elemeket

absztrakt

A kappa-glutation-transzferáz (GSTK1-1), más néven Dulfide Bond-szerű oxidoreduktáz fehérje (DsbA-L), részt vesz az adiponektin transzláció utáni multimerizációjában, és negatívan korrelált az egerek és emberek elhízásával. Megvizsgáltuk az adiponektint Gstk1 -/- egerekben, és meglepő módon nem találtunk különbséget a teljes szérum adiponektin szintben vagy a nagy molekulatömegű (HMW) multimer szintekben a normál kontrollokhoz képest. A nem redukáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézis és a Western-blot-vizsgálat szintén alacsony, közepes és HMW multimerek hasonló eloszlását mutatta normál és Gstkl -/- egerekben. Az adiponektin változása korrelált a glükóz toleranciával és a foszforilezett AMP-kináz szintjével, de hasonló glükóz toleranciát és hasonló foszfo-5-AMP aktivált protein kináz szintet találtunk normál és Gstkl -/- egerekben. Következésképpen eredményeink azt sugallják, hogy a GSTK1-1 nem feltétlenül szükséges az adiponectin in vivo multimerizációjához, és a GSTK1-1 hiányában alternatív útvonalak aktiválódhatnak.

kappa-hiány

Az adiponektin egy olyan adipokin, amelyet elsősorban a fehér zsírszövet választ ki, és különféle szerepet játszik a glükóz és a zsírsav anyagcseréjének szabályozásában a zsírsav oxidációjának kiváltásával, a máj glükoneogenezisének elnyomásával, valamint a máj és az izom inzulinérzékenységének növelésével. A keringő adiponektin alacsony szintje az elhízáshoz és az inzulinrezisztenciához társul, a 2, 3 és a magas szint korrelál az elhízással kapcsolatos patológiák, köztük a 2-es típusú cukorbetegség és a metabolikus szindróma, a magas vérnyomás 4, az érelmeszesedés 6 és az alkoholmentes zsírmáj betegség elleni védelemmel. Az adiponektin a három fő diszulfidhoz kapcsolt oligomer formában kering a vérben; kis molekulatömegű trimer, közepes molekulatömegű hexamer és nagy molekulatömegű 12-18 multimerek. Jelentős bizonyíték van arra, hogy a különböző oligomerek eltérő biológiai funkcióval rendelkeznek. 1, 8

Egy nemrégiben végzett 3T3-L1 vizsgálatban 9 sejt arról számolt be, hogy az adiponektin oligomerizációt elősegítette a glutation-transzferáz (GSTK1-1) kappa, és hogy a GSTK1-1 knockdown jelentősen csökkentette a szekretált HMW adiponectin szintjét a 3T3-L1 adipocytákban. A GSTK1-1 számos szövetben expresszálódik, beleértve a fehér zsírszövetet, amely az adiponektin fő forrása in vivo. A 9., 10., 11. A GSTK1-1 expresszió szintén negatívan korrelál az egerek és emberek elhízásával, ezért új célként javasolták az inzulinrezisztencia és a kapcsolódó anyagcserezavarok kezelésére szolgáló gyógyszerek kifejlesztését. 9.

Noha a GSTK1-1 glutation-transzferáz aktivitással rendelkezik citozolos GST-ként, a mitokondriumokban és a 12 peroxiszómákban lokalizálódik, szerkezete jelentősen eltér a citoszolos és mikroszómális GST-k szerkezetétől. A Kappa GST-k hasonló hajtást mutatnak, mint a bakteriális diszulfid-kötést alkotó fehérjék, például a diszulfidhoz kötött oxidoreduktáz A (DsbA). 11., 13., 14. A GSTK1-1 és a DsbA strukturális hasonlósága arra a nézetre vezetett, hogy át kell nevezni DsbA-szerűnek (DsbA-L); Ugyanakkor hasonló a 2-hidroxi-kromén-2-karboxilát bakteriális izomerázaihoz. Bár kimutattuk, hogy a GSTK1-1 in vitro jelentős glutation-transzferáz aktivitással rendelkezik, 13 kifejlesztettük a GstK1 knockout egereket annak biológiai szerepének vizsgálatához in vivo. Megállapítottuk, hogy a GSTK1-1 hiány glomeruláris nephropathiát okoz, beleértve az alapmembrán változását, a podocita folyamatot és a mikroalbuminuriát. Érdekes módon ez a fenotípus hasonlít az adiponektinhiányos egereknél tapasztaltakhoz, amelyek albuminuriát és a podocita folyamatok fúzióját mutatják. 16.

Tekintettel a GSTK1-1 látszólagos szerepére az adiponektin oligomerizációjában és hasonlóságában a GSTK1-1 és az adiponektin hiányos egér fenotípusokban, most megvizsgáltuk a GSTK1-1 hiány hatását az adiponectin multimerizációjára és az adiponectin által közvetített funkcióira a GstK1 -/- egerekben.

Anyagok és metódusok

A tanulmányban használt GstK1 -/- egerek generációját ismertették. Ebben a vizsgálatban 15 hím GstK1 -/- egeret és vad típusú kontrolljukat használtuk 12-20 hetes korban. A magas zsírtartalmú étrendet (Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Ausztrália) ad libitum adták 8 hétig, és 23% zsírból, 0,19% koleszterinből és 43% összes emészthető energiából állt, amely lipidekből származott.

Glükóz tolerancia tesztek

Az egereket 6 órán át éheztettük a vércukorszint meghatározása előtt, Optium Xceed glükométerrel (Abbot Diagnostics, VIC, Ausztrália). Ezután az egereknek intraperitoneálisan injektáltunk 2 g/kg D-glükózt (Sigma Aldrich, Castle Hill, NSW, Ausztrália), és a vércukorszintet 15 percenként 1 órán át mértük.

HMW-specifikus és HMW-specifikus adiponectin immunvizsgálatok (ELISA)

A teljes (R és D rendszerek, Minneapolis, MN, USA) és a HMW-specifikus (Alpco Diagnostics, Salem, NH, USA) szérum adiponektin szinteket kereskedelmi ELISA készletek alkalmazásával mértük a szállító utasításai szerint.

Western blot

A szérum adiponektin esetében az 1: 1500 egérszérum 2,5 μl-es hígítását egy csíkra osztottuk egy nem redukáló, denaturáló 4-20% SDS-poliakrilamid gélen (Biorad, Hercules, CA, USA). A teljesen aktivált foszfo-5-AMP protein kináz (AMPK) esetében a májat T-PER pufferben (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) homogenizáltuk proteázzal (Roche, Castle Hill, NSW, Ausztrália) és foszfatáz inhibitorokkal ( Merck, Darmstadt)., Németország). A fehérjéket BCA protein assay kit (Thermo Scientific) és sávonként 20 μg fehérje alkalmazásával számszerűsítettük. A géleket az Immobilon PVDF membránokon (Millipore, Billerica, MA, USA) blottoltuk és egy éjszakán át 4 ° C-on blokkoltuk 2% BSA-ban Tris-pufferolt sóoldatban (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) anti-adiponektin antitestekkel (Millipore), anti-totális vagy anti-foszfo Thr172-AMPK-val (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) vizsgáltuk. A membránokat HRP-konjugált másodlagos antitestekkel (Dako, Produktionsvej, Dánia) vizsgáltuk, amelyeket amplifikált kemilumineszcens reagensek segítségével fejlesztettünk ki (GE Healthcare Bio-Sciences, Rydalmere, NSW, Ausztrália), és röntgenfilmnek tettük ki.

az eredmény

Kezdetben Western-blot segítségével megerősítettük, hogy a GSTK1-1 normál egerek fehér zsírszövetében expresszálódik, és nincs jelen a Gstkl -/- egerekben (1a. Ábra).

( a ) Anti-GSTK1 Western blot az ivarmirigy fehér zsírszövetén GSTK1 +/+ és GSTK1-/- egerekben. ( b ) A teljes szérum adiponektin ELISA-val mérve normál étrenddel etetett GSTK1 +/+ és GSTK1 -/- egerekben. N = 15 mindkét csoportnál. ( c ) A HMW adiponektin szérum ELISA módszerrel mérve GSTK1 +/+ és GSTK1 -/- egerekben normál chow-t vagy magas zsírtartalmú étrendet etettek. N = 5 az összes csoportra. ( d ) Az adiponektin szérum multimer detektálása SDS-poliakrilamid gél nem redukáló elektroforézissel, majd Western-blottolás GSTK1 +/+ és GSTK1-/- egerekben. ( e, f ) Intraperitoneális glükóztolerancia teszt GSTK1 +/+ és GSTK1 -/- egerekben normális chow-t ( e ) vagy magas zsírtartalmú étrend ( f ). N = 6 az összes csoportra. ( g ) Western-folt segítségével kimutatták a foszfo- és a teljes AMPK-szint májszintjét. Az összes blot esetében a négy kor és nem szerinti GSTK1 +/+/GSTK1-/- egérpár egyikének reprezentatív párja látható.

Teljes méretű kép

Az adiponektin szérumban való eloszlásának vizsgálatához nem redukáló SDS-poliakrilamid gélelektroforézist használtunk a 8 héten át táplált magas zsírtartalmú egerek szérumának frakcionálására és az adiponektin multimerek Western-blotokkal történő jellemzésére. A kis molekulatömegű, közepes molekulatömegű és a HMW multimerek hasonló eloszlását találtuk mind vad típusú, mind GstK1 -/- egerekben (1d. Ábra).

Mivel az adiponektin szintje korrelált a javult glükóz toleranciával, vad típusú és GstK1 -/- egereket vetettünk be intraperitoneális glükóz tolerancia tesztre, akár normál étrenddel (1e ábra), akár magas zsírtartalmú étrenddel (1f ábra). A vad típusú és a GstK1-/- egerek között nem figyeltek meg különbségeket az éhomi vércukor-koncentrációban vagy a vércukor-clearance-ben.

Az adiponektin jótékony hatással van az inzulinérzékenységre az AMPK foszforilációja és aktiválása révén. Vizsgálatunk során azonban nem találtunk különbséget a máj foszfo-AMPK szintjében a vad típusú egerek és a magas zsírtartalmú étrendet tápláló GstK1 -/- egerek között (1g. Ábra).

vita

Az adiponektin nagyon érdekes az inzulinérzékenység fenntartásában játszott kritikus szerepe és gyulladáscsökkentő hatása miatt. Az adiponectin poszttranszlációs multimerizációja alacsony molekulatömegű, közepes molekulatömegű és HMW fajokká különös jelentőséggel bír, mivel az adiponektin jótékony metabolikus hatása nagyrészt a HMW formának tulajdonítható. Mivel a GSTK1-1 részt vesz az adiponektin poszttranszlációs oligomerizációjában, és a zsírszövetben való expressziója negatívan korrelált az egerek és emberek metabolikus szindrómájával, 9 feltételezte, hogy a GSTK1-1 hiányos egerek jelentős adiponektin oligomer hiányban szenvedhetnek az inzulinérzékenység rendellenességeit tükröző fenotípus. Egy korábbi tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a GstK1 -/- egerek szérum adiponektinszintje kissé alacsonyabb volt (P = 0,047), de ez a különbség nem volt jelen a jelenlegi vizsgálatban nagyobb egérszámmal. Meglepő módon a jelen vizsgálatok nem mutattak ki változást a teljes vagy a HMW szérum adiponektin vagy a multimerizációs mintázatban. Ezenkívül nem találtunk bizonyítékot a csökkent glükóz tolerancia vagy foszfo-AMPK szintekre, olyan fenotípusokra, amelyek megjósolhatók, ha a Gstk1 -/- egerek jelentős HMW adiponectin hiányt mutatnak.

Számos fehérje, köztük az endoplazmatikus retikulumhoz társuló 44-es fehérje (ERp44) és az endoplazmatikus oxidoreduktin-1-szerű fehérje (Ero1-Lα), szerepet játszik az adiponektin multimerizációjában, transzferjében és szekréciójában (áttekintés céljából lásd Wang et al. 1) . Lehetséges, hogy ezek vagy más molekuláris chaperone fehérjék is elősegíthetik a diszulfidhoz kapcsolt adiponektin multimerizációt, és alternatív kompenzációs utakat biztosíthatnak az oligomerizációhoz GSTK1-1 hiányában.

A vesepatológiában (albuminuria és a podocyta folyamat rendellenességei) megfigyelt hasonlóságok a GSTK1-1-15 egerekben és az adiponektinhiányos 16 egerekben kíváncsiak, tekintettel arra, hogy a GSTK1-1 hiány hiánya az adiponectin multimerizációjának köszönhető. Mivel azonban egyes adiponektin-funkciók látszólag specifikusak az oligomerekre, és mivel az oligomerek méreteloszlása ​​az átlagos molekulatömeg és a HMW kategóriákban széles (lásd az 1d. Ábrát), lehetséges, hogy a GSTK1-1 felelős egy adott részhalmaz kialakításáért oligomerek közül, amelyeket nem különböztetünk meg azzal, amelyet ebben a tanulmányban használtunk.

Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az adiponektin multimerizációját elősegítő molekuláris kaperonok farmakológiai felpörgetésének kísérletei nem vezethetnek az adiponektin HMW nettó növekedéséhez. Ezért a GSTK1-1 hiányának az adiponektin multimerizációra gyakorolt ​​hatásának hiánya, amelyről ebben a tanulmányban számoltak be, negatív hatással van arra a felvetésre, hogy a GSTK1-1 az inzulinrezisztencia és a kapcsolódó rendellenességek terápiás beavatkozásának célpontja. 9.