elemeket

absztrakt

Az antitest-gyógyszer konjugátumok (ADC) vagy az immunkonjugátumok a célzott rákterápia új gyógyszercsoportjának bizonyultak. Az ADC egy háromkomponensű rendszer, amelyben egy terápiás monoklonális antitest (mAb) és egy erős kis molekulájú citotoxikus gyógyszer konjugálódik egy stabil linkeren keresztül. Az MAb specifikusan felismeri a szignáltranszdukciót gátló ráksejteken egy felszíni antigént/receptort. Eközben az ADC komplex ráksejtekbe beépül, ahol az antitest lebomlik és a citotoxikus gyógyszer felszabadul. Ez az egyedülálló kialakítás nemcsak jelentősen csökkenti a citotoxikus gyógyszerek mellékhatásait, hanem lehetővé teszi a citotoxikus gyógyszerek dúsítását a rákos sejtekben 3. A két ADC-t, a brentuximab-vedotint és az adotrastuzumab-emtansint, az FDA jóváhagyta a lymphoma és az emlőrák kezelésére 1. Számos ADC gyógyszer jelenleg klinikai kísérletben vesz részt a rák kezelésében 4 .

Lenyűgözött minket az ADC tervezése, megkérdeztük, lehet-e hasonló stratégiát alkalmazni az elhízás kezelésére az anyagcsere szervek megcélzásával. Mivel nincsenek megalapozott antitestek, amelyek alkalmasak lennének az ADC tervezésére, az antiszensz oligonukleotidok (ASO) felé fordultunk, mint az antitestek lehetséges helyettesítői. Az ASO-k módosított rövid egyszálú DNS-molekulák, amelyek elsősorban a májban és a zsírban 5, 6, 7 szabályozzák a génexpressziót. Az ASO-k szisztémás beadása után a váz- és a szívizom, az agy, a hasnyálmirigy biológiai hozzáférhetősége nagyon alacsony, 6, 7, 8. Valójában jelentős erőfeszítéseket tettek az ASO módosításainak megtervezésére a májon és a zsíron kívüli egyéb szervekbe való behatolás javítása érdekében 9. Az ASO ezen korlátozása a neurológiai, izom- és szívbetegségek kezelésére előnyösnek tűnik az ASO-gyógyszer konjugátumok megtervezésekor a célzsír és a máj számára az elhízás kezelésére. Az ASO kiválasztásának másik fontos szempontja, hogy az ADC-k sejtfelvételéhez hasonlóan az ASO internalizációja is nagyrészt endocitózis útján történt 10, 11 .

Az elhízás kezelésének fő stratégiája az energiafelhasználás növelése. A T3 pajzsmirigyhormon nagyon hatékonyan növeli az alapanyagcsere sebességét és a fehér zsírszövet barnulását idézi elő 12, 13. A testsúlycsökkenés a hyperthyreosis fő tünete az embereknél14. A pajzsmirigyhormon azonban ellenjavallt az elhízás kezelésére, mivel szisztémás hatása van az agyra, a szívre és az izmokra, amelyek szorongást, szívelégtelenséget és izomvesztést okoznak 14. Mivel az ASO-k nagyon rosszul hatolnak ezekbe a szervekbe, feltételezzük, hogy az ASO-T3 konjugátumok minimalizálják a pajzsmirigyhormonok hatását ezekben a szervekben.

Egy másik kérdés az, hogy milyen linkert használjunk az ASO és a T3 konjugálásához. Szulfoszukcinimidil-4- (N-maleimidometil) -ciklohexán-1-karboxilátot (Szulfo-SMCC) választottunk, amely nem hasítható és membránt nem áteresztő térhálósítót választott magas szelektivitása, gyors reakciókinetikája és vizes reakciókörülményekkel való kompatibilitása miatt., Szulfo-SMCC amin-reaktív N-hidroxi-szukcinimidet (NHS-észter) és szulfhidril-reaktív maleimid-csoportot tartalmaz. A szulfo-SMCC maleimid csoport szokatlanul stabil a távtartó kar ciklohexán hídja miatt. Ez jelentősen növeli a gyógyszer ADC-stabilitását a keringésben. A szulfo-SMCC-t széles körben alkalmazzák az ADC-k szintézisében, beleértve az FDA által jóváhagyott adasztrastuzumab-emtanint.

Ezután két bevett ASO-t teszteltünk. A nikotinamid-N-metil-transzferáz (NNMT) a hiszton-metiláció modulátora, amely szabályozza a sejtek energiafelhasználását a zsírszövetben 16, 17. Az NNMT-ASO kezelés megakadályozza a diéta okozta elhízást 16. Az FDA által jóváhagyott gyógyszer, a Mipomersen, az ismert hiperkoleszterinémia 5 kezelésére szolgáló ASO az apolipoprotein B (ApoB) ellen. Az ADC tervezési koncepcióját felhasználva új vegyületeket szintetizáltunk az NNMT-ASO és az ApoB-ASO T3 hormonral történő kémiai konjugálásával egy szulfo-SMCC linker alkalmazásával. Ezután megvizsgáltuk az ASO-T3 biokonjugátumok elhízásra gyakorolt ​​hatását.

az eredmény

Az ASO-T3 szintézise és működése

A T3 pajzsmirigyhormon először szulfo-SMCC-vel reagált és maleimid-aktivált T3-t képezett. A terméket ezután NNMT-ASO-val vagy ApoB-ASO-val módosított foszforotioáthoz konjugáltuk (1a. Ábra). Az NNMT-ASO-T3 (NAT3) és az ApoB-ASO-T3 (AAT3) termékek nem mutatnak semmilyen kimutatható szabad T3 vagy T3-SMCC-t (további 1a-d ábra). Az ASO és a T3 sikeres konjugálását a MALDI-TOF MS ellenőrizte (további 2a, b ábra). Ezután megvizsgáltuk, hogy az ASO-T3 konjugátumok meg tudják-e őrizni az ASO és a T3 funkcionalitását. A riporter aktiválta a NAT3 és az AAT3 pajzsmirigyhormon receptorokat (1b. Ábra, c). A hatásokat a klorokin, a lizoszómák savasodás gátlója kezelésével gyengítették, ami arra utal, hogy a lizoszóma fontos szerepet játszik a T3 NAT3 és AAT3 aktivitásában (1b., C. Ábra). Az ASO-aktivitás az ASO-T3 konjugátumokban célfüggőnek tűnik. Az AAT3 hasonló mértékben csökkentette az ApoB expressziót, mint az ApoB-ASO (AA) a tenyésztett hepatocitákban (1d. Ábra), míg a NAT3 nem tudta elnyomni az NNMT expresszióját tenyésztett hepatocitákban, adipocitákban (nem ábrázolták) vagy zsírszövetekben (1e. Ábra). Mivel a NAT3-nak nincs NNMT-ASO aktivitása, és ismert, hogy az ApoB-ASO nincs hatással az állatok és az emberek testtömegére 18, 19, ezért az AAT3 és a NAT3 energiafogyasztásra és fogyásra gyakorolt ​​hatásainak tanulmányozására összpontosítottunk.

oligonukleotid

Az ASO-T3 hatása a metabolikus szervek génexpressziójára. ( a, b ) Barnuló markerek (Ucp1, Pgcla, Cidea, Cox7a1 és Cox8b) inguinalis fehér zsírszövetben (iWAT). ( c ) Az Ucp1 expressziója epididymális fehér zsírszövetben (eWAT). ( d ) Oldott hordozó (Scl6a8), glicin-amidinotranszferáz (Gamt) és a kreatin-kináz 2 (Ckmt2) 6 hordozóból álló családjának expressziója eWAT-ban. ( e ) A barna zsírszövet (BAT) génmarkerek expressziója. ( f ) A pajzsmirigyhormon (Dio1) és a koleszterin-7alfa-hidroxiláz (Cyp7a1) reagáló deodináz-1 gén máj expressziója. ( g ) Glükoneogén gének (G6pase, Pepck) és zsírsavszintézis gének (Acc1, Acc2 és Fas) a májban. ( h, én ) Mhc-b kifejezés ( h ), valamint az Mhc-a és a Troponin (Trop) ( én ) szívben. ( j ) Serca1 és Searca2a kifejeződése izomban. NAT3: NNMT-ASO-T3; AAT3: ApoB-ASO-T3. n = 4-6 csoportonként; * p § p = 0,07 vs kontroll, # p

Az ApoB-ASO-T3 (AAT3) hatása az LDL szintekre. ( a ) A máj apolipoprotein B (ApoB) mRNS szintje. b ) A szérum LDL szintje. AA: ApoB-ASO. n = 5-6 csoportonként; * p # p 25. Számos gyógyszer, például a pajzsmirigyhormonok és az adrenerg receptor agonisták, meglehetősen hatékonyan növelik az energiafelhasználást 26, 27, 28. Ezeknek a gyógyszereknek a szisztémás hatása azonban tiltja azok használatát az elhízás kezelésében. A helyzet hasonló a rák kezelésében alkalmazott citotoxikus gyógyszerhez. Bár a citotoxikus gyógyszerek hatékonyan elpusztítják a rákos sejteket, jelentősen károsítják a normál szöveteket is. Az ADC gyógyszertervezés művészete terápiás forradalmat hoz a rákkezelésben, lehetővé téve a citotoxikus gyógyszerek célzott szállítását a rákos sejtekbe. Az ADC tervezési koncepciójának felhasználásával és az ASO zsír- és májcélzásának előnyeit kihasználva sikeresen kifejlesztettük az ASO-T3 konjugátumokat. Nemrégiben arról számoltak be, hogy a glükagon-T3 hibrid konjugáció szelektíven célozza meg a zsírszövetet és a májat, ami figyelemre méltó súlyvesztéshez és javuló metabolikus szindrómához vezet az elhízott egerekben 29. Ezért a zsír és a máj hipertireózisának kiváltására szolgáló új gyógyszerterv új irányhoz vezethet az elhízás és a metabolikus szindróma kezelésére szolgáló gyógyszerek kifejlesztésében.

Az ASO-T3 tervezés ideális eredménye az ASO és a T3 aktivitásának fenntartása, így az ASO megalvadhatja a célgént, a T3 pedig aktiválhatja a zsírokban és a májban található pajzsmirigyhormon receptorokat. A cél az ASO és a T3 szinergetikus hatásainak elérése a glükóz, lipid és energia anyagcsere javítására. A kis molekulák konjugálása az ASO-val azonban befolyásolhatja az ASO 29, 30 stabilitását és aktivitását. Az általunk tesztelt két ASO-T3 konjugátum esetében csak az ApoB-ASO-T3 tartja meg az ASO aktivitását, míg az NNMT-ASO-T3 nem tudja visszaállítani az NNMT-t. Ezért az ASO gondos kiválasztása és tesztelése fontos a sikeres ASO-T3 konjugációhoz.

Bár mind a T3, mind az ASO-T3 növeli az energiafelhasználást, csak az ASO-T3-mal kezelt egereknél csökken a testtömeg és az adipozitás. A hyperthyreosisban szenvedő betegek fogyásával ellentétben a T3-mal kezelt euthyroid egerek nem szisztematikusan fogynak, hanem híznak. Ez nagyrészt annak köszönhető, hogy a T3 a hipotalamuszra gyakorolt ​​közvetlen hatással van a táplálékfelvétel stimulálására, valamint a bélre gyakorolt ​​hatásoknak, amelyek fokozzák a tápanyagok felszívódását a 20, 21, 22 egerekben. A kettős etetés ellenére az energiafelhasználás és a felszívódás kiegyensúlyozottnak tűnik a T3-val kezelt egerekben. A keringő T3 azonban nem nő az ASO-T3-mal kezelt egerekben. Így a T3-nak nincs szisztémás hatása a megnövekedett energiafogyasztás ellensúlyozására, ami súlycsökkenéshez és csökkent zsírtartalomhoz vezet.

Az ASO szövetháló vektorként való alkalmazásának egyik fontos szempontja, hogy az ADC-ben lévő antitestszerű ASO-kat az endocitózis 10, 11 in vivo endocitózis révén internalizálja a szövetsejtekbe (4c. Ábra). Az endocitózis fiziológiai folyamata nem károsítja a sejtplazma membránjának integritását, ezért kevésbé mérgező. Intracellulárisan az ASO-kat vagy közvetlenül a lizoszómákban bontják le, vagy az RNS-hez hibridizálják, és a 10., 31., 32. nukleázok lebontják. A lizoszóma savasodásának klorokin-gátlása csökkent, de nem törölte el teljesen a T3 aktivitást (Lb, c. Ábra), ami arra utal, hogy mindkét út részt vehet az ASO és a T3 disszociációjában a tenyésztett sejtekben.

Összefoglalva, az ADC elv alkalmazásával sikeresen megterveztük az ASO-T3 konjugátumokat, és bebizonyítottuk, hogy az ASO-T3 új gyógyszerfejlesztési stratégiát jelenthet az elhízás kezelésében. Fontos, hogy az ApoB-ASO (Mipomersen) egy FDA által jóváhagyott gyógyszer, amely ismert biztonsági profilokkal rendelkezik az ismert hiperkoleszterinémia kezelésére. Az ApoB-ASO-T3 konjugátum potenciálisan alkalmazható hypercholesterinaemiás általános elhízásban szenvedő betegeknél.

Anyagok és metódusok

Az ASO-T3 szintézise

Foszforotioáttal módosított ASO 16, 19-et (egér NNMT-ASO: 5-GAAATGAACCAGCAGGCCTT-3 és egér ApoB-ASO: 5-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3) 5'-tiol és C6 amino-linkerrel Bio-Synthesis (Lewisville) segítségével szintetizáltunk ). ). A T3 pajzsmirigyhormon először szulfo-SMCC-vel reagált és maleimid-aktivált T3-t képezett. Fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) végzett tisztítás után a felesleges T3-SMCC-t tiol-funkcionalizált oligonukleotidokkal reagáltatva ASO-T3 konjugátumokat képeznek. A konjugátumokat RP-HPLC-vel tisztítottuk és MALDI-TOF MS-sel jellemeztük.

Pajzsmirigy hormon receptor aktivitása

A HEK293T sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajában tartottuk fenn, kiegészítve L-glutaminnal, 10% szteroid hormonmentes borjúmagzati szérummal, penicillinnel és sztreptomicinnel. Átmeneti transzfekciókat végeztünk szubkonfluens sejtek 6 lyukú lemezein. Kétlépcsős transzfekciókat hajtottunk végre, mert nem lehetett luciferáz aktivitást mérni, amikor a plazmidokat ASO-val együtt transzfektáltuk (nem látható). Az alfa pajzsmirigyhormon receptor (100 ng), a pajzsmirigyhormon béta receptor (100 ng), a pajzsmirigyhormon receptor DR4-luciferáz (100 ng) és a PRL-TK (10 ng) plazmidokat először Hek293T sejtekbe transzfektáltuk FuGENE transzfekciós reagens alkalmazásával. (Roche) 40. Tizenkét órával később a sejteket ASO-T3-mal (1 μM) transzfektáltuk. A luciferáz aktivitást 36 órával az ASO-T3 transzfekció után mértük. A DR4 által vezérelt luciferáz által kiváltott luciferáz aktivitást PRL-TK által vezérelt Renla luciferáz aktivitásra normalizáltuk. Klorokint (100 μM) adtunk a lizoszóma elsavasodásának gátlásához 6 órával a luciferáz aktivitás mérése előtt. T3-ot (1 nM) adtunk hozzá 24 órával a sejtgyűjtés előtt a pajzsmirigyhormon riporter aktivitásának pozitív kontrollja céljából.

ASO-T3 kezelése egerekben

A vad típusú C57BL/6 egereket a Jackson Laboratóriumtól vásároltuk, és 12 órás fény/sötét ciklusba helyeztük (fény 7:00 és 19:00 között). Az egereket először magas zsírtartalmú étrenddel (Research Diets D12331, 5, 56 kcal/gm) kezelték 12 héten keresztül. A kiindulási testösszetételről MRI-t végeztek. Az egereket ezután hetente kétszer PBS kontroll, T3 (200 μg/kg) vagy ASO-T3 (25 mg/kg) kezeléssel kezeltük. A metabolikus ketrec vizsgálatokat a 7. naptól kezdték, amikor nem volt különbség a testtömegben. Ismételt MR-vizsgálatot végeztek a kezelés után három héttel. Az egérvizsgálatokat a szövetségi irányelveknek megfelelően hajtották végre, és azokat a Kaliforniai Irvine Egyetem és a Kelet-Karolinai Egyetem Állattenyésztési és Állattenyésztési Intézménye jóváhagyta.

Szérum T3 mérések

A T3 szérumot folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) 41, 42 mértük. Két órán át T3-mal vagy ASO-T3-mal kezelt egerek nyolcvan mikroliter szérumát összekeverték aszkorbinsavval, citromsavval és ditiotreitollal (25 μg/μl), hogy megakadályozzák a pajzsmirigyhormonok lehetséges átalakulását. Egy órás jégen végzett inkubálás után 640 μl karbamidot adunk hozzá, és az oldatot egy órán át inkubáljuk 50 ° C-on. A mintákat szilárd fázisú extrakciónak vetjük alá, mielőtt LC-MS/MS-be injektáljuk. Az elválasztást GP-fenil (3 μm, 2,1 x 100 mm) alkalmazásával érték el. A gradiens mozgófázis 0,1% hangyasavat tartalmazott vízben (A) és acetonitrilben (B), és az áramlási sebességet 0,2 ml/perc értékre állítottuk be. A tömegspektrometriás detektálást háromlépcsős TSQ Vantage háromlépcsős tömegspektrométeren végezték, permetezési feszültség: 3,2 KV, párologtató hőmérséklete: 200 ° C, köpenygáznyomás: 45 arb, gáznyomás Aux: 15 arb, kapilláris hőmérséklet: 270 ° C. A mennyiségi meghatározást a kiválasztott reakciók (SRM) pozitív ionizációs üzemmódban történő követésével végeztük, és a paraméterek a T3 esetén m/z 651, 517 → 508.000 (CE 22 eV; S-lencse 161 V-nál), 461, 095 → 285, 056 IS-hez (CE 19 eV, S-lencse 88 V-nál).

Fizikum

A testösszetételt kontroll PBS-sel, T3-mal, NNMT-ASO-T3-val vagy ApoB-ASO-T3-mal kezelt egereken elemeztük 3 héten keresztül EchoMRI 3 az 1-ben eszközzel (Echo Medical Systems, Houston, TX).

Metabolikus ketrecek

Az energiafelhasználást a TSE PhenoMaster rendszer segítségével értékelték. A HFD-vel táplált egereket kontroll PBS, T3, NNMT-ASO-T3 vagy ApoB-ASO-T3 kezeléssel kezeltük 7 napig. Az egereket metabolikus ketrecekben 2 nappal a kísérletek előtt akklimatizáltuk. A szén-dioxid-termelést és az O2-fogyasztást 60 percenként gyűjtöttük minden egér esetében 3-4 napig. A szinteket sovány tömegre normalizálták. Az ételbevitelt és az aktivitást rendszeres időközönként mértük.

A szérum glükóz, inzulin és LDL mérése

A glükózszinteket glükóz-kolorimetriás vizsgálattal (Cayman Chemicals) mértük. Az inzulint ultraibens érzékeny inzulin ELISA készlettel (Crystal Chem) mértük. Az LDL-t a BioAssay Systems LDL assay készletével mérjük.

RNS extrakció és kvantitatív PCR

A zsírszövetet és a májból származó RNS-t az RNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával extraháltuk. A szívből és az izmokból származó RNS-t az RNeasy Fibrous Tissue Mini kit (Qiagen) segítségével extraháltuk. A Hepa1-6 egér hepatoma sejteket ASO-val és ASO-T3-mal transzfektáltuk. Az RNS-t a transzfekció után 48 órával extraháltuk. Valós idejű SYBR PCR-eket a fent leírtak szerint hajtottunk végre 43. A primereket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Statisztikai teszt

Az összes adatot átlag ± sem értékben fejezzük ki. A szórásanalíziseket Bonferroni-Holm posthoc tesztekkel végeztük, több összehasonlítás céljából. Statisztikai szignifikancia p