fokozzák

  • absztrakt
  • A fő
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • Állatok és kísérleti tervezés
  • Caspase-3 aktivitás
  • Szövettani és immunhisztokémiai módszerek
  • Hibridizáció in situ
  • Kvantitatív valós idejű PCR
  • Máj kollagéntartalma
  • Statisztikai analízis
  • AZ EREDMÉNYEK
  • Májsérülés
  • A máj prekurzor sejtjeinek megnagyobbodása
  • Májfibrózis
  • Májgyulladás
  • Fibrogén májsejtek
  • EMT LPC
  • VITA
  • További információ
  • Képfájlok
  • További kép S1
  • További kép S2

absztrakt

A fő

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok és kísérleti tervezés

Caspase-3 aktivitás

A májlizátumokat hipotonikus pufferben (50 mM HEPES, pH 7, 5, 100 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM EGTA, pH 8, 1 mM DTT, proteáz inhibitor koktél (Roche)) homogenizálással állítottuk elő. A homogenizátumokat 10 000 g-vel 15 percig centrifugáltuk, és az extrahált fehérjéket (50 μg) két kísérletben vizsgáltuk az Ac-DEVD-AFC fluorogén szubsztrát proteolitikus hasadásának mérésével kaszpáz-3-on (Biomol) egy TriStar LB 941 mikrolemezen. olvasó (Berthold). mint már leírtuk. 30

Szövettani és immunhisztokémiai módszerek

In situ hibridizáció

Az a-fetoproteinre (AFP) és a TGFβ-ra specifikus további RNS-próbát szintetizáltunk digoxigenin RNS-jelző készlet (Roche Diagnostics) segítségével. A CRNA AFP próbákat egy patkány cDNS plazmidból nyertük (amelyet Dr. JL Danan adományozott) Xma I (antiszensz) vagy SphI (érzék) próbával emésztve, és SP6 vagy T7 promóterekből átírva. A primer feltérképezéséhez a TGF β próbákat egy patkánymáj RT-PCR-rel a 9. napon kapott AD/parciális hepatectomia modellben transzkriptáltuk egy előre történő 5'-TACGTCAGACATTCGGGAAGCAGT-3 'és reverz 5'-TGTACTGTGTGTCCAGGCTCCAAA-3' alkalmazásával. -576 és 1143-1131 patkány TGF p szekvenciáját (GI: 148747597) és szubklónoztuk a pCR4-TOPO plazmidba. A TGF β cRNS próbákat egy Spe I (antiszensz) vagy NotI (érzék) emésztett plazmid T7 és T3 promótereiből írtuk át, és a jelölést, a hibridizációt és a detektálási eljárásokat a fent leírt paraffin szakaszokban hajtottuk végre. 31 Az AFP vagy TGF β mRNS detektálását immunfluoreszcens anti-CK19-vel festett egymást követő májszelvényekben, a fentiek szerint, standard in situ hibridizációs protokoll alkalmazásával végeztük 5 μm vastagságúra vágott fagyasztott soros szakaszokon (kiegészítő anyagok).

Kvantitatív valós idejű PCR

Az összes RNS-t fagyasztott májszövetből izoláltuk az RNeasy mini kit (Qiagen) alkalmazásával. Az első szálú szintézis készlet (Fermentas Life Sciences) segítségével összesen 2 μg-ot fordítottunk át véletlenszerű hexamerekből, és specifikus cDNS-amplifikációkat hajtottunk végre a korábban leírtak szerint 29, az 1. táblázatban felsorolt ​​primerek felhasználásával. 2. módszer - ACT és a riboszomális 18S RNS normalizálása és az eredmények többszörös indukcióban kifejezve a kontrollállatoktól kapott értékekhez képest.

Asztal teljes méretben

Máj kollagéntartalma

A hidroxiprolin-vizsgálatot a korábban leírt 32 módon hajtottuk végre, különböző lebenyek kis töredékeit felhasználva, ezeket egyesítettük, liofilizáltuk és 6 N HCI-ban 110 ° C-on egy éjszakán át hidrolizáltuk. A máj hidroxiprolin tartalmát spektrofotometriásan mértük frissen készített Ehrlich-reagens alkalmazásával, és az eredményeket μg/mg szövetben (száraz tömeg) fejeztük ki.

Statisztikai analízis

A máj tömegét, az mRNS-t és a fehérje-analízist (ALT, kaszpáz-3, hidroxi-prolin) minden állatnál megismételtük két kísérletben, az értékek átlag ± ± 4 - 9 egyedi patkányok voltak minden csoportból és időpontról. értékelés. az egyes kezelések hatása heteken keresztül a Bonferroni utópróba alkalmazásával. A két csoport közötti különbségek összehasonlítására Student t-tesztjét használtuk. A statisztikai elemzéseket PRISM-mel (GraphPad) és P * P ** P *** P értékével végeztük

Májkárosodás és hisztopatológia. ( a ) A szérum ALAT aktivitása a CCI4 és AAF/CCI4 kezelt patkányokban hasonló és szignifikánsan magasabb szintre emelkedett, mint az AAF kezelt patkányokban. A fluorometrikus kaszpáz-3 aktivitás növekedése hasonló volt a CCI4-gyel vagy AAF/CCI4-vel kezelt patkányok májában, és szignifikánsan nagyobb volt az AAF-nal kezelt állatokban. ( b ) A máj és a testtömeg aránya szignifikánsan megnőtt az AAF/CCI4-vel kezelt patkányokban 6 hetes kezelés után a többi csoporthoz képest. # P * P ** P

LPC partíció aktiválása. ( a ) A CK19-pozitív sejtek reprezentatív immunfluoreszcenciás detektálása a májszekciókban LPC-felhalmozódást mutatott ki AAF (n = 4) és AAF/CCl4 (n = 9) kezelt patkányokban, amelyek 4 hét után portálterületekről keletkeztek, és 6 hét után kitágultak a lebenyekben (eredeti nagyítás × 200). A betétek a CK19 jelölés nagyobb nagyítását mutatják. Ilyen LPC felhalmozódást nem mutattak ki a CCl4 csoportban (n = 9), ahol a CK19 jelölés az epevezeték sejtekre korlátozódott. ( b ) A valós idejű PCR csak az AAF és AAF/CCI4 csoportokban mutatta ki a CK19 mRNS expressziójának növekedését. ( c ) Az in situ hibridizációval kimutatott AFP mRNS-t (AFP AS próba) az AAF-mal és AAF/CCI4-vel kezelt állatokban csak a duktuláris válaszsejtekre korlátoztuk. Nem figyeltünk meg specifikus jelet az AFP szondával (eredeti nagyítás × 400). * jelzi a portál traktusát. A képek három független kísérletet mutatnak be a patkánymáj három különböző szakaszából.

Teljes méretű kép

Májfibrózis

Teljes méretű kép

Makrofágok toborzása és gyulladása. ( a ) A CD68 immunfluoreszcencia detektálás (kezdeti nagyítás × 200) pozitív sejteket mutatott ki az AAF csoportban a máj parenchymájában, a CCI4-kezelést követő rostos szeptumban és az AAF/CCI4-vel kezelt állatok cirrhosisában. Az ábrák 4 (AAF) - 6 (CCI4 vagy AAF/CCI4) májmetszetet mutatnak. * a portál traktátusait jelöli. ( b ) Az állatokból származó máj CD68-pozitív sejtek mennyiségi meghatározása nem mutatott ki szignifikáns különbséget a máj makrofágjainak számában a CCl4 és AAF/CCl4 csoportokban 4 vagy 6 hetes kezelés után. Az adatok 4 (AAF) és 6 (CCI4 vagy AAF/CCI4) patkány mindegyik májszakaszának külön kétmezős elemzésének átlagai ± félév. A kvantitatív RT-PCR nem mutatott mennyiségi különbségeket az expresszióban ( c ) TNF α vagy ( d ) CCR2 mRNS, jelezve, hogy a gyulladásos válasz hasonló volt a három csoportban.

Teljes méretű kép

A májkárosodás során az aktivált makrofágok számos citokint választanak ki, köztük a tumor nekrózis faktort α (TNFα), amelyek mitogén hatásúak a 34 hepatocitákra, valamint az LPC-re. 35, 36 CCI4-vel kezelt patkányokban a valós idejű PCR fokozatos, de korlátozott (kevesebb mint 4-szeres) indukciót mutatott ki a TNFα mRNS-re (4c. Ábra) olyan szintre, amely statisztikailag nem különbözött az AAF és az AAF/CCI4 között. csoportok. Továbbá a CC motívum 2 (CCR2) kemokin receptor mRNS, amely csak toborzott monocitákban és néhány T-sejtben expresszálódik, nem különbözött a három csoportban (4d. Ábra). A gyulladás alacsony és hasonló mértéke ebben a három csoportban ellentétben áll a fibrózis megnyúlásának erős különbségével, ami arra utal, hogy kísérleti körülményeink között a gyulladásnak nem volt nagy szerepe a fibrogén folyamatban.

Fibrogén májsejtek

HSC vagy a portál fibroblasztok aktiválása. ( a ) Az SMA-pozitív sejtek immunhisztokémiai kimutatása gyengén aktivált HSC-kötő portális ereket tárt fel 6 hét CCl 4 önmagában történő beadása után. Ezzel szemben az AAF/CCl4-vel kezelt patkányokban számos pozitív sejtet detektáltak a portál területek körül a 2. héten, a rostos septumban a 4. héten és a perinodularis területeken a 6. héten. Nem voltak SMA-pozitív sejtek. megfigyelhető a duktuláris válaszban. AAF Group. A képek 4 (AAF) és 9 (CCI4 vagy AAF/CCI4) májszakaszt reprezentálnak az eredeti nagyítással × 100. b ) 6 hetes CCl 4 kezelés után egy nagyobb nagyítás (× 400) egyértelműen SMA-pozitív sejteket mutatott a központi rostos septumban, amely jelentős kollagén lerakódást tartalmazott, amelyet picrosirius vörös festés mutatott ki. Ezzel szemben az AAF/CCl4-vel kezelt patkányokban a HSC-k vagy a portál fibroblasztok aktiválódását detektálták a 2. hét elején az LPC körül, ami a microsirium-vörösnel kissé festett periportális területeken fordult elő. A 6. héten a magas kollagénlerakódású rostos szeptum áthidalásakor jelölést és SMA-t figyeltek meg.

Teljes méretű kép

Fibrogén májsejtek kimutatása. ( a ) Az immunfluoreszcencia detektálása, valamint az SMA és a desmin 6 hetes kezelés után megerősíti a HSC aktiválódását a miofibroblaszt expresszáló és az SMA-ban az AAF/CCl4-vel kezelt patkányok cirrhotikus májában. Csak a CCl 4 beadása után nagyon kevés és SMA-pozitív HSC-t jelentettek a rostos szeptumban. Aktivált HSC hiányát figyelték meg a portál régiók körül az AAF által kiváltott ducularis válaszban. Reprezentatív fluoreszcens fotomikrográfiák két kísérletből, mindkét csoport két patkányának májszakaszán, kezdeti nagyítással × 200. ( b ) A kvantitatív RT-PCR elemzés a TGF-β mRNS expressziójának fokozott indukcióját mutatta ki AAF és AAF/CCI4 kezelt állatokban, és ( c ) A TGF β mRNS detektálása in situ hibridizációval mindkét csoportban (kezdeti nagyítás × 400) erős pozitív jelet mutatott az LPC-ben csatornaszerű struktúrákban (az inzert tartalmazza az érzékelő próba címkét). ( d ) A TGF β (zöld) és CK19 (vörös) fehérjék kettős immunfluoreszcencia detektálása AAF/CCI4-kezelt patkányok májszakaszaiban konfokális analízissel mutatta ki az összesített képeken a TGF β-t expresszáló LPC-t. Az ábrák két független kísérletet mutatnak be, mindegyik csoportban három különböző patkánytól.

Teljes méretű kép

EMT LPC

A mezenhimális fehérjék immunolokalizációja CK19-pozitív LPC-ként AAF/CCI4-vel kezelt állatokban 6 hetes kezelés után. a ) Reprezentatív kettős immunfluoreszcencia képek a CK19 (zöld) és a miofibroblaszt markerekhez (piros), valamint az SMA, a desmin, az FSP1 és a kollagén 1 két kísérletből két patkányból (eredeti nagyítás × 200). Az LPC-ben egyetlen kombinációs jel sem volt elérhető egyetlen mezenkimális marker és a CK19 között sem. ( b ) A konfokális elemzés megerősítette, hogy a deszmin- és az SMA-pozitív sejtekkel körülvett CK19-pozitív LPC-kben nincsenek mesenchymalis markerek (× 630).

Teljes méretű kép

VITA

Érdekes kérdés, hogy az LPC mikofibroblasztokká képes átalakulni az EMT-n keresztül. 51, 52, 53 Az EMT fibrózisban betöltött szerepét a tüdőben és a vesében határozták meg, a májban pedig már beszámoltak a hepatociták, az epeutató sejtek és a HSC átmenetéről is. 22, 23, 24, 25, 26 A TGF β, amelyet az LPC szekréciójának találtunk, egy jól ismert 22, 23, 25 EMT induktor, amely kiválthatja az LPC átmenetet egy autokrin/parakrin úton, és új potenciális mechanizmust biztosíthat a fibrózisban . Azonban nem tudtuk kimutatni a mesenchymalis markerek (azaz α SMA, desmin és FSP1) expresszióját in vivo AAF/CCl4-kezelt patkányok CK19-pozitív LPC sejtjeiben. A duktuláris struktúrákba szerveződött LPC átmenetét izolált miofibroblasztokba nehéz lehet azonosítani az epitheliális és mesenchymalis markerek kolokalizációjával, különösen akkor, ha az epitheliális jellemzők elvesztése az EMT folyamata elején jelentkezik. Ezen okokból az EMT in vivo átesett LPC-jének bizonyításához genetikai sors-feltérképező megközelítésre van szükség az LPC sorsának követésére a májkárosodás során. Mindazonáltal az LPC átmenetét miofibroblasztokká a TGF β-val történő kezelés után valóban korábban már in vitro szereztük, etininnel kiegészített kolinhiányos étrendet tápláló patkányokból izolált LPC alkalmazásával. 53

Összefoglalva, megmutatjuk, hogy az LPC expanzió súlyosbítja a májfibrózist. Úgy tűnik, hogy ez az erős fibrogén válasz nem a hepatocelluláris elváltozások vagy a gyulladásos válasz közvetlen következménye, de úgy tűnik, hogy a TGF β-termelő LPC felhalmozódásának tudható be, ezáltal a fibroblasztok és/vagy a HSC myofibroblast átalakulása a sérült májban. A periportalis LPC fibrogén tulajdonságai magyarázatot adnak a domináns periportalis fibrózis kialakulására, bármi legyen is a hepatocelluláris károsodás elsődleges helye, ami a porto-centrális rostos szepták cirrhosis kialakulásához vezet.