS hét LOH-pozitív tumorból, valamint nyolc vastagbélrákos sejtvonalból állt rendelkezésre (SW480, SW48, Colo320HSR, WiDr, SW620, SW948, Colo201 és Colo32DM). A reverz transzkripcióhoz 10 μg teljes mRNS-t használtunk 20 μl teljes reakciótérfogatban, amely 0,5 μg Oligo dT-t (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,1 mm dNTP keveréket (Invitrogen), 4 μl 5x első szálú puffert (ugyanott), 2 μl 0,1 m ditiotreitol (Invitrogen) és 1 μl rekombináns RNáz OUT 40 U/μl inhibitor ribonukleáz (Invitrogen). A PCR-protokollt 20 μl össztérfogatban hajtottuk végre, amely 1,75 μl primert (Invitrogen), 0,1 mm dA/T/C/GTP-t, 0,1 μl DNS-polimerázt Taq (Qiagen) és 10x Taq polimeráz puffert (Qiagen) tartalmazott. az alelotípus-elemzésben leírt feltételek mellett. A β-aktin gén belső RT-PCR kontrollja ugyanabból a protokollból állt, az 5-ös primerekkel Index-IndexTerm IndexTerm CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3 ′ és 5′-IndexTerm IndexTerm CTG TGG TGG TGA AGC TGT AG-3 ”. A PCR-termék elektroforézisét 1,5% -os agarózgélen hajtottuk végre. A szekvenciaelemzést RT-PCR-rel nyert cDNS szenzus és antiszensz szálain egyaránt elvégeztük.
CDNA szekvencia elemzés.
A szekvenciális reakciókat DYEnamic ET terminátor készlet (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó protokollja szerint. Az elektroforézist MegaBace 1000 eszközön (Molecular Dynamics) végeztük, és a Sequence Analyzer szoftver 2.0-s verziójával (Amersham Pharmacia Biotech) elemeztük. A tumorokból vagy sejtvonalakból származó DNS-szekvenciákat összehasonlítottuk a vad típusú ACTRII-szekvenciával, amelyet az Országos Biotechnológiai Információs Központ (NCBI) adatbázisából szereztünk (www.ncbi.nlm.nih.gov). 24 kolorektális rák genom DNS-ét szekvenáltuk az ACTRII gén második exonján a fent leírt protokoll szerint, az 5'-IndexTerm IndexTerm TTC TCT GCT TAT TTA TAG GAC TG-3 'és 5'-IndexTermTTTTTTTTTT TCC AAT CTA CAG primerek felhasználásával TTG AGC -3 ′.
köszönöm
Ezt a munkát részben támogatták a DK47717, CA95323, CA85069, CA63670 és CA77057 támogatások.