elemeket

absztrakt

Vizsgálatunk célja nem invazív prenatális teszt kifejlesztése volt autoszomális recesszív monogén állapotokra, valamint annak általános megvalósíthatóságának és klinikai integrációs lehetőségének bemutatása.

mód:

Örökbe fogadtunk egy terhes nőt és férjét, akiknek egy proband gyermeke veleszületett süketségben szenvedett, és egy olyan félig szokásos mezőből nyertünk célrégiós szekvenálási adatokat, amely e család három generációjának genomi és anyai plazma DNS-ét használta. Haplotípussal támogatott stratégiát dolgoztak ki annak meghatározására, hogy a magzat öröklődött-e a kórokozó GJB2 gén kórokozó mutációiban. A szülői haplotípust egy trió stratégia felhasználásával állítottuk össze, két különböző folyamat felhasználásával, nevezetesen a nagyszülő és asszisztált haplotípus fázisos folyamat és a proband által segített haplotípus fázisos folyamat segítségével. A magzati haplotípust ezután az anyai plazma és a szülő haplotípus szekvenálási adataiból származtatták.

az eredmények:

Az apai és az anyai haplotípusok pontosságának szintje a nagyszülő által segített haplotípus fázisba állításával 99, 01 volt. 97, 36%, és a probandummal segített haplotípus fáziskezelési eljárása valamivel alacsonyabb pontosságot, 98, 73 és 96, 79% -ot eredményezett. A kórokozó gén magzati öröklődését mindkét folyamatban helyesen vezették le.

következtetés:

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a haplotípuson alapuló, non-invazív prenatális tesztelés stratégiája monogén állapotokra potenciálisan alkalmazható a klinikai gyakorlatban.

Genet Med 16. 12, 972 - 976.

A fő

Mivel emlős magzati DNS-t (cffDNS) fedeztek fel az anyai keringésben, különféle nem invazív prenatális vizsgálatokat fejlesztettek ki a hagyományos invazív mintavételi eljárások által jelentett kockázat elkerülése érdekében. 1, 2, 3, 4, 5, 6 A nem invazív szekvencia alapú technológiák a citogenetikai szintet célozzák meg, gyorsan fejlődnek és klinikailag rendelkezésre állnak. 4.5 A monogénes betegségek kezelésére szolgáló technológiák azonban még mindig a kísérleti laboratóriumi fázisban vannak. 7, 8, 9, 10

Korábbi tanulmányunkban 10 olyan robusztus matematikai modellt javasoltunk, amely egyetlen lépésben képes pontosan helyreállítani a magzati genotípust és a magzati haplotípust, így elérve a magzati genom teljes jellemzését. Ezt a vizsgálatot azonban szigorú mintakövetelmények korlátozták, és tényleges klinikai minták nem erősítették meg.

Ebben a tanulmányban vérmintákat vettek egy terhes nőtől és a családja három generációjának közeli hozzátartozóitól, köztük nagyszülőktől, szülőktől és egy proband nővértől, hogy veleszületett süketségre vonatkozó nem invazív prenatális vizsgálatokat végezzenek. Háromstratégia felhasználásával konstruáltuk a szülői haplotípusokat, és sikeresen elvégeztük a magzati állapot prenatális tesztelését, nagyszülőktől vagy probandoktól kapott információk felhasználásával. Vizsgálatunk megbízható gyakorlati módszert nyújt a veleszületett süketség nem invazív prenatális vizsgálatára anyai plazma szekvenálással.

Anyagok és metódusok

Mintavétel és ok-okozati mutációk azonosítása

Örökbe fogadtunk egy terhes nőt, feleségét és családjának három generációját, akik között volt egy proband lánya is, akinek audiogramjai súlyos vagy mély kétoldalú halláskárosodást mutattak. Genetikai tanácsadást nyújtottak a családnak, és opcióként prenatális tesztet biztosítottak. A magzat veleszületett süketségének kockázata miatt a szülők nem invazív prenatális tesztet választottak. A tanulmány minden résztvevőjét elfogadta és tájékoztatott beleegyezést adott a Helsinki Nyilatkozattal összhangban. Az összes részt vevő intézmény megfelelő intézményi tanácsa etikai jóváhagyást adott. A perifériás vért és a magzatvizet egy terhes nőtől kaptuk a terhesség 17. és 18. hétében. Négy nagyszülő perifériás vérmintáját vettük a szülői haplotípus konstrukcióhoz. A polimeráz láncreakciót és a Sanger szekvenálást alkalmaztuk a mutációtípus elemzéséhez a GJB2 génben ( Kiegészítő S1 táblázat, valamint S1 és S2 ábra online). Az apa és az apai nagyapa a c.299delAT hordozói voltak. A terhes anya és az anyai nagyapa a c.235delC hordozói voltak. A próba a mutációk heterozigóta vegyülete volt.

Könyvtár előkészítése és szekvenálása

Mindkét szülő és mind a négy nagyszülő perifériás véréből származó genomiális DNS-jét szonikátorral fragmentáltuk. A méhplazmát kétlépéses centrifugálási protokoll alkalmazásával izoláltuk. A végső javítási és A-faragási folyamat befejezése után adaptereket ligáltunk a DNS-fragmensek mindkét végéhez. A DNS-kódot a polimeráz láncreakció során vezettük be minden egyes mintába a masszív párhuzamos szekvenálás érdekében. A megcélzott régió rögzítését egyedi tervezésű 181, 37 M NimbleGen EZ tömbön (a teljes exomot, 1 M egy nukleotid polimorfizmust (SNP-ket) és a fő hisztokompatibilitási komplex régiót tartalmazó) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az utófogási könyvtárakat az Illumina Hiseq 2000 platform segítségével szekvenáltuk, 90 bp páros végsorozattal.

Igazítás és SNP hívás

A szekvenált páros végleolvasásokat az emberi referenciagenomba (Hg19, GRCh37) térképeztük fel SOAP2 alkalmazásával. 11 A polimeráz láncreakció során felerősített leolvasásokat eltávolítottuk. Ezután SNP hívást indítottunk a célterület SOAPsnp szoftverének felhasználásával. A szűrési kritériumokat (lefedettség> 8 és minőségi érték> 20) a genomi genotípus pontosságának biztosítása érdekében állítottuk be.

A keringő cffDNS-koncentráció becslése

A mindkét szülőnél homozigóta, de eltérő genotípusú lókuszokon a magzati genotípus kötelező heterozigóta volt Mendel törvényei szerint. Így a magzati DNS frakcionális koncentrációja az anyai plazmában olyan lokuszokkal számolható volt, amelyek esetében az anyai genotípus homozigóta volt, és amelyekre a jósolt magzati genotípus heterozigóta volt. Leírható, mint az apától kapott magzatok specifikus alléljainak kétszerese és a többi allél teljes alapszáma aránya. 7, 10

A szülői haplotípus felépítése

A szülői haplotípust Mendel törvényén alapuló trió stratégia felhasználásával hoztuk létre. Az asszisztált haplotípus nagyszülők (GAHP) folyamatához apai haplotípust készítettek a szülők és nagyszülők hármasával. A proband-asszisztált haplotípus fázis (PAHP) folyamatához a szülői haplotípusokat apa, anya és proband hármasával állítottuk össze.

A magzati haplotípus következtetései

A veleszületett fetlotípus levezetéséhez a szülői haplotípusokból nyert kötési kapcsolatot és a plazmaszekvenciával kiszámított báziseloszlást használtuk. Minden lokuszra kiszámolták a jelölt haplotípus kombinációk valószínűségét. A gametogenezis folyamat rekombinációs jellemzői szerint a szomszédos helyek közötti távolság felhasználásával kiszámítottuk az átviteli valószínűségeket, hogy rejtett Markov-modellt hozzunk létre. Ennek a modellnek a dekódolása során a Viterbi algoritmust használtuk a rejtett állapotok legvalószínűbb szekvenciájának megtalálásához, valamint a magzat örökletes haplotípusának és rekombinációs jelenségeinek levezetéséhez. 13.

az eredmény

A szülői haplotípus megbékélése és felépítése

Miután elfogta a célterületet

A 20-30-szoros dúsítási termékeket 90 bp páros végszekvenálásnak vetettük alá ( Kiegészítő S2 táblázat online). Minden leolvasást összehangoltunk az emberi referenciagenommal, és SNP hívást hajtottunk végre. Az SNP információi szerint az anyai plazma cffDNS-koncentrációjának arányát 15,10% -ra becsülték.

A szülői haplotípusokat két stratégia felhasználásával állítottuk össze: a GAHP és a PAHP folyamatokat. A GAHP alkalmazásával a szülői haplotípusok 104, 91 Mb-os régióját sikerült sikeresen fázisba helyezni, 149 628 jelölt markert osztva el a genomban. A PAHP alkalmazásával sikeresen létrehozták a 104,93 Mb méretű régiót, amely 168167 jelölt markert tartalmaz.

A magzati haplotípus öröklésének levonása

Anyai plazmában egy rejtett Markov modellláncot hoztunk létre a szülői haplotípus és a plazma szekvenálási adatok felhasználásával ( 1.ábra ), amelyben a feltételeket valódi magzati genotípusok rejtették el, és a megfigyelt állapotok az anyai szekvencia mélységének és a magzati plazma genotípusainak keverékei voltak. A dekódolási folyamat után öröklött haplotípust és rekombinációs eseményeket kaptunk a magzatban. A GAHP-től kapott szülői haplotípust felhasználva 126 600 magzati lókuszt sikerült levezetni, és megállapítottuk, hogy a magzati örökletes haplotípus 33-szoros rekombinációval rendelkezik, az örökletes anya pedig 139-szeres rekombinációval. A PAHP stratégia alkalmazásával 146 103 lókuszt kaptunk 60- és 181-szeres rekombinációval az öröklött apai és anyai haplotípusban ( További S4 ábra és S3 táblázat online).

autosomális

Nem invazív prenatális tesztelési stratégia folyamatábra . ( a ) A család genetikai térképe. b ) a kísérleti folyamat és a bioinformatika folyamatábrája. cffDNS, sejtmentes magzati DNS; HMM, egy rejtett Markov-modell.

Teljes méretű kép

A becsült magzati haplotípus általános pontosságának becsléséhez létrehoztunk egy standard haplotípust egy trio stratégia felhasználásával, amely a szülőkről és a magzatvíz sejtekről tartalmaz információkat ( Kiegészítő S3 táblázat online). A GAHP alkalmazásával az apai haplotípus heterozigóta lókuszainak 98, 15% -át helyesen származtuk 67 978 lókuszon, az anyai hapotípus heterozigóta lókusainak 95% -át, 19% -át pedig 69 346 lókuszon. A PAHP esetében az eredmény helyes volt az apai haplotípus heterozigóta lókusainak 97,56% -án és az anyai haplotípus heterozigóta lókusainak 94,00% -ánál, ami körülbelül 1% -kal kevesebb, mint a GAHP stratégiával elért eredmények (online S1 és S4 táblázat online). ).

A haplotípus következtetési hibáinak értékelése

A PAHP eljárással nyert szülői haplotípus rekombinációt tartalmazott a probandumban. Így a PAHP-eredetű magzati haplotípust kétszer rekombináltuk. Magasabb rekombinációs eseményeket mutatott a GAHP-ből származó magzati haplotípushoz képest, ami több haplotípus hibát eredményezhet a rekombinációs események körül. A rekombinációs események ezen hatásának további vizsgálatához kiszámoltuk az egy-nukleotid variációk hibaarányát a genom minden 1 Mb-os régiójában ( További S4 ábra és S5 táblázat online). A GAHP folyamatban az apai haplotípus hibáinak 23, 87% -a, az anyai haplotípus hibáinak 11, 74% -a 1 Mb távolságra volt a töréspontok körül. A PAHP-folyamat során azonban az apai haplotípus hibák 30,12% -a és az anyai haplotípus hibák 23,66% -a koncentrálódott a magzati törések rekombinációs pontjai és 9,83% -a apai haplotípus hibák és 11,83% -a haplotípus hibák körül. Az anyai haplotípus hibáinak száma közel volt a proband rekombinációs pontjához. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a PAHP stratégia gazdagította a rekombinációs hibákat a probandból, ami alacsonyabb pontosságot jelzett a GAHP stratégiához képest.

A rekombinációs események hatása mellett következtetési hibák társultak a szülői haplotípus fázishibáival és a rendellenes cffDNS-koncentrációkkal is. A szülői haplotípus fázisos folyamatában a levezetési hibák oka lehet a nagyszülők, a szülők és a probandumok SNP-információinak alacsony minősége, és ezeket a fázis-folyamat lefedné. Ezért a szülők, a proband és a magzat haplotípusait használtuk fel a rekombinációs folyamat reprodukálásához, és számos olyan szórványos rekombinációs pontot találtunk, amelyek csak izolált rekombinációs jelet mutattak a 100 kb-nál kisebb területeken. A GAHP és PAHP stratégiákban a hibák körülbelül 29% -a érintette ezeket a lokuszokat, ami arra utal, hogy az SNP-k pontos meghatározása a genomi DNS-ben fontos a teljes elemzési folyamat szempontjából. A genomi DNS-sel ellentétben az anyai plazmában lévő cffDNS természetes lebontással fragmentálódott, amelyet az emberi genom instabil része jellemzett. Rendkívüli cffDNS-koncentrációs lókuszokat találtunk (a széles genomprofil 99% -os konfidenciaintervallumán kívül) és azt találtuk, hogy a hibák kb. 30% -a közeledett.

Nem invazív prenatális vizsgálat veleszületett süketségre

Prenatális vizsgálatot végeztünk veleszületett süketségre a GJB2 gén veleszületett haplotípusa alapján. Itt meghatároztuk a szülői haplotípusokat hap0 és hap1, hogy megkülönböztessük a patogenitást. A GAHP-ben az apai nagyapától örökölt apai patogén allélt f0-nak, a nem patogén allélt f1-nek nevezik. Az anyai patogén allélt m0-nak, a másikat m1-nek hívják. Egy rejtett Markov-modell kódolásához a magzati haplotípus öröklődése a GJB2 génhez képest f1 és m0 volt, jelezve, hogy a magzat a c.235 delC mutáció heterozigóta hordozója volt. A PAHP-ben, mivel a proband egy tipikus veleszületett süketségű beteg volt, a proband által örökölt szülői alléleket hap0-nak, a többieket pedig hap1-nek definiáltuk. Végül a GJB2 gén magzati haplotípusa szintén f1 és m0 volt, összhangban a GAHP stratégia kimenetelével ( 2. ábra ). A China General Hospital PLA (Peking, Kína) diagnózisáról szóló jelentés alátámasztotta következtetésünket ( további S3 ábra online). Ebben a vizsgálatban a genetikai teszt a magzati haplotípus elemzésén alapult a részletes genotípus helyett.

A veleszületett süketség nem invazív vizsgálatának eredményei . ( a ) A GAHP stratégiával nyert szülői allélok öröklődött útjai. ( b ) A PAHP stratégiával nyert szülői allélok öröklődött útjai ( c ) A GJB2 gén körüli lókuszok kibővített nézete mind a GAHP, mind a PAHP stratégiák segítségével; mindkét stratégia azt mutatja, hogy a magzat örökölte a hap f1 és hap m0 allélokat. Minden grafikonon a kék elemek a szülő alléljait, a piros elemek pedig az anyai allélokat jelentik (a világos színek a nagymamáktól, a sötét színek a nagyszülőktől való öröklődést jelzik). A nulla alatti vonalak (fekete vonalak) azt jelzik, hogy a magzat örökli a kórokozó allélt, a nulla feletti vonalak pedig azt, hogy a magzat örökölte a jóindulatú allélt. GAHP, a nagyszülők haplotípus-fázisa; PAHP, proband-segített haplotípus fázis.

Teljes méretű kép

vita

A felnőttek körülbelül 1% -a hordoz mutáns allélt. Az újszülöttek körében a mutáns allélek együttesen a csecsemőhalandóság mintegy 20% -át és

A gyermekek kórházi kezelésének 10% -a. A társadalom egészének életminőségének javítása érdekében hatékony diagnosztikai módszerek, különösen a prenatális diagnózis kidolgozására van szükség. A veleszületett süketség gyakori klinikai genetikai rendellenesség, újszülötteknél 1-3% -os előfordulási gyakorisággal. A korai prenatális halláscsökkenési tesztek több képzési lehetőséget nyújthatnak a családoknak, és időt adhatnak a genetikai terápia megalapozására a közeljövőben. 17, 18, 19

Ebben a tanulmányban háromlépcsős stratégiát alkalmaztunk nagyszülőkkel vagy probandokkal, beleértve a GAHP és a PAHP módszereket. Mindkét módszer képes volt azonosítani a helyes szülői haplotípusokat, hogy biztosítsa a kötődési kapcsolatot egy veleszületett magzati haplotípus levezetéséhez, bár a PAHP pontossága alacsonyabb volt az utódokban végzett rekombinációs felhalmozódás miatt. Módszerünk ezért alkalmas a Mendel-kórban szenvedő családok nem invazív prenatális vizsgálatára, amely a nagyszülők vagy probandok szülői haplotípusaiból származhat. Másrészt a cél genomi DNS szekvenálása nem igényel semmilyen bonyolult kísérleti eljárást, mint például a korábban leírt haplotípus-támogatott módszerek, és költséghatékony, ha megfelelő tömböt tervezünk. Az átfutási idő, beleértve a mintavételi és tesztelési folyamatot a HiSeq2500 platformon, szintén kevesebb, mint 1 hét lehet, és a bioinformatikai elemzés 1 napon belül elvégezhető, biztosítva ezt a fajta eljárást nagy klinikai alkalmazásokhoz. 8, 9

Ennek a módszernek azonban még mindig számos hiányossága van, amelyet figyelembe kell venni. Először egy szülői haplotípust hoztunk létre, egy trió szekvencia adatai alapján, egy családban, ami erősen korlátozza módszerünk megvalósíthatóságát az egyszülős családok számára, amelyek esetében ezek az adatok nem állnak rendelkezésre (bár a legtöbb klinikai esetben az érintett gyermek beteg). a prenatális vizsgálat oka). Másodszor, tesztelésünk a betegség és a kapcsolódó gén közötti végleges relevancián alapult, így csak olyan betegségek esetén alkalmazható, amelyek esetében a betegség kórokozó génjét teljes mértékben megvizsgálták. Ezért módszerünk elsősorban Mendel genetikai rendellenességeire alkalmazható. A de novo mutációk azonosítására még hatékony algoritmusokat kell kidolgozni. Jelentős etikai kérdések is társulnak a prenatális genom nem invazív meghatározásához, különösen, ha átfogóbb és kényelmesebb módszerek felé haladunk. Számos olyan klinikai forgatókönyv létezik azonban, amelyekben ez a megközelítés hasznos lehet, beleértve a halálos kimenetelű betegségek vagy állapotok tesztelését, amelyek más egészségügyi komplikációkhoz vezethetnek.

Összességében ígéretes, nem invazív prenatális tesztelési stratégiát javasoltunk a veleszületett süketségre az anyai plazma masszív párhuzamos szekvenálásával. Az ebben a tanulmányban leírt haplotípus-alapú megközelítés kiterjeszthető a legtöbb monogén betegség nem invazív prenatális vizsgálatára.

közzététel

XL, HG, FC, YZ, WX, XP, SC, PL, CZ, JC, HJ, XX és WW a BGI-Shenzhen alkalmazottai. Más szerzők nem jelentenek be összeférhetetlenséget.