megváltoztatja

  • elemeket
  • absztrakt
  • Célja, hogy:
  • Tantárgyak és módszerek:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az emberi SP1 expressziója növelte a legyek testtömegét
  • Az SP1 növeli a transzgenikus legyek zsírtartalmát
  • Az SP1 növelte a táplálékfelvételt, de nem befolyásolta a mozgásszervi aktivitást.
  • Az SP1 transzgénikus legyek ellenálltak az élelmiszerhiánynak és csökkentek lipin expresszió gén
  • vita

elemeket

  • Drosophila
  • Gén expresszió
  • Elhízottság
  • patogenezis
  • A cikk helyesbítését 2012. december 11-én tették közzé

absztrakt

Célja, hogy:

Az elhízás kórképét továbbra is teljesen félreértik. A Drosophila megőrizte az emberek neuroendokrin és emésztőrendszerét, és az energetikai homeosztázis tanulmányozásának kiváló rendszerévé vált. Bevezettük a Drosophila elhízás új modelljét, amelyben az emberi fehérje szinfilin-1 (SP1) neuronokban való expressziója pozitív energiamérleget eredményez.

Tantárgyak és módszerek:

Az SP1 hatásának további megértése érdekében az energiamérleg szabályozásában az UAS/GAL4 upstream aktivációs szekvencia rendszert alkalmaztuk humán SP1 transzgénikus Drosophila előállítására. A humán transzgénikus Drosophila SP1-t úgy jellemeztük, hogy meghatároztuk az SP1 expresszióját, a zsír lipidek tárolását, az étel bevitelét és a légmozgás aktivitását, hogy meghatározzuk a főbb viselkedési változásokat és azok következményeit az elhízáshoz hasonló fenotípus kialakulására.

az eredmények:

Az SP1 túlzott expressziója neuronokban, de a perifériás sejtekben nem, növelte a legyek testtömegét a nem transzgén kontrollokhoz képest. Az SP1 növelte a táplálékfelvételt, de nem befolyásolta a mozgásszervi aktivitást. Az SP1 növeli a triacil-glicerin szintjét, a zsírsejtek és a zsírcseppek méretét, ami arra utal, hogy az SP1 növeli a zsírok és zsírok elhelyezkedését. A túlélési vizsgálatok azt mutatták, hogy az SP1 transzgén legyek jobban ellenálltak az élelmiszerhiánynak. Az SP1 szabályozta a lipin gén expresszióját, amely szerepet játszhat az SP1 által kiváltott zsírlerakódásban és az éhomi ellenállásban.

következtetés:

Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy az SP1 expresszió olyan módon befolyásolja az energiaháztartást, amely növeli a pozitív energiaegyensúlyt, és hasznos modellt kínál az elhízásról a jövőbeni kórokozó és terápiás vizsgálatok során.

A Drosophila kiváló modellt vált a homeosztázis anyagcseréjének és a tápanyagok érzékelésének útjainak tanulmányozásához. 17, 18 A Drosophila megőrzött gerinces-szerű neuroendokrin és emésztőrendszert. A Drosophila és az emberek hasonló szervrendszereket és biokémiai útvonalakat használnak a keringő cukorszint fenntartásához, valamint a cukrok és zsírok tárolásához. A glikogén és a zsír (többnyire triacil-glicerin (TAG) formájában) zsíros legyekben tárolódik, amelyek a máj és a fehér zsírszövet légyegyenértékének tekinthetők. A Pars intercerebralis-corpora rovarok szívrendszere, a gerincesek hipotalamusz-agyalapi mirigyének endokrinológiai megfelelője információt kap a belső anyagcsere állapotáról, és koordinálja a különböző perifériás szervek élettani aktivitását. Drosofil modelleket használnak az energia homeosztázis számos aspektusának vizsgálatára, ideértve az étel észlelését, a táplálékfelvétel szabályozását, az energiaáramlást és a lipometabolizmust. 17, 18 Bár a metabolikus homeosztázis szabályozásának molekuláris alapja korántsem ismert, annak vizsgálata, hogy az új fehérjék hogyan működnek az olyan metabolikus válaszok befolyásolására, mint a lipid és a glükóz homeosztázis, új lehetőségeket nyithatnak meg az energiaegyensúly általános szabályozásának megértése és a lehetséges új terápiák azonosítása érdekében.

Az SP1 energiamérlegben kifejtett hatásainak további vizsgálatához az UAS/GAL4 rendszer upstream aktivációs szekvenciáját felhasználva létrehoztuk a Drosophila humán SP1 transzgenikus modelljeit, hogy SP1 expressziót indukáljunk különböző lárva és kifejlett légyszövetekben. A Drosophilában nincs az emberi SP1 gén ortológusa. Így a transzgénikus Drosophila ideális rendszer az emberi SP1 hatásainak tanulmányozásához. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az emberi SP1 expressziójának hatását különböző légy neuronokban, amelyek szabályozzák az energiaegyensúlyt, beleértve a gal4 nélküli magzatokat, dopaminerg, szerotonerg és pan neuronokat. Kiértékeltük továbbá a humán SP1 expresszióját a zsír testekben és az inzulin peptid szekréciós sejteket a legyekben. Megmértük a zsírraktározást, a testsúlyt és a táplálékfelvételt az SP1 hatásainak értékeléséhez.

az eredmény

Az emberi SP1 expressziója növelte a legyek testtömegét

Az UAS/GAL4 rendszert használták humán SP1 transzgénikus legyek előállításához. 25, 26 Ebben a rendszerben az élesztő GAL4 transzkripciós faktor specifikusan kötődik az UAS-hoz. Így az UAS-asszociált transzgének specifikus sejttípusokban expresszálhatók egy adott promoter (GAL4 promoter) irányítása alatt. Ezt a nemrég kifejlesztett célzott integrációs módszert alkalmazták a transzgén pozicionálás hatásának leküzdésére és magas expressziós szintek elérésére. 19., 20. Ennek a módszernek az az elve, hogy egy cigány retrovírus izolátor alkalmazása megbízhatóan termeli a magas szöveti expressziójú transzgéneket. A hatékonyság érdekében a cigány transzgéneket meghatározott helyekre kell célozni, például az attP-re, hogy elérjék a legmagasabb indukciós szintet, és semleges nukleáris promoterekkel együtt kell használni a szigorú bazális szabályozás biztosítása érdekében. A humán SP1 gént egy UAS-attB vektorba klónoztuk, amely attB helyet tartalmaz (1a. Ábra). A kapott konstrukciót együtt injektáltuk phiC31-integráz RNS-szel, hogy keresztezzük az attP leszállóhelyeket tartalmazó csíravonalat (attP40), amint azt korábban leírtuk. 19., 20. Az UAS-SP1 repülési vonal genetikai térképezéssel jött létre.

Az SP1 növeli a transzgén legyek zsírtartalmát

A TAG és a glikogén a legyekben tárolt energia fő intracelluláris formája. Felnőtt legyeknél a humán SP1 expressziója dopaminerg neuronokban szignifikánsan megnövelte a TAG-tartalmat (2a. És b. Ábra), de a glikogéntartalmat nem változtatta meg (2c. Ábra). Annak értékelésére, hogy az SP1 expressziója a dopaminerg idegsejtekben növeli-e a fejlõdõ zsírraktározást, lebegõ tesztet alkalmaztunk, a Drosophila lárvák testzsírtartalmának közvetett tesztjét, amelynek alapja az volt, hogy a magasabb zsírtartalmú egyedek jobb oldatban úsznak, mint a rögzített sûrûség, mint a szegény egyének a zsírlárvák felhajtóerő-sűrűsége nagyobb úszási sebességet eredményez 9% -os szacharóz-oldatban. Amikor a lárvákat 9% -os szacharóz-oldatba merítettük, a legtöbb nem transzgén legy csökkent, míg a ddc-GAL 4 lárvák csökkentek; Az UAS-SP1 állatok úsztak (3a. Ábra). A ddc-GAL4, UAS-SP1 állatok és a nem transzgén kontrollok VD instar lárvamotilitási aránya 71, illetve 6% volt (3b. Ábra).

A Synphilin-1 megnövelte a TAG-t és a glikogént a felnőtt legyeknél. Felnőtt nem transzgén és ddc-GAL4 homogenizátumok; Az UAS-SP1 transzgén legyeket 10 napos korban teszteltük TAG-re ( a, b ) vagy glikogén ( c ). A triacil-glicerin és a glikogén szintjét a fehérje szintjére normalizáltuk, és a nem transzgén kontrolllegyek szintjéhez viszonyítva mutatjuk be (pUASTattb-synphilin-1). A hibasávok az egyes csoportok 40 állatának független, független mintáit képviselik; * P

A Synphilin-1 fokozta a zsír tárolását a lárvák harmadik szakaszában. ( a, b ) Az SP1 felhajtóerő-alapú sűrűség-teszt alkalmazásával fokozta a zsírlerakódást a harmadik fokú lárvákban. A nem transzgén lárvákat és az SP1 lárvákat 9% -os szacharóz-oldatba merítettük műanyag küvettákba, és az egyensúly elérése után lefényképeztük. a ) Úszó tesztek képei. ( b ) Ezen genotípusok esetében az átlagos flotációs pontszámot (az úszó lárvák% -a) három független replikátumból számoltuk, minden kísérlethez felhasználva

20 lárva szacharózba merítve. A hibasávok a * P 17, 18 jelet képviselik, mivel ez az emlős szerv hiányzik a rovarokban. A zsír test az energia tárolásának és mobilizálásának végrehajtó szerveként működik az energiaegyensúly szabályozásában az agy neuroendokrin rendszerének humorális jeleire reagálva. A lárva zsírteste meghatározott számú nagy poliploid sejtből áll, amelyek egyetlen szomszédos szervlevelet alkotnak, amely a testüregben átnyúlik és hipertrófiával reagál a tápanyagfeleslegre. Ezek a poliploid sejtek többnyire lipidcseppekből állnak (tele trofocitákkal). A zsírsejtek mérete szignifikánsan megnőtt a humán SP1-et expresszáló lárvákban dopaminerg idegsejtekben a nem transzgén kontrollokhoz képest (3c. És d. Ábra). Zsírsejtméret ddc-GAL lárvákban; Az UAS-SP1 legyek körülbelül kétszeresére növekedtek. Ezenkívül ezekben az SP1 transzgénikus lárvákban a lipidcseppek mérete is növekedett a nem transzgén kontrollokhoz képest (3e. Ábra). A lárvák testhossza azonban nem változott az SP1 expresszióval (3f. Ábra).

Az SP1 növelte a táplálékfelvételt, de nem befolyásolta a mozgásszervi aktivitást.

Annak értékelésére, hogy az SP1-expresszió megváltoztatja-e a legyek kalóriabevitelét, CAFÉ-vizsgálatokat használtak a felnőtt legyek táplálékfelvételének mérésére az összes transzgénikus vonalban, amelyeknél a testtömeg nagyobb volt. Az SP1 neuronális expressziója szignifikánsan megnövelte a táplálékfelvételt transzgénikus vonalakban a nem transzgén kontrolllégyekhez képest (4a. És b. Ábra). Hegymászó teszteket és aktométer méréseket alkalmaztak a legyek mozgásszervi aktivitásának megfigyelésére, az energiafogyasztás pótlásaként. A mászási tesztekben nem volt különbség a ddc-Gal4, az UAS-SP1 és a nem transzgén kontrolllégyek között, bármely életkorban (4c. Ábra). Annak értékelésére, hogy az SP1 változások megváltoztatják-e az általános aktivitást, aktométeres vizsgálattal értékeltük a mozgásmodellt 10 napos légyekben 12 órás sötét/12 órás ciklus alatt. A legyek két aktivitási csúcsot mutattak. Az SP1 expressziója a dopaminerg idegsejtekben nem befolyásolta a maximális aktivitás vagy a teljes mozgásszervi aktivitás idejét vagy gyakoriságát (4d. Ábra).

A Synphilin-1 megnövelte a táplálékfelvételt felnőtt legyeknél. ( a, b ) A CAFÉ-tesztet használták egy 5 napos légy bevitelének 1–5 napos megfigyelésére. Minden légy napi táplálékfelvételét feljegyezték. Az adatok átlag ± sem ( a ) napi táplálékfelvétel; b ) kumulált táplálékbevitel 48 órán keresztül. Jelentős különbségek az SP1 transzgén legyek és a nem transzgén kontroll egerek között, amint azt jeleztük, * P

A légysejtek SP1-expressziója jelentősen megnövelte a táplálékfelvételt a nem transzgénikus legyekhez képest. Az SP1 expresszió azonban nem változtatta meg a mozgásszervi aktivitást, ami arra utal, hogy az SPf által kiváltott hyperphagia vezet súlygyarapodáshoz és fokozott zsírraktározáshoz. Ezek az eredmények összhangban állnak a humán SP1 transzgénikus egérmodell 16 korábbi eredményeivel, amelyben az emberi SP1 neuronokban való expressziója növelte az élelmiszer-bevitelt, a testsúlyt és a testzsírt. Az SP1 transzgénikus egerek páros etetése a nem transzgén egér által 10 hétig elfogyasztott táplálékmennyiséggel normalizálta az elhízás fenotípusait, bizonyítva, hogy az elhízás másodlagos a megnövekedett táplálékbevitel miatt.

Összefoglalva, bebizonyítjuk, hogy az emberi SP1 neuronlegyekben történő expressziója elhízás-szerű fenotípusokat okozott, beleértve a súlygyarapodást, a testzsírt (TAG-tartalmat), az étel bevitelét és az éhséget. Ezek a fenotípusok a transzgenikus legyekben voltak a legnyilvánvalóbbak, amikor az SP1 dopaminerg neuronokban expresszálódott. Az SP1 növelte a zsírtestek és a lipidcseppek méretét, csökkentette a lipin gén expresszióját és csökkentette a lárvák mozgásának sebességét a szacharózban. Eredményeink azt mutatják, hogy az SP1 expresszió pozitívan szabályozza az energia homeosztázisát. Ezek az eredmények hasznos új modellt is nyújtanak az elhízás patogenezisének további megértéséhez, valamint az elhízás megelőzésére és beavatkozására szolgáló új gyógyszerek kifejlesztéséhez.