elemeket
absztrakt
Az atorvasztatin a koleszterinszint-csökkentő gyógyszer, amelyet hiperkoleszterinémia kezelésére használnak. Gátolja a 3-hidroxi-3-metilglutaril-koenzim A-reduktázt (HMG-CoA), egy enzimet, amely katalizálja a koleszterinszintézis sebességkorlátozó lépését 11. Legjobb tudomásunk szerint egyetlen publikált tanulmány sem társult GM-változásokhoz atorvasztatin kezeléssel HFD által kiváltott hiperkoleszterinémiás patkánymodellben. Célunk az volt, hogy meghatározzuk, hogy a GM hogyan reagál az atorvastatin által kiváltott koleszterinszint csökkenésre egy HFD által kiváltott hiperkoleszterinémiás patkány modellben. Különösen arra kerestük a választ, hogy a gyógyszeres kezelés befolyásolhatja-e a hiperkoleszterinémiás patkányok GM-összetételét és változatosságát az egészséges kontrollokhoz képest.
az eredmény
A hiperkoleszterinémia és a gyógyszeres kezelés elemzése
A hiperkoleszterinémiát 5 hét HFD-táplálás után igazolták megemelkedett szérum koleszterinszinttel. Koleszterinszint (P 
A relatív bőség a domináns és/vagy általában jelenlévő baktériumfilozófia százalékában kifejezve a különböző étrend és gyógyszercsoportok között. A domináns phylla szelekciójának határértékeit> 1% -ban határozták meg, és a csoportban lévő patkányok> 50% -ánál találtak általában jelenlévő taxonokat. NCD, normál étrend; NCD-T, normál étrend + atorvasztatin kezelés; HFD, magas zsírtartalmú étrend; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvasztatin; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvasztatin; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvasztatin; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvasztatin.
Teljes méretű kép
A bél mikroflóra változása a HFD hatására
Taxonfüggő dózisváltozás az atorvasztatin csoportban a kontrollokhoz képest
A proteobaktériumok relatív száma szignifikáns volt (P
A mikrobiális közösségek összetételének elemzésének többdimenziós alapvető koordinálása a különböző csoportok között. A PCoA-t OTU szintű szekvenciákból végeztük,> 97% -os hasonlósággal, a súlyozatlan UniFrac távolságmérő segítségével. NCD, normál étrend; NCD-T, normál étrend + atorvasztatin kezelés; HFD, magas zsírtartalmú étrend; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvasztatin; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvasztatin; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvasztatin; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvasztatin.
Teljes méretű kép
Alfa szekvencia-diverzitás elemzés hangjai. ( A ) Kísérletileg megfigyelt OTU és ( B ) becsült értéke a Chao1. ( C ) A biodiverzitás a Shannon-index alapján becsülhető meg. NCD, normál étrend; NCD-T, normál étrend + atorvasztatin kezelés; HFD, magas zsírtartalmú étrend; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvasztatin; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvasztatin; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvasztatin; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvasztatin.
Teljes méretű kép
A HFD csoportokhoz hasonlóan az NCD-T csoportban is nőtt a Proteobacteria törzs, a családok (Porphyromonadaceae, Desulfovibrionaceae és Helicobacteraceae) és a Helicobacter nemzetség relatív bősége az NCD kontroll csoporthoz képest. Ezenkívül a Clostridiaceae, a Lachnospiraceae, a Spirochaetaceae és az Eubacteriaceae szignifikáns növekedést mutatott az NCD-T csoportban az NCD kontrollhoz képest (2. kiegészítő táblázat). Hasonlóképpen a Treponema, Lachnoclostridium, Barnesiella, Ruminococcus, Eubacterium, Desulfovibrio és Roseburia nemzetségek növekedtek az NCD-T csoportban. Míg a domináns nemzetségek közül az Oscillospira, a Prevotella, a Bacteroides és a Parabacteroides relatív bősége csökkent az NCD-T csoportban az NCD kontrollhoz képest (3. kiegészítő táblázat).
A nem és a koleszterinszint összefüggései
A koleszterinszinttel általános korrelációt hajtottunk végre Spearman nemparametrikus korrelációs elemzésével. Megállapították, hogy az NCD-T, HFD, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg és 20 mg/kg csoportokban megváltozott domináns taxonok korrelálnak a különböző koleszterinekkel. Az LDL (ρ> −0, 17), a TG (ρ> −0, 14) és a koleszterin (ρ> −0, 27) szinttel negatívan korrelált gének közé tartozik a Clostridium, Desulfovibrio, Roseburia, Blautia, Helicobacter, Ruminococcus és Lactobacillus (5. ábra). ). A Prevotella, a Coprococcus, a Prevotella [YRC22], a Paraprevotella, a Clostridia [SMB53] és a Dorea azonban pozitív korrelációt mutatott az LDL-rel (ρ> 0, 2), TG (ρ> 0, 1) és a koleszterinnel (ρ> 0)., 26.) (5. ábra). Hasonlóképpen, az Oscillospira (ρ> 0, 33) pozitív korrelációt mutatott a HDL szinttel (5. ábra).
Összességében elmondható, hogy a Clostridiaceae, a Lactobacillaceae, a Rikenellaceae, a Peptostreptococcaceae és a Lachnospiraceae csökkenő relatív bősége az atorvastatin kezelés különböző dózisaiban következett be a HFD csoportban. Wang és mtsai. csökkent Clostridiaceae-szintekről számoltak be probiotikus baktériumtörzsek (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus és Bifidobacterium animalis) beadása után HFD-vel táplált egereknek 28. Hasonlóképpen a nem fermentálható rostos hidroxi-propil-metil-cellulóz beadása HFD-vel táplált egereknek vagy alacsony zsírtartalmú étrendre váltás csökkentette a Lachnospiraceae 29 előfordulását. Ezzel szemben a gyógyszerrel kezelt csoportokban a Porphyromonadaceae, a Ruminococcaceae és a Desulfovibrionaceae fokozott előfordulását figyelték meg. A Lactobacillus paracasei apo-E -/- egereknek történő beadása jelentősen csökkentette a koleszterinszintet, és növelte a Porphyromonadaceae előfordulását a székletben 30. A kapszaicinnel kiegészített HFD egereknél megnőtt a Ruminococcaceae 31 előfordulása. Hasonlóképpen, az epe-sókra aktív Lactobacillus reuteri aktív Lactobacillus reuteri aktív Lactobacillus reuteri aktív Lactobacillus reuteri étrenddel kiegészített magas zsír- és koleszterinszintű étrend növeli a Desulfovibrionaceae 25 mennyiségét .
Az atorvasztatinnal végzett kezelés a HFD csoportban növelte a Bacteroides és Parabacteroides relatív előfordulását. A Bacteroides és Parabacteroides maximális mennyisége 10 mg/kg és 15 mg/kg volt. Hasonlóképpen, a lizonok HFD-vel táplált apoE -/- egereknek történő beadása növelte a Bacteroides és Parabacteroides szinteket, miközben csökkent a TG32 szint. A bakteroidok az epesav anyagcseréjéhez kapcsolódnak, és elősegítik a taurin-konjugált epesav dekonjugálódását a szérumban 18, 33. A magas koleszterin/kolinsavtartalmú étrend módosította a széklet 34-es epesav összetételét, a megváltozott epesav pedig a dysbiosissal 35 társult. A Desulfovibrio (endotoxint termelő baktériumok és szulfát-redukáló baktériumok) szintjei 36, 37 fokozott relatív bőséget mutattak az NCD-T csoportban.
Hasonlóképpen, a Parabacteroides nemzetség, amely gyulladáscsökkentő baktériumokat tartalmaz 38, a relatív bőség állandó növekedését mutatta az atorvasztatin különböző dózisaiban a HFD csoportban. A ruminococcusok (triptamint termelő baktériumok) 39 az atorvasztatin-kezelés elnyomott szintjét mutatták HFD-vel táplált patkányokban. Az Oscillospira nemzetség, amely a butiráttermelő 40 fajokat is magában foglalja, következetes növekedést mutatott a gyógyszerrel kezelt HFD-k csoportjában. Az elhízott HFD által kiváltott patkányok rapamicinnel (az energiafogyasztás és tárolás szabályozója) történő kezelése a Turicibacter 41 szintjének növekedését eredményezte. Vizsgálatunk során a Turicibacter csökkent szintjét találtuk a gyógyszerrel kezelt HFD csoportokban. Hasonlóképpen, a Clostridium (butirátot termelő taxonok) 42 csökkent szintet mutatott a gyógyszerrel kezelt csoportban. Megállapításainkkal összhangban Di Lucci et. al. elhízott patkány modellben a Coprococcus fokozott előfordulásáról számolt be a fruktózban gazdag metabolikus szindrómában 43 .
Catry és mtsai. az ezetimib és a szimvasztatin NCD-vel táplált egerekben történő beadása után a Lactobacillus fajok emelkedett szintjét jelentették 7. Az NCD-T csoportban a Lactobacillus relatív incidenciájának növekedését figyeltük meg. A Lactobacillus koleszterinszint-csökkentő baktériumok képességét korábban bizonyították a Lactobacillus reuteri LR6, a Lactobacillus reuteri NCIMB 30242 és a Lactobacillus johnsonii BS15 patkányokban és hiperkoleszterinémiában szenvedő betegeknél, valamint az alkoholmentes zsírbetegség egérmodelljében. A Lactobacillus fajoknak további kutatásokra van szükségük határozza meg pontos szerepét a koleszterin anyagcserében. Az atorvasztatin-kezelés során arra törekedtünk, hogy a patkányok koleszterinszintjét korreláljuk a potenciális koleszterinszint-csökkentő baktériumok relatív számával. Vizsgálatunk korlátja a metabolomikai adatok hiánya volt. Ennek az eszköznek a segítségével részletes kapcsolat állhat fenn a szérum metabolitok összetétele és a mikrobiom között az atorvasztatin kezeléssel kapcsolatban.
Összességében ez a tanulmány az atorvasztatin hatását mutatta a HFD GM állatmodelljére. Különösen az atorvasztatin beadása növelte a baktériumok sokféleségét, és viszonylag sok olyan domináns taxont adott vissza, amelyeket a HFD megváltoztatott az NCD fenotípus felé. Az atorvasztatinnal végzett kezelés szintén hatással volt a gyógyszer bizonyos baktériumok populációjának megoszlására a HFD és NCD-T kezelési csoportokban. A koleszterinszint-csökkentő gyógyszerek különböző osztályai különböző hatásokat okozhatnak a bél mikrobioljára, és potenciális kapcsolatot teremthetnek a GM összetétele, a koleszterinszint és a gyógyszeres kezelés között. Összegzésképpen elmondható, hogy a hiperkoleszterinémia során általában felírt koleszterinszint-csökkentő gyógyszereket meg kell vizsgálni olyan mikrobiom-módosító hatások szempontjából, amelyek jelentős hatással lehetnek a gazda egészségére.
Anyag és reagensek
Állatmodell és kezelés
Negyvenkét kórokozótól mentes Wistar patkányt (100-120 g) biztosított a szaúd-arábiai Jeddah Abdulaziz King Egyetem Biokémiai Tanszéke. A HFD 3% koleszterint (Sigma Aldrich Co., USA), 0,2% kolinsavat (Sigma Aldrich Co., USA), 15% marhafaggyút és 81,8% normál takarmányt tartalmazott. Az összes hozzáadott összetevőt a teljes étrend százalékában vettük fel. Az atorvastatint (Pfizer Inc., USA) koleszterinszint-csökkentő gyógyszerként használták. Ebben a vizsgálatban az összes állatkísérletet az Abdulaziz King Egyetem Természettudományi Kar Biokémiai Tanszékének létesítményeiből származó állatokkal végezték. A vizsgálati protokollt az Abdulaziz Király Egyetem Orvostudományi Karának Etikai Kutatási Bizottsága jóváhagyta a megállapodás száma alatt (nyilvántartási szám: HA-02-J-008). A kísérletet a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.
A patkányokat 7 napig igazították az állattartó ház standardizált környezeti paramétereihez, beleértve a hőmérsékletet (21 ± 1 ° C), a relatív páratartalmat (60 ± 10%) és a 12 órás nappali-éjszakai ciklust. Az állatok környezeti körülményei a kísérlet végéig fennmaradtak. Kezdetben 42 patkányt véletlenszerűen két csoportra osztottak, és normál étrendet (NCD; n = 12) vagy magas zsírtartalmú étrendet (HFD; n = 30) tápláltak. A hiperkoleszterinémiát 5 hetes HFD-kezelés után igazolták. Az NCD csoportból hat patkányt kezeltünk 10 mg/kg/nap atorvasztatinnal (NCD-T), míg a másik hat patkányt NCD kontrollként tartottuk fenn. A HFD által kiváltott hiperkoleszterinémiás csoportban hat patkány szolgált HFD kontrollként, a fennmaradó 24 patkányt négy egyenlő csoportba osztották, és különböző koncentrációjú atorvasztatinnal kezelték (5, 10, 15 vagy 20 mg/kg/nap). Az atorvasztatint mágneses keverővel számított mennyiségű steril desztillált vízben szuszpendáltuk, és a gyógyszert 24 óránként egyszer intragasztrikusan adtuk be a 47-es szonda segítségével. Az állatokat atorvasztatinnal kezeltük 28 napig.
Vér- és szövetmintavétel és koleszterinszint-elemzés
Vérmintákat vettünk az orbitális plexusból két időpontban: 5 hét után a hiperkoleszterinémia igazolására a HFD csoportban és levágás előtt, hogy értékeljük a gyógyszeres kezelés koleszterinszintre gyakorolt hatását a vizsgálati csoportokban. A vérmintákat szérumokat izoláltuk centrifugálással 3000 fordulat/perc sebességgel, 4 ° C-on 15 percig. A lipidprofilokat, beleértve a szérum LDL-t, a koleszterint, a TG-t és a HDL-t, automatikus biokémiai analizátorral (Aeroset 09D0501, American) teszteltük. A vakbél tartalmát az összes állatból levágás után azonnal összegyűjtöttük, és DNS-izolálás céljából -80 ° C-on tároltuk.
16S rRNS szekvenálás és adatfeldolgozás
A metagenomikus DNS-t a cecalis tartalomból AccuVisBio DNS extrakciós készlettel (AccuVisBio, Abu Dhabi) extraháltuk a gyártó utasításai szerint, és a DNS-koncentrációt Qubit rendszerrel (Invitrogen, USA) mértük. A mintákat 16 S rRNS génre szekvenáltuk, a V3-V4 régiót megcélozva 341 F és 785 R univerzális primerek vonalkódjaival, Dowda és mtsai. 48. Kettős indexű vonalkódokat és Illumina szekvencia adaptereket használtak az olvasók korlátozott PCR-cikluson keresztüli összekapcsolására. Agencourt AMPure gyöngyökkel (Agencourt, USA) végzett tisztítás után a könyvtárakat a Nextera XT protokoll segítségével normalizáltuk. A mintákat egyetlen áramlási cellába egyesítettük a MiSeq szekvenálási platformon (Illumina, San Diego) történő szekvenáláshoz a gyártó protokollja szerint. Az automatizált fürtgenerálást és a szekvenciális párosítást kettős indexeléssel egyetlen ciklusban, 2 x 300 bp olvasási hosszúsággal hajtották végre.
A párosított leolvasásokat PANDAseq segítségével gyűjtöttük, és a Raw FASTQ fájlokat az Illumina MiSeq 49-től szereztük be. A primereket és a vonalkódokat eltávolítottuk a szekvenciákból. Minden 'N' betűvel rendelkező és 50-es szekvenciájú olvasó. A megtisztított szekvenciákat ezután k = 10-re (97% -os hasonlóságra) csoportosítottuk, majd a kimérákat töröltük, és a szingulett 51.52. Végül az OTU-kat a QIIME 1.9 segítségével osztályozták a GreenGenes 53-ból származó gyógyító adatbázishoz képest. A tanulmány szekvencia-adatai az Európai Nukleotid Archívumban érhetők el. PRJEB23060.
Statisztikai analízis
Az OTU biodiverzitását és gazdagságát a nem parametrikus Chao1 elemzéssel és hígítási analízissel megvalósított QIIME 1.9 alkalmazásával számoltuk, amelyek az OTU egységességét és eloszlását mutatták különböző csoportokban. Az adatokat mintánként ugyanannyi leolvasásra normalizáltuk, és a PCoA-t OTU-szintű szekvenciákból végeztük,> 97% -os hasonlósággal, a súlyozatlan UniFrac távolságmérő segítségével. A PCOA grafikont az EMPEROR vizualizálta. Egyirányú ANOVA-t (paraméteres adatokhoz) és nem-parametrikus Kruskal-Wallis és Mann-Whitney teszteket (nem szabványos adatokhoz) végeztünk a csoportok között szignifikánsan eltérő baktérium-taxonok azonosítására, míg a Kolmogorov-Smirnov D-tesztet alkalmaztuk. meghatározza a normalitást. adat. A statisztikai elemzéshez az SPSS 16. verzióját használtuk. A koleszterinszint különbségeket a kontroll és a kezelt csoportok között Student-féle t-teszttel elemeztük (kétfarkú) a GraphPad Prism 6.01 verziójával (Graph Pad Software, San Diego, USA), és jelentős különbségeket * P