nyom

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • TRAIL fúziós fehérjék tervezése és gyártása
  • Az scFv-scTRAIL antigén-specifikus megkötése
  • Az antigénnel korlátozott sejtpusztulás célindukciója scFv - scTRAIL segítségével
  • Az scFv-scTRAIL apoptózis TRAIL-R2 által közvetített indukciója
  • A szérum felezési ideje scFv - scTRAIL
  • Daganat hatása az emberi vastagbél karcinómákra meztelen egerekben
  • vita
  • szójegyzék

elemeket

  • rák
  • farmakodinamika
  • farmakokinetika
  • Rekombináns fehérje terápia

absztrakt

A fő

A közelmúltban leírtak egy rövid láncú peptid linkerekhez fuzionált három TNF monomerből álló egyláncú TNF molekulát, amely fokozott stabilitást és daganatellenes aktivitást mutat. Javasoltuk az egyetlen polipeptidlánc TRAIL (scTRAIL) analóg változatát, amelyet az scFv-scTRAIL fúziós fehérje felépítéséhez használtak a tumor célzásához. Összehasonlítottuk e fúziós fehérje biológiai aktivitását a nem célzott scTRAIL-rel in vitro és in vivo tumor modellekben. Itt megmutatjuk, hogy a tumor antigénre célzott scTRAIL fúziós fehérje in vitro magasabb apoptotikus aktivitást mutatott az scTRAIL ellen, a TRAIL-R2 jelátvitel domináns hatása a Colo205 vastagbél karcinóma sejtekre. Egér tumor tumor xenograft modellen végzett in vivo vizsgálatok szignifikánsan magasabb választ igazoltak az ErbB2-specifikus tumor-célzott scTRAIL fúziós fehérjére.

az eredmény

TRAIL fúziós fehérjék tervezése és gyártása

Egyláncú TRAIL molekula létrehozásához követtük az scTNF 20-ra leírt tervezési elvet, és kovalensen fuzionáltunk három TRAIL monomert, amelyek mindegyike a TRAIL (aa 95-281) extracelluláris doménjéből állt, két peptid linkeren keresztül, amelyek a GGGS szekvencia négy ismétlődését tartalmazzák. (1a. Ábra). Az N-terminális FLAG jelölést a tisztítás és az elemzés megkönnyítése céljából adtuk hozzá. Ezután az egyláncú antitest fragmens (scFv) N-terminálisának további egyesítésével, amely felismeri az FRP5 epitópot az ErbB2, 21 extracelluláris doménjében, létrehoztunk egy ErTB2-specifikus scTRAIL fúziós fehérjét (1a. Ábra).

Az scTRAIL és az scFv - scTRAIL biokémiai elemzése. a ) Az ebben a vizsgálatban használt scTRAIL fúziós fehérjék vázlata. L, vezető peptid; scFv, humán ErbB2-specifikus egyláncú antitestfragmens; F, FLAG jel; VONAT, emberi VONAT (aa 95–281). ( b ) A tisztított scTRAIL-t (1. sáv) és az scFv-scTRAIL-t (2. sáv) SDS-PAGE-val (10%, redukáló körülmények) elemeztük, majd immunblot-analízissel (balra, 250 ng fehérje/sáv) vagy ezüstfestéssel (jobbra, 1 μg) fehérje)./bár). Az immunblottozáshoz anti-FLAG M2 monoklonális antitestet és lúgos foszfatázzal konjugált szekunder antitestet használtunk. ( c ) A TRAIL variánsokat gélszűréssel választottuk el BioSuite250 oszlopon. A szaggatott vonalak az apoferritin (443 kDa), a β-amiláz (200 kDa), a szarvasmarha szérumalbumin (66 kDa) és a karbonanhidráz (29 kDa) molekulatömeg-standardjának retenciós idejét jelzik. Az összegyűjtött frakciókat immunoblot módszerrel elemeztük, mint a b . Az scTRAIL 1-9 frakciókat (minden második frakció; első rész), a 11-16 frakciókat (második rész) és a 19-26 frakciókat (minden második frakció; harmadik rész) immunblotoltuk. Az scFv-scTRAIL esetében a 8–24-es frakciókat immunblottoltuk

Teljes méretű kép

Mind az scTRAIL-t, mind az scFv-scTRAIL-t affinitáskromatográfiával tisztítottuk monoklonális M2 anti-FLAG agarózon, stabilan transzfektált HEK293 sejtek felülúszójából, körülbelül 1 mg fehérje/liter sejttenyészet-felülúszó hozammal. A tisztított fehérje immunblot-analízise és SDS-PAGE (1b. Ábra) -70 kDa molekulatömegű egyedi fehérjetsávokat mutatott az scTRAIL és

100 kDa az scFv-scTRAIL esetében, amely megfelel a várhatóan számított 71, illetve 98 kDa molekulatömegnek. A gélszűrési elemzés mindkét scTRAIL variáns monomer szerveződését mutatta, amely a TRAIL rész vonatkozásában megfelel a hagyományos rekombináns TRAIL molekula nem kovalensen összeillesztett trimerének (1c. Ábra). A SEC-ből származtatott molekulatömeg valamivel alacsonyabb volt az SDS-PAGE-tól kapott tömeghez képest (1b. Ábra), amely nem degradáció eredményeként jött létre, amint azt az egyesített frakciók immunblot-analízisével igazoltuk (1c. Ábra). Az scTRAIL készítményben a szekundáltan látszólag nagyobb molekulatömegű SEC-ben eluált kisebb frakció, azaz potenciálisan aggregált komplexeket tartalmaz, nem mutatott aránytalanul magas biológiai aktivitást, amint azt a 2. és 15. frakció citotoxikus aktivitásának összehasonlításakor találtuk, figyelembe véve a relatív fehérjét összegek (az adatok nem láthatók).

Az scFv-scTRAIL antigén-specifikus megkötése

Az scFv-scTRAIL ErbB2-pozitív sejtekhez való specifikus kötődésének elemzéséhez áramlási citometriás elemzést végeztünk. Az ErbB2 expressziójának elemzése a Colo205 vastagbél karcinóma sejtek és a HT1080 fibrosarcoma sejtek mérsékelt és alacsony expressziós szintjét igazolta (2a. Ábra), összehasonlítva az SKBR3 sejtekkel, amelyekről ismert, hogy magasan expresszálják az ErbB2 fehérjét (az adatokat nem mutatjuk be). A Colo205 és HT1080 sejtek fúziós fehérjével történő inkubálása specifikus kötődést mutatott ki az ErbB2-pozitív sejtekhez (2a. És b. Ábra) a nem célzott scTRAIL-tal történő inkubáláshoz képest, csak gyenge fluoreszcens jelet eredményezve, akár anti-TRAIL detektálással (2a. Ábra). ) vagy anti-FLAG antitestekkel (az adatokat nem mutatjuk be). Mivel a homotrimer FLAG-jelölt TRAIL kötése hasonló gyenge jeleket mutatott (az adatokat nem mutatjuk be), ez tükrözheti a TRAIL receptor (TRAILR) expressziójának alacsony szintjét a vizsgált célsejteken és/vagy a FACS vizsgálatok elégtelen érzékenységét. Az ErbB2-specifikus kötődést TRAILR1 és R2-Fc fúziós fehérjék alkalmazásával igazoltuk, hogy kimutassuk az scFv-scTRAIL célsejtekhez való kötődését (2b. Ábra) és az anti-ErbB2 antitestekkel (FRP5) való versengést. Ez az scFv-scTRAIL ErbB2-pozitív sejthez való kötődésének szinte teljes gátlását eredményezte (2b. Ábra).

Teljes méretű kép

A szérum felezési ideje scFv - scTRAIL

Az scFv-scTRAIL farmakokinetikai tulajdonságainak értékeléséhez az scTRAIL-hoz képest szérummintákat vettünk 400 pmol intravénás (iv) injekció után az egyes Balb/c egereknek. Mindkét esetben az idővel ábrázolt relatív szérumkoncentrációk jól alkalmazkodtak a kétfázisú exponenciális regressziós görbe csökkenéséhez. Az injekció beadása után 20 percen belül mindkét TRAIL variáns hasonló kinetikát mutatott, szérum felezési ideje ∼ 35 perc (t 1/2 α). A későbbi időpontokban enyhe, de szignifikáns különbséget találtak a biohasznosulásban, felezési ideje (t ½ β) 160 és 124 perc, valamint AUC 11 191 és 8125 volt scFv-scTRAIL és scTRAIL esetében (5a. Ábra). Így az ErbB2-specifikus fúziós fehérje hatékonyabban visszatartotta a véráramot, ami pozitívan befolyásolhatja a terápiás aktivitást.

Teljes méretű kép

Daganat hatása az emberi vastagbél karcinómákra meztelen egerekben

Összefoglalva, adataink bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy bioaktív egyláncú TRAIL fúziós fehérjék keletkezhetnek. Ezenkívül a célspecifikus scFv ellenanyaghoz való fúzió a cél TRAIL által közvetített citotoxicitás célfüggő növekedését eredményezi in vitro, valószínűleg a TRAIL-R2 hatékony aktivációjának köszönhetően, és javítja a tumorellenes aktivitást in vivo. Ennek megfelelően ez a tervezési koncepció ígéretes stratégiát jelent a TRAIL daganatellenes hatásának fokozására és a normális szöveteken esetlegesen előforduló nem kívánt célhatások minimalizálására.