elemeket

absztrakt

Négy európai populációban (n 5000) vizsgáltuk a gén-gén kölcsönhatásokat (epistasis) az emberi test indexben (BMI). Arra a következtetésre jutunk, hogy az episztázis elemzése több, a genom egészére kiterjedő populációban hatékony megközelítés a BMI genetikai szabályozásával kapcsolatos új betekintés megszerzéséhez, de további erőfeszítéseket igényel az eredmények megerősítéséhez.

epizódjának

A testtömeg-index (BMI) a leggyakrabban alkalmazott antropometriai módszer az emberi elhízás meghatározására. A BMI egy összetett tulajdonság, amelyet számos környezeti (pl. Étrend, életkor, fizikai aktivitás) és genetikai tényező befolyásol, az öröklődés becslése a kettős vizsgálatokban 40–80%, a családi vizsgálatokban 20–50%, a családtanulmányok.tanulmányok a csoportban. a tanulmány. 1 A nemrégiben végzett, nagy genom társulással (GWA) végzett vizsgálatok sikeresen azonosítottak számos egy nukleotid polimorfizmust (SNP), amelyek szorosan összefüggenek az elhízással kapcsolatos jellemzőkkel, beleértve a BMI-t is. 2, 3, 4 Megvilágítják az elhízás biológiai alapjait, és javasolják a neuronális hatások szerepét az étvágyszabályozásban és/vagy az energiaegyensúlyban. Az együtt azonosított genetikai variánsok azonban a tulajdonság variációinak csak egy kis részét magyarázzák, ezért korlátozott prediktív értékkel rendelkeznek az elhízás kockázatára nézve. 5 Például egy nemrégiben végzett meta-elemzésben (249 796 egyén) 32 azonosított és replikált SNP-t az egyének közötti BMI-variációnak csak az 1,45% -át magyarázták együtt, a legerősebb SNP pedig csak 0,34% -os varianciát jelent. 3 32 BMI SNP 32 különböző gént térképez fel, a továbbiakban BMI lokuszoknak nevezzük.

A gén-gén kölcsönhatásokat (epistasis) a megmagyarázhatatlan genetikai variációk lehetséges forrásainak tekintik (6, 7, 8), de a BMI-vel kapcsolatos eddigi GWA-vizsgálatok során nagyrészt felderítetlenek maradnak. Az episztáziselemzés legfőbb akadálya a GWA-vizsgálatokban az volt, hogy nem léteznek gyors módszerek az interakciós tesztek milliárdjainak kiszámítására egy teljes páros genom-szkennelés során, hogy feltérképezzék a különböző típusú episztázisokat (pl. Nagyobb hatásokkal vagy anélkül), miközben hamis pozitív értékeket tartanak fenn. kordában tartva. 9., 10. Az episztázis vizsgálatának másik akadálya a viszonylag kis mintaméret számos létező GWA-kohorszban, ami korlátozhatja az episztatikus jelek észlelésének és replikálásának képességét, hacsak a kimutatható episztatikus hatások nem nagyok. A szimuláció kimutatta, hogy több mint 4000 pár esetre és kontrollra volt szükség a 80% -os epistais kimutatási képesség eléréséhez a szükséges 3,0 arány mellett komplex betegségek esetén. A kvantitatív tulajdonságokhoz a mintanagyságnak szignifikánsan (pl. 45% -kal) nagyobbnak kell lennie, mint az eset és az esetkontroll fenotípusai, hogy hasonló erőt érjen el. 14

A számítástechnika fejlődésével a fő akadály fokozatosan felszabadul, és a teljes páros genom-szkennelést egyenként kezdik alkalmazni a GWA populációkra. A GWA 3 vizsgálatokban használt episztázis metaanalízise jó módszer lehet a minta nagyságának leküzdésére, de új módszerekre van szükség az imputált SNP genotípus adatok adaptálásához. Különböző megközelítések a keresési hely csökkentésében (azaz a szigorúbb szignifikancia küszöbértékek a sokkal kevesebb teszt miatt) felhasználhatók az epizódok detektálásának képességének javítására az egyes GWA populációkban. Jelentős lokuszokat (marginális hatásokat) magában foglaló, a genomok széles skálájával járó vizsgálati interakciókat a tesztek tényleges számával korrigált küszöbértékkel 10, 17, 18 javasoltak, és a legújabb tanulmányokban sikeresen alkalmazták. 16, 19, 20, 21 Egy másik megközelítés az SNP-k kiválasztása a meglévő biológiai ismeretek (pl. Fehérje-fehérje kölcsönhatások) alapján, és csak a közöttük lévő kölcsönhatások tesztelése. Az SNP 12 kiválasztásakor azonban körültekintően kell eljárni, mivel a biológiai ismeretek nem feltétlenül kapcsolódnak közvetlenül a vizsgált tulajdonsághoz, és az előre meghatározott lokusok esetleges előítéletei hamis pozitív episztatikus jelekhez vezethetnek.

Itt egy másik megközelítést mutatunk be az episztázis értékének kiaknázására egy nagy populáció elemzésén keresztül. Először teljes páros genom vizsgálatot végeztünk a BMI epizódjaira négy olyan GWA populációban, amelyekhez közvetlen hozzáférésünk volt: skót ORCADES, 24 CROATIA-Vis 25 és CROATIA-Korcula, 26, valamint a MICROS 27 olasz vizsgálati csoport. E csoportok mindegyike viszonylag kis mintamérettel rendelkezik, és különböző európai régiókból vesznek mintát, nagyon eltérő életmóddal és étrenddel. Másodszor, azonosítottuk a gyakori és potenciálisan fontos gén-gén kölcsönhatásokat az egyes kohorszokban feltárt episztatikus jelek és azok dúsulása révén a gének ontológiájában (GO) a populációkban. Ezenkívül meghatároztunk egy sor interakciót, amelyek a BMI lókuszokat (mint korábbi megállapításokat) érintették különböző kohorszokban. Harmadszor, teszteltük az azonosított kölcsönhatásokat az egyes replikációs kohorszokban, majd a replikált jeleket Észak-Finnország 1966 natív kohorszában (NFBC1966). 28 Célunk az a kérdés megválaszolása, hogy az epistasis elemzés releváns-e a BMI genetikai szabályozásának boncolása szempontjából ezekben a vizsgálati csoportokban.

Anyagok és metódusok

Tanulmányi csoportok és etikai nyilatkozat

A négy vizsgálati csoportot másutt részletesen leírták. Röviden: az ORCADES skót csoportot az Orkney-szigetcsoport 10 szigetéből álló alcsoportból fogadták el. Ezt a tanulmányt az NHS Orkney Kutatási Etikai Bizottsága és Észak-Skócia REC jóváhagyta. A HORVÁTORSZÁG-Vis és a HORVÁTORSZÁG-Korcula kohorszokat Vis szigetére és Korcula szigetére engedték be. Mindkét tanulmányt jóváhagyta az Orvostudományi Kar Etikai Bizottsága, a Zágrábi Egyetem és a Skóciában működő Multikulturális Kutatási Etikai Bizottság. A MICROS olasz csoportot Dél-Tirol egy elszigetelt hegyvidéki területének falvaiból kapták. A tanulmányt Bolzano Autonóm Tartomány Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Valamennyi résztvevő írásos beleegyező nyilatkozatot adott, és megmérték a karakterek számát, beleértve a súlyt és a magasságot, amelyből a BMI értékeket kiszámították.

Asztal teljes méretben

Statisztikai analízis

A nyers BMI-adatokat mind a négy vizsgálati csoportban kor és nem alapján korrigálták és normalizálták a transzformációs függvény segítségével, amely a GenABEL csomagban valósul meg, amely kvantilis szermaradék-normalizálást végez az általánosított lineáris modellanalízisből. Ezután a normalizált BMI-maradékokat lineáris kevert modell alkalmazásával elemeztük a GenABEL csomagban található poligénfüggvény használatával a rokonságból adódó poligénhatások korrigálása érdekében, és a kapott környezeti maradványokat (azaz pgresidualY a GenABEL-ben) markerként használtuk az asszociáció tesztelésére. A poligén öröklődést a vegyes modell lépésben becsültük meg. Az eredeti GWA vizsgálatot követően az NFBC1966 csoportba tartozó 28 beteget kizárták a terhességből és/vagy külön jelentett BMI-mérésekből, és a nyers BMI-értékeket korrigálták a SexOCPG-re (nem, orális fogamzásgátló státusz és terhesség alapján számítva), majd normalizálták és rokonságra korrigálva a fentiek szerint.

Az SNP alapú GWA szkennelést minden populációban elvégeztük egy pontszám tesztelési módszerrel (az additív modell alapján), amelyet a GenABEL csomag mmscore funkciójában valósítottunk meg. A 7, 3 GWA konszenzus küszöböt alkalmaztuk a jelentős GWA SNP-k azonosítására (−log 10 (5, 0E-08)). 32 Az alábbiakban ismertetett regressziós modellek segítségével elvégeztünk egy teljes páros genomi szkennelést is. Az SNP 1-nek és SNP 2-nek jelölt SNP-pár vonatkozásában a következő genetikai modelleket használtuk fel az epizód kimutatására, ahol az egyes SNP-k genotípusait (azaz kisebb allél homozigóta, fő allél homozigóta és heterozigóta) használták fix tényezőként:

ahol y az érdeklődés jele, μ egy modellállandó, az SNP 1 (vagy az SNP 2) három tényezővel rendelkező fix tényező (genotípus osztályok), az SNP 1 * az SNP 2 kölcsönhatás kifejezés, e egy véletlenszerű hiba kifejezés. Az 1. modell F-tesztje a 3. modellhez viszonyítva értékeli az egész pár hatását, beleértve az interakciót is (azaz F pár, 8 szabadságfok). Az 1. modell F aránytesztje a 2. modellel szemben két SNP kölcsönhatását értékeli (azaz F int, 4 szabadságfok). A P értékeket az F eloszlása ​​alapján számítottuk ki a megfelelő szabadságfokokkal, és átalakítottuk őket −log 10 skálára (azaz −log 10 P párra az F pár teszthez, −log 10 P int az F int tesztre). . Ebben a tanulmányban elsősorban az F int tesztekre összpontosítottunk .

A teljes genomban (mind a −log 10 skálán) szignifikáns küszöbértékeket származtattunk a Bonferroni-féle korrekció alapján, több vizsgálatra, azaz 5% -os névleges P-értékre korrigálva az elvégzett tesztek számával. Figyelembe véve a 300 000 SNP-t, teljes kettős ellenőrzést végez a 4, 5E + 10 genom asszociációs teszteken, és az 5% -os genomiális határérték tehát 11,95 (azaz −log 10 (0,05/4, 5E + 10)). Minden egyes párosított genomvizsgálat után az eredményeket egy előre meghatározott küszöbérték alkalmazásával értékeltük, hogy azonosítsuk a jelentős széles genom interakciós jeleket. Az eredmények mindegyik SNP-jét a legközelebbi génhez annotáltuk az SNP-ket szegélyező 20 kilobázisú ablakban (a génátírás elejétől vagy végétől számított fizikai távolság alapján; a távolságot nullának tekintjük, ha az SNP a génen belül van).

A GO-dúsítás elemzését minden vizsgálati kohorszon elvégeztük a Gorilla 33-ban futó "Két nem kötött génlista" mód használatával, a standard hipergeometriai statisztikák alapján, ahol annotált episztatikus géneket használtunk célpontként az emberi gének teljes listájával. mint háttér. Az egyszerűség kedvéért úgy döntöttünk, hogy ugyanazt a −log 10 P értéket használjuk, mint a GWA konszenzusküszöböt (azaz −log 10 P int> 7.3), hogy kiválasszuk az egyes kohorszok SNP párjait, és gén annotációikat felhasználjuk bemenetként a GO dúsítási elemzéshez., Az egyes vizsgálati csoportokban dúsított GO kifejezéseket (P 7.3) szintén potenciálisan fontos interakciós jelként azonosították a replikációs vizsgálatokhoz.

Jelentős SNP genom párokat és potenciálisan fontos kölcsönhatásként azonosítottakat replikációra négy vizsgálati csoportban teszteltünk. A replikált SNP párokat tovább teszteltük a replikációra az NFBC1966 kohorszban. Mindegyik replikációs vizsgálatot SNP szinten, valamint a régióban végeztük. SNP szinten mindegyik replikált SNP pontosan megegyezett a megfelelő episztatikus SNP-vel, ezért 5% -os nominális szignifikancia küszöböt alkalmaztunk (azaz 10log 10 (0,05) = 1,30), mert csak egy replikációs vizsgálatra volt szükség. A régió szintjén az első episztatikus SNP 10 szomszédos SNP-je (azaz öt upstream és öt downstream) és a második epizatikus SNP mindegyikének kölcsönhatását tesztelték olyan helyzetek befogadására, amikor több SNP ugyanazon mutáns mutánsot jelölheti. gen. A permutációt alkalmaztuk az egyes episztatikus párok replikációjának szignifikancia küszöbértékeinek levezetésére azon régió szintjén, ahol a fenotípusok permutáltak, és a legmagasabb - log 10 Pint 121 (azaz 11 × 11) interakciós vizsgálatokat rögzítettük az 1000 iteráció mindegyikében. A replikált SNP párokat teljes modellbe egyesítettük, hogy kiszámítsuk az egyes vizsgálati csoportokban kifejtett fenotípusos variancia arányát.

az eredmény

Az átlagos BMI hasonló volt a CROATIA-Vis, CROATIA-Korcula és az ORCADES kohorszokban, de alacsonyabb volt a MICROS-ban (1. táblázat). A poligénes öröklődés becslései 0,356 (CROATIA-Vis) és 0,514 (ORCADES) között változtak. A hagyományos GWA-vizsgálat egyetlen kohorszban sem talált szignifikáns SNP-ket a teljes genomban. Az egyes GWA-vizsgálatok lambda-inflációs tényezője (amelyet a megfigyelt asszociációs P-értékek várható értékkel való regressziójával számítottunk ki) nagyon közel volt az 1-hez (1. táblázat), ami azt jelzi, hogy az egyes kohorszok családi rokonságát jól figyelembe vették. A korábban azonosított 32 BMI SNP közül csak 8 volt 3 genotipizálva négy vizsgálati csoportban, és egyik sem mutatott szoros kapcsolatot a BMI-vel (S1 kiegészítő táblázat).

A teljes páros genom-vizsgálat azt találta, hogy a négy vizsgálati csoport egyikében sem volt olyan SNP-pár, amely átlépte volna a széles genomküszöböt (−log 10P int = 11, 95) (1. ábra). A –log 10Pint> 7, 3 interakciós jelek miatt a MICROS-nak volt a legkevesebb SNP-párja, és ezután a legkevesebb az annotált gének száma, míg a többi három kohorsznál viszonylag hasonló volt az SNP-párok és az annotált gének száma (2. táblázat ). A 32 BMI-lokusz közül öt (de nem a BMI SNP) 7 episztatikus párban vett részt Horvátországban: FTO, KCTD15, LRP1B, NEGR1 és PRKD1. Hasonlóképpen három BMI lókusz (NEGR1, NRXN3 és PRKD1) volt bevonva a HORVÁTORSZÁG-Korcula, kettő (FTO és MTCH2) az ORCADES-ben és kettő (FTO és LRP1B) a MICROS-ban.

Párosítsd az episztatikus jeleket minden vizsgálati csoportban. a ) párosított episztatikus jelek a CROATIA-Vis-ben. ( b ) párosított episztatikus jeleket HORVÁTORSZÁG-Korcula. ( c ) párosított episztatikus jeleket ORCADES-ban. ( d ) párosított episztatikus jeleket a MICROS-ban.

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

Az egyes kohorszokban episztatikus génekkel dúsított GO kifejezéseket (−log 10Pint> 7.3) összehasonlítottuk (S2 kiegészítő táblázat), és azonosítottunk mind a négy kohorszban 9 közöset (3. táblázat), amelyek közös szabályozási mechanizmusokat jelezhettek (pl. GO: 0008038 - felismerő neuronok ). A 9 GO kifejezéseket gazdagító episztatikus gének közül 19 episztatikus gént találtunk, amelyek négy kohorszon osztoztak, amelyek közül 15 korábban már publikált GWA-lokusz (többnyire genomikailag nem szignifikáns), amelyek a 34 különböző fenotípusokhoz kapcsolódtak (S3 kiegészítő táblázat). A 19 megosztott episztatikus gén nagy része kölcsönhatásba lépett egymással, bár kölcsönhatásaik viszonylag gyengék voltak (−log 10P int 35 és SORCS2 (VPS10-hez kapcsolódó válogatás). Receptort tartalmazó receptor 2), amelyek a keringő inzulinszerű növekedési faktor 1-hez és a fehérje- 3 megkötő inzulin növekedési faktor-3, amelyek fontosak az antropometriai jellemzők, valamint a rák és a szív- és érrendszeri betegségek kockázata szempontjából. 36

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

vita

Ezen potenciálisan fontos kölcsönhatások lehetséges zajainak tudatában replikációt alkalmaztunk a legmegbízhatóbb episztatikus jelek azonosítására a vizsgálati csoportokon belül. Nyolc, akár BMI-lokuszokat, akár két közös episztatikus gént tartalmazó episztatikus pár replikációt mutatott SNP szinten legalább egy kohorszban (4. táblázat). A nyolc episztatikus pár együtt valóban megmagyarázhatja az egyes kohorszok BMI-változásának nagy részét. Mindazonáltal óvatosság ajánlott, tekintettel a "győztesek átkának" hatásainak esetleges túlértékelésére. 39 Ezenkívül a nyolc episztatikus pár egyikét sem replikálták mind a négy vizsgálati csoportban, vagy az NFBC1966 replikációs kohorszban. További replikációs vizsgálatok más populációkban és/vagy funkcionális vizsgálatok hasznosak annak igazolására, hogy ezek valódi jelek-e.

A statisztikai replikációt aranyszabályként alkalmazták, hogy elkerüljék a hamis pozitív eredmények jelentését a GWA-vizsgálatokban. Ez azonban sokkal nehezebbnek tűnik az episztatikus jeleknél, mint az egyes SNP jeleknél, olyan okok miatt, mint a teljesítmény, a kisebb allél frekvenciaváltozása, valamint az episztatikus SNP és a mutáns kapcsolatának egyensúlyhiánya mindkét lokuszban. Enyhe −log 10 A replikációra tesztelt episztatikus párok pist értéke azt sugallja, hogy az episztatikus SNP-k és mutánsok közötti kötési egyensúlyhiány nem magas, így ezeknek a pároknak a replikációja nehéz lesz. Ezenkívül a különböző környezetek a fenotípusok eltérő eloszlását okozhatják a felfedezési és replikációs kohorszokban. A replikáció hiánya az NFBC1966 kohorszban a BMI két fontos környezeti tényezőjének tudható be: 40 éves életkor (azaz 31, szemben a vizsgálati csoportokban a 18 és 90 közötti tartományban) és az étrend. 29.

A többszörös GWA-populációkban alkalmazott közös gén-gén kölcsönhatásokon alapuló megközelítés hatékony megoldás az episztázis kimutatásának korlátozott képességére. Ez csak részleges megoldás, mivel néhány figyelmen kívül hagyott interakció is fontos lehet. A jelentős episztatikus jelek összehasonlítása a genomban elvégezhető akár SNP-szinten, akár gén- vagy útvonal-szinten, és eredményesebbnek bizonyulhat gén- vagy útvonal-szinten, mint az SNP-szint. A megközelítés hasznosabbá válhat, ha jobb annotációs módszerek (csak kölcsönhatások nélküli GWA-jeleket figyelembe véve) 41 alkalmazhatók az epizódhoz. Például a vizsgálatban nem minden episztatikus SNP volt annotálva a génekhez, ezért nem járult hozzá a dúsítási elemzéshez. Ez a megközelítés valószínűleg akkor is fontos, ha új episztázis meta-analízis eszközök állnak rendelkezésre a GWA adatkészleteiben az episztázis detektálási teljesítmény növelése érdekében.