- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- A lizenin pórusok szerkezeti meghatározása
- Lizenin összeszerelési architektúra
- P hengeres szerkezet
- Kölcsönhatás lipidekkel
- Átmenet a membránba illesztett állapotba
- vita
- mód
- Rekombináns fehérjék előállítása és tisztítása
- Hemolízis teszt
- Lizenin pórusok összeállítása
- Minta előkészítés és adatgyűjtés
- Képfeldolgozás
- Modellek készítése és fejlesztése
- Grafén-oxid mintatartó készítmény
- növekményekkel
- Elektronmikroszkópos adatbank
- Fehérje adatbank
- További információ
- PDF fájlok
- További képek
- videók
- Kiegészítő film 1
- Hozzászólások
elemeket
- Krioelektron tomográfia
- Szupramolekuláris összeállítás
absztrakt
Az Eisenia fetida földigiliszta koelomikus folyadékából származó lizenin a kis β-pórusképző toxinok (β-PFT) aerolizin-családjába tartozik, amelyek közül néhány emberre és állatra is patogén. Az erőfeszítések ellenére a nagy felbontású fehérjék ezen csoportjának szerkezete megfoghatatlan volt, ezért az membránon történő aktiválás és beillesztés mechanizmusa továbbra sem tisztázott. Itt meghatározzuk a lizin pórusszerkezetét kristályos EMO alkalmazásával, egy részecskével 3,1 Å felbontással. A mérőszerelvény egy hosszú ß hengeres csatornát tár fel, amely túlmutat a komplex hosszán, és amely váratlanul két szálat tartalmaz a behelyezés előtt, amely egy hipotetikus membrán behelyezési hurkot bélel. Az aerolizin család többi tagjának vizsgálata magas szerkezeti konzerváltságot mutat ezen a területen, ami arra utal, hogy ebben a családban fennmaradt a membrán bejuttatási út. Egyes toxinok esetében a proteolitikus aktiváció és a peptid eltávolítása megkönnyíti az előzetesen inzert rostok fejlődését, lehetővé téve számukra, hogy a csatorna β-hordóját képezzék.
A lizenin, az Eisenia földigiliszta magzatának védekező fehérje a teemocitákban termelődik testnedvekben, amelyek a föld immunrendszerének részét képezik 1. Tagja a β-pórusképző kis toxin (β-PFT) aerolizinek családjának, amelyek nagyszámú bakteriális kórokozó kulcs virulenciafaktorát tartalmazzák, például az Aeromonas spp 2 által termelt aerolizint, a Clostridium perfringens epsilon toxint 3 és A Clostridium septicum α-toxin 4, míg a Bacillus thuringiensis parasporin-2 citocid aktivitással rendelkezik az emberi rákos sejtekkel szemben 5. A szerkezet alacsony szekvenciájú homológiája ellenére, vízoldható monomer formáikból kiderül, hogy valamennyien strukturálisan konzervált doménnel rendelkeznek, az úgynevezett pórusképző modulnak (PFM), amelyről ismert, hogy hozzájárul a 6 hengeres pórusok kialakulásához.
A legtöbb PFT-hez hasonlóan a lizenint is inaktív, vízben oldódó monomerként választják el 7. Az eukarióta sejtmembránban lévő szfingomielinhez (SM) kötődve a toxin jelentős változásokon megy keresztül másodlagos szerkezetében 8, és oligomer pórusokat képez a membrán felületén, ezt az elektrokristályográfia 9 és a nagysebességű atomi erő mikroszkópos 10, 11 vizsgálata határozta meg. a membránba történő behelyezéshez pórusképződéshez és az azt követő sejtlízishez 12, 13 .
A monomer lizin kristályszerkezetéből kiderült, hogy a toxin két fő strukturális doménbe szerveződik: (1) egy hosszúkás PFM az N-terminálison, amely tartalmaz egy SM kötési helyet, valamint egy membrán beillesztési hurkot, amelyről régóta azt gondolják, régió, amely β-hajtűvé szerveződik át a membrán behelyezése során, és (2) a C-terminális béta-trefol domén, amely kristályosodik a foszfocholinhoz (POC) kötődve 9. Az SM-hez kötött monomer lizén szerkezetének vizsgálata feltárta, hogy a toxin-kötődéshez mind a fő POC-csoport, mind az SM-acil-lánc egyik vége szükséges.
Bár a múltban több struktúrát is azonosítottak a 2., 3., 5., 9., 14., 15., 16., 17., 18. aerolizincsaládba tartozó toxinok monomer formáira, aktív pórusformájukra nem adott atomstruktúrát. Itt bemutatjuk a lizenin szerkezetét nem-amerikai membránba ágyazott krio-EM formában, 3,1 Å felbontású egyszemélyes részecskékkel. A szerkezet első pillantást vet az aerolizin-család membránba illesztett tagjának atomfelbontására és információt nyújt arról, hogy a család többi tagja hogyan aktiválható és összeilleszthető a megfelelő pórusformájukba.
az eredmény
A lizenin pórusok szerkezeti meghatározása
Egy élesített lizénin 3, 1 Å térkép felületi ábrázolása ( a ) és extracelluláris nézetek ( b ). Az oldallánc sűrűsége jól látható a ß-henger pórusain. A lizenin alegység három doménjét közlik: β-hajtű (olíva), sapka (rózsaszín) és receptor-kötő domén (cián). A lizén-komplexek reprezentatív krioelektron-mikrográfiája grafén-oxidon ( c ) -2,3 μm-es elmosódással nyertük FEI Titan Krios-on Gatan K2 Summit detektorral. A lizenin oligomer 2D osztályának jellemző átlagai ( d ). Skála, 20 nm.
Teljes méretű kép
Lizenin összeszerelési architektúra
Rajzfilm a lizin oldalról ( a ) és extracelluláris nézetek ( b ). A három lizenintartományt az 1. ábra szerint festjük: β-hajtű (olíva), sapka (rózsaszín) és receptor-kötő domén (cián). A komplex és a pórusok méreteit Cα-Cα mérésekkel mutatjuk be, és a kétréteg hozzávetőleges helyét ábrázoljuk, a foszfolipid fejcsoportokat narancssárgával, a hidrofób magot pedig szürke színnel ábrázoljuk. A Phe70 és Tyr79 aromás gyűrűk a sávban vannak felsorolva, csakúgy, mint a közvetlenül a Tyr79 gyűrű fölötti hisztidin csoportok. A foszfolin-kötő helyek (POC) maradványai gömbökben vannak feltüntetve, és egy csillag egy rugalmas tekercset jelez, amely összeköti a receptor-kötő domént a kupak doménnel. ( c ) Gauss-szűrt mosószer-bevonat (lila) felületi ábrázolása az élesített lizenintérkép körül. d ) A mosószer-öv extracelluláris oldalának alapos vizsgálata, amely kiemeli a három hisztidin-maradékot.
Teljes méretű kép
P hengeres szerkezet
Kölcsönhatás lipidekkel
A monomer lizenin korábban kristályosodott az SM és a POC 9 ligandumokhoz kötődve, bár ezek a struktúrák egyértelműen vízoldható állapotban voltak. A POC-t a lizin C-terminális β-trefoil doménjéhez kötve kristályosítottuk a Lys185, Ser227, Gln229, Tyr233 és Tyr282 szegélyezett zsebben (9. hivatkozás). Lizenin pórusok formájában ez a zseb ideális a foszfatidilkolin vagy SM fejcsoportokkal való kölcsönhatáshoz, mivel a receptor kötő domén hegyén fekszik közvetlenül a célsejt membrán felett (2a. Ábra: "POC"). Az SM-t az N-terminális PFM-hez kötődve azonosítottuk, és a monomer struktúrában az SM-mel kölcsönhatásba lépő maradékokat (Lys21, Tyr24, Tyr26, Gln117 és Glu128) a lizenin pórusdoménjába temettük (4d. Ezenkívül nem találtunk további lipideknek megfelelő sűrűségeket sem a szimmetrizált C9 térképen, sem a lizenin 4, 2 Å aszimmetrikus rekonstrukciójában. Lehetséges, hogy az SM felismerése ezen a helyen az oligomerizáció és a membránba történő behelyezés előtt következik be, amint azt már javasoljuk 9. Az is lehetséges, hogy a pórusok liposzómákból történő hatékony kivonására használt detergens nagy koncentrációja képes leválasztani minden megkötött lipidmolekulát a lizenin pórusban lévő alternatív SM kötőhelyről.
Átmenet a membránba illesztett állapotba
A 3. ábra és az 1. kiegészítő film az oldható monomer szerkezet (3a. Ábra) és a membránba ágyazott oligomer állapota közötti szerkezeti elrendezést mutatja (3b. Ábra). A Val157 és Arg159 közötti függesztett rugalmas tekercs (3a, b ábra, gömbök) lefelé fordítja a tartomány N-terminális kupakját
20 Å (3c. Ábra), és 35 ° -kal elfordul a középső lumen felé (3d. Ábra). A függőleges összeomlás összhangban van a sík kétrétegű lizenin AFM-megfigyeléseivel, amelyek a 10 membránba helyezve 3 nm-es magasságcsökkenést találtak. Ez a mozgás hajlítást vált ki az oldható monomer viszonylag lapos kupaktartományának közepén (3b. Ábra, szaggatott vonalak), és azt eredményezi, hogy minden kupakdomén a szomszédos receptordomént megkötő alegység doménjének tetején helyezkedik el (Supplemental Film 1). A β-hajtűk 5 β-szál és 310 PFM monomer lizenin-spirál 9 teljes átalakulását igénylik 2 új β-szálra, amint azt a 3a, b ábra kiemeli. A β-hajtű a pórus lumen extracelluláris oldala és a görbe az intracelluláris oldal felé közel 270 ° -kal kezdődik (3d. Ábra). Így a B hengerből származó lizenin pórusai háromszor annyi polipeptidből állnak, mint azt eredetileg gondolták (24 maradék) 9 .
a ) A lizenin monomer (PDB ID 3ZXD) és membránba helyezett állapotának rajzfilm ábrázolása ( b ) mindkét molekula a jelzett orientációban a receptorkötő doménhez igazodik (beillesztve). Szaggatott vonal vb jelezzük a kupak doménjának hajlítását, és a csuklómaradványok (Val157 - Arg159) gömbökként jelennek meg. A színvilágot a 2. ábra mutatja. 2a jelzett N- és C-végekkel. A merevített egymásra helyezett vízoldható monomer (cián) és a membránba ágyazott formája (olajbogyó) ábrázolása a receptorhoz kötődő doménnel szemben, oldalról nézve ( c ) és az extracelluláris nézet ( d ). A csillagok mindkét szerkezetben a Ser31-re mutatnak. 20 Å magasságcsökkenés és 35 ° -os elfordulás látható a fedél domén lumen felé.
Teljes méretű kép
vita
A lizenin pórusok 315 kDa-os krio-EM szerkezete 3,1 Å felbontással képviseli az első atomfelbontású pórusszerkezetet a kis β-PFT aeroszolcsalád egyik tagjának, feltárva egy vízoldható monomer átmenetét membránba ágyazott felületére, oligomer állapot. A szerkezet keretet biztosít a jövőbeni tanulmányokhoz arról, hogyan érhetik el a család más tagjai a pórusképződést, és utat nyit az új terápiák megtervezéséhez, amelyek célja a pórusképződés funkcionális megzavarása e család számára.
A lizenin vízoldható monomer szerkezetének összehasonlítása az aerolizin család három másik tagjával. Az aerolizinben (1PRE), az epsilon-toxinban (3ZJX) és a parasporin-2-ben (2ZTB) lévő 3 hengerhez hozzájáruló feltételezett régiókat zöld színnel festjük a korábban szemléltetett membránhurkokhoz, és sárgát az itt meghatározott krimpelő előszálakhoz. tanulmány. Ezek a régiók együttesen alkotják a lizenin pórusok β-hengerét. A két rost bevezetés előtt általában a toxinok szélén helyezkedik el, és a fő testtől elkülönül (szürke). Az aerolizin és az epsilon toxin esetében az előbeillesztett rostok C-vel (piros) rendelkező β-lapokban vesznek részt, ezáltal stabilizálják az oldható monomer állapotot. A paraszporin-2-ben az N-terminális peptid, amely nem volt jelen az aktivált toxin kristályszerkezetében, a legnagyobb hatással volt a toxin aktivitására, és úgy gondolták, hogy kölcsönhatásba lép a beillesztési hurokkal, ezáltal biztonsági zárként működik .,
Teljes méretű kép
Az ebben a vizsgálatban azonosított lizenin membrán beépítési módszer hasonló a kis βPFT-k α-hemolizin családjához. A staphylococcus hemolizinek és a NetB Clostridium toxin a szár előtti régió egyszerű megnyúlásán megy keresztül, amely a β-szendvics doménnel szemben van behelyezve, és így β hengeres pórusokat képeznek, anélkül, hogy a szerkezet többi részében jelentős változások történnének. 23, 25, 26 35. Ez a mechanizmus figyelemreméltóan konzervált ebben a családban, még akkor is, ha a szimmetria, az alegység sztöchiometriája és a receptorhoz kötődő régiók különböznek 27. Hasonló módon a pre-inzert lizin szálakat letekerjük a PFM-ből és egy hosszú p-hengerbe rendezzük el. Az α-hemolizintől eltérően azonban a lizenin PFM-je konformációs változáson megy keresztül, amely a
20 Á és belső tömörítés (1. kiegészítő film). A Degiacomi és mtsai. 31 által javasolt aerolizin pórusmodell, amely egy 18A krio-EM térképből származik, kombinálva a pórus előtti és kvázi pórus konformációkban blokkolt mutánsok molekuladinamikáját, szintén hasonlóságot mutat a lizin pórusszerkezetével abban, a 2. domén receptor kötő doménelrendezése és a PFM (3. és 4. domén) hasonlóan helyezkednek el, mint a lizenin. Az aerolizin β-hajtűk megnyúlása azonban megkezdődhet, mint például a lizenin esetében, a PFM tetején, és tartalmazhat pre-inszerciós rostokat. Ha az aerolizin család porózusabb struktúrái nagy felbontásban oldódnak meg, akkor egyértelműbb lesz, hogy ezek a toxinok hogyan változnak, és mennyiben maradnak fenn az inszerció mechanizmusai.
Megállapításaink és a szakterületen végzett korábbi munkák alapján az 1. ábrán bemutatott lizenin pórusképző modell. 5. Az oldható monomerek kezdeti kötődését a membránhoz a receptorkötő doménen keresztül közvetítjük a fő POC csoportokhoz (5a. Ábra) (hivatkozás a 9. és erre a tanulmányra). Ezenkívül segíti a toxin orientálását a pórusképződés előtt. Az SM felismerése ezen a ponton is előfordulhat. Ezt követi a pórus előtti állapotig történő oligomerizáció (5b. Ábra), amelyet az AFM 10, 36 és az elektron-kristályográfia 9 azonosít, monomer-monomer kölcsönhatásokon keresztül, ami kiválthatja a β-szőrök fejlődését alacsonyabb energiaállapotba. . és lehetővé teszi a monomerek szorosabb csomagolását. Az oligomerizáció, amely a pórusképződés előtt kötelező minden eddig jellemzett p-PFT esetében, biztosítja, hogy elegendő számú β-hajtű legyen jelen a 9-es csatornák kialakításához, és kielégítse a hidrofób környezetet, például a β-rost hidrogénkötését, például mint lipid kétrétegű 37. Végül a β-henger kialakulása pórusokat képez a kétrétegben (5c. Ábra), ami a membrán homeosztázisának megzavarásához és végső soron a sejt líziséhez vezet.
( a ) A lizenin monomerek (PDB ID 3ZXD) kezdetben kötődnek a célsejt membránjához a receptorkötő domén és a fő POC-részek közötti kölcsönhatások révén. ( b ) A membránhoz kötődve a monomerek helyi koncentrációjának növelése elősegíti az oligomerizációt, ami pórusok előtti összeépüléshez vezet. A monomerek orientációjától függően a pórusok magassága akár 100 A (a lizenin monomer hossza) is lehet. ( c ) A lizén membránnal töltött, ebben a vizsgálatban oldott formája 65 Å-t tesz ki a membrán felülete felett. Az itt bemutatott hipotetikus pre-pórusokat úgy alakítottuk ki, hogy kilencszeres szimmetriát ágyazunk be egy monomer kristályszerkezetbe, amely egy membránba ágyazott formában helyezkedik el a receptor-kötő doménre hivatkozva.
Teljes méretű kép
mód
Rekombináns fehérjék előállítása és tisztítása
Hemolízis teszt
Lizenin pórusok összeállítása
Minta előkészítés és adatgyűjtés
A mintákat hagyományosan gyártott dugattyúval, 4 ° C-on fagyasztva merítettük. A lizenin-oligomereket (3 μl 0,2 mg ml -1) a Quantifoil R1.2/1.3 kerek rácsos rácsos rézre (Quantifoil Micro Tools, GmbH) tettük fel réteggel négyzet alakú hálószemű (Quantifoil Micro Tools, GmbH) grafén-oxiddal (lásd alább) letakartuk, és 30 másodpercig hagytuk tapadni. Ezután a rácsokat 10 másodpercig blottoltuk a mintából, majd folyékony etánba merítettük. A mintákat egy FEI Titan Krios transzmissziós elektronmikroszkópon készítettük, amely 300 kV gyorsítófeszültségen működött. A mikrofelvételeket nagy felbontású módban rögzítettük egy Gatan K2 Summit közvetlen elektrondetektor segítségével, egy Gatan Quantum energiaszűrő végén, nulla veszteséggel és résszélességű üzemmódban, 20 eV energiaválasztással. A teljes dózis a mintában 47 e - Å2 volt, 20 képen frakcionálva 0,715 Å kalibrált pixelmérettel a nagy felbontású mikrográfiákhoz.
Képfeldolgozás
Modellek készítése és fejlesztése
A vad típusú lizenin 9 kristályszerkezetet (PDB ID 3ZXD) alkalmaztuk templátként az N terminus de novo modellezéséhez a C-terminális 150 maradékok után, amelyek a β-trefoil receptor kötő domént képezik. Az összes modellépítést a Coot 45-ben végezték el. A modellből hiányoznak a 9N terminális maradványok, amelyek sűrűségét nem láthattuk. A modell finomítását az illesztés, a geometria és az atomütközések javítása érdekében a REFMAC 5.8 (46. hivatkozás) alkalmazásával végeztük, nem kristálytani szimmetria korlátokkal, figyelembe véve a PROSMART 47 által generált kilencszeres szimmetriát és másodlagos szerkezetkorlátozásokat. A túlillesztés elkerülése érdekében használt finomítási paraméterek keresztellenőrzését úgy hajtottuk végre, hogy a modellt finomítottuk az első szűretlen féltérképhez képest, és összehasonlítottuk ugyanazon modell FSC-jét mindkét féltérképpel (4b. Kiegészítő ábra).
Grafén-oxid mintatartó készítmény
A grafén-oxid diszperzióját H20-ban (Sigma) 0,2 mg ml -1-re hígítottuk vízben, és 300 g-on centrifugáltuk 30 másodpercig a nagy aggregátumok eltávolítása céljából. A Quantifoil R1.2/1.3 lyukas rácsokat 1 percig izzítottuk, és 1 percig 3 μl grafénszuszpenziót adtunk a rácsokhoz. A rácsokat a közelmúltban Whatman No1 szűrőpapírral rövid ideig eltakarítottuk, és háromszor 20 μl H 2O cseppen mostuk (kétszer a grafén oldalán, egyszer a hátoldalán). Ezután a rácsokat további kezelés nélkül merítették-fagyasztották.