meghatározzák

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az étel mennyiségének csökkenése fáziseltolódást okoz a perifériás órákban
  • Az étkezési frekvenciák azonos étkezési intervallumokkal nem befolyásolják a perifériás óra fázist
  • Az emberi étrendet utánzó ételminták megváltoztatják a perifériás óra fázisait
  • vita
  • mód
  • vadállat
  • Monitoring protokoll in vivo
  • A monitoring adatok elemzése in vivo
  • Tervezett etetési protokoll
  • Statisztikai analízis
  • Hozzászólások

elemeket

  • Gén expresszió
  • Génszabályozás
  • képalkotás
  • fiziológia

absztrakt

Az emlősök perifériás cirkadián óráját erősen magával ragadja a világos-sötét és az étkezési ciklus. Fiziológiai funkcióikat a szervek fázisszinkronizálása tartja fenn az órák génexpressziós mintáinak felhasználásával. Kevéssé ismert azonban a perifériás óráknak a többnapos étkezések időzítéséhez való igazítása. Itt megvizsgáltuk a rendszertelen étkezési szokások időzítés és térfogat szerinti hatását perifériás óráikra in vivo. Megállapítottuk, hogy a perifériás óra fázisát megváltoztatta az élelem mennyisége és az etetési idők közötti intervallum, de az etetés gyakorisága nem befolyásolta, amíg az intervallum rögzített maradt. Ezenkívül eredményeink azt sugallják, hogy a késői vacsorát két félpanzióra kell osztani, hogy enyhítsék a szabálytalan perifériás órafázisok hatását.

A cirkadián órarendszer kulcsfontosságú szerepet játszik az élettani funkciók endogén fenntartásában, ideértve az alvás-ébrenlét ciklust, a testhőmérsékletet, az anyagcserét és a szervi funkciókat 1. Az emlősök órarendszerei óragéneket tartalmaznak; különösen a 2. periódus (Per2) egy transzkripciós és transzlációs visszacsatolási hurok, amely az órával, a BmaI-val és a Cry1-gyel együtt 24 órás RNS- és fehérjeszintet generál egyetlen sejt szinten. Ez a rendszer nemcsak az suprachiasmaticus magban (SCN), az emlős cirkadián órarendszer központi oszcillátorában, hanem az 1, 2, 3 testben is aktív. A májszövetekben az időbeli mikrorajkák elemzése azt mutatta, hogy az összes gén körülbelül 10% -a mutat különbséget a nappali és az éjszakai expresszióban, ami arra utal, hogy a fiziológiai események ritmusát a cirkadián órarendszer szabályozza. .

A tervezett egér etetési kísérletek használata a viselkedési és fiziológiai ritmusok, valamint az óra gén expressziós ritmusainak fázisveszteségének vizsgálatára azt sugallja, hogy az étel hatásos vonzódási tényező az 1, 3 perifériás óráknál. Ez a bevonódás független az SCN-től, amint arról az SCN 17 elváltozás-tanulmánya beszámolt. A máj óráját táplálkozási vagy anyagcsere-tényezők, például szénhidrátok, 18-as aminosavak és 19-es inzulin révén könnyen felveheti az étel. Korábban beszámoltunk arról, hogy az ételbevitel vagy az inzulininjekció hevesen növeli a Per2-szabályozást és lefelé szabályozza a Rev-erbα gén expresszióját a májban 19. Az étkezési címke abban különbözik a fényvonaltól, hogy a test nem-paraméteres impulzusjelként kap táplálási jeleket, például reggelit, ebédet és vacsorát, míg az SCN-függő ritmusokat paraméteres és nem paraméteres fényjelek rögzítik. .

Ezen tények alapján a tanulmányunk célja az volt, hogy kiderítsük, hogyan stimulálják az egyes ételimpulzusok a perifériás órákat a nap folyamán, és hogyan szabályozza a perifériás óra fázisát több étkezés. Itt egy nemrégiben bevezetett in vivo módszert alkalmaztunk a perifériás órák monitorozására annak meghatározására, hogy az emberekhez hasonló étkezési szokások hogyan határozzák meg az egerek perifériás órafázisait.

az eredmény

Az étel mennyiségének csökkenése fáziseltolódást okoz a perifériás órákban

Embereken végzett vizsgálatok során a cirkadián táplálkozásmentes paradigmát általában használják az étel okozta bevonódás csökkentésére 21; ezért kísérletünk során ezt a paradigmát alkalmaztuk azzal, hogy először az egereket rendszeres időközönként napi 6 étkezéssel láttuk el. Így megvizsgáltuk az ételmennyiségnek a perifériás óra fázisra gyakorolt ​​hatását ennek az ütemezésnek az alkalmazásával, amelyben minden alkalommal ugyanazt az ételmennyiséget szolgálták fel otthoni automatizált etetési rendszerrel 22. A maradékanyagok elkerülése érdekében az etetési periódusban ebben a kísérletben az egereknél kissé korlátozott volt a kalória. A korábban 23-ban leírt technikával a PER2: LUCIFERASE knock-in egereket (PER2: LUC) alkalmaztuk a perifériás szövetek per2 aktivitásának mérésére in vivo bőrképalkotással (1A. És B. Ábra). Szükség esetén etetési körülmények között a PER2: LUC aktivitás a perifériás szövetekben (vese, máj és submandibularis mirigy) a Zeitgger 19. idő körül volt a legmagasabb (ZT 19; ZT 0 jelzi a fények idejét; 1B ábra). megállapította, hogy az etetés 20% -os, de nem 10% -os korlátozása szükség szerint elegendő ahhoz, hogy az egerek 4 órás etetési intervallumon belül elfogyasszák az összes étrendjüket. Az etetési protokoll megkezdése után hét nappal az egerek az eljuttatást követően 3 percen belül meg tudták enni az összes leszállított ételt.

Vázlatos táplálkozási tervek (balra) és az egyes szervek PER2: LUC csúcsának átlagos fázisai az egyes táplálkozási körülményekhez (jobbra). A vízszintes tengelyen lévő fehér és fekete sávok a környezeti 12 órás világos és sötét körülményeket jelzik. A fehér körök jelzik az etetési időket, és a kör mérete összefügg az étel mennyiségével. Minden étkezés egyenletesen oszlott el a nap folyamán, és az egyes étkezések mennyisége a nap folyamán egyenértékű volt; az etetések száma napi 6, 4, 3 vagy 2 étkezés volt. A perifériás órákat 2 hetes szoktatás után figyeltük az egyes táplálkozási körülményekhez. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be, állapotonként n = 6 egérrel. Az egyirányú ANOVA egyik tesztelt szövetben sem mutatott szignifikáns különbséget. Sub Gla, submandibularis mirigy; ZT, Zeitgeber ideje.

Teljes méretű kép

Az emberi étrendet utánzó ételminták megváltoztatják a perifériás óra fázisait

Az emberi étkezési szokások utánzására arra összpontosítottunk, hogy az egerek napi 3 étkezést kapjanak. Először megvizsgáltuk az étkezés különböző időpontjait, azaz ZT 12, 18 és 0 vagy ZT 0, 6 és 12, hogy megértsük a nappali (ZT 6) és az éjszakai (ZT 18) táplálási ütemezés közötti különbséget (3A. Ábra). . A ZT 0, 6 és 12 hőmérsékleten történő táplálással indukált perifériás órafázisok jelentősen különböztek a ZT 12, 18 és 0 hőmérsékleten történő táplálás által kiváltott fázisoktól. Ezenkívül az egerek perifériás óra fázisa 3 ételt adott ZT 12, 18, és 0 hasonló volt az ad libitummal táplált egerek fázisához (1. és 3A. ábra).

Vázlatos etetési tervek (balra) és átlagos PER2: LUC csúcsfázisok minden egyes szervhez táplálási körülmények között (jobbra, átlag ± SEM). A vízszintes tengelyen lévő fehér és fekete sávok a környezeti 12 órás világos és sötét körülményeket jelzik. A fehér körök jelzik az etetési időket, és a kör mérete összefügg az étel mennyiségével. A nyilak azt az etetési időt jelzik, amely az egyes állapotoknál a leghosszabb etetés nélküli intervallumot követte. A perifériás órákat 2 hetes szoktatás után figyeltük az egyes táplálkozási körülményekhez. (A) perifériás órafázis 3 étellel táplált egerekben, egyenletesen elosztva egész éjjel és nappal; az ételt ZT 0, 6 és 12 (a) vagy ZT 12, 18 és 24 (b) pontoknál adtuk be; n = 6 egér állapotonként. * 24. p; ezért a vacsora időzítése késett ebben a tanulmányban. Az étkezés mérete a következő volt: reggeli, 0,9 g (a teljes ételtérfogat 27% -a); ebéd, 1,2 g (36%); és vacsora, 1,2 g (36%). A 3B. Ábrán a perifériás óra fázisa, amikor a ZT 12, 17 és 1 adagolási program vezérli, hasonló volt ahhoz a fázishoz, amelyet a ZT 12, 18 és 0 adagolási program követ. Azonban a ZT 12, 17, 3 vagy A 4-es etetési séma drámai fáziseltolódást okozott: perifériás órák a ZT 0, 6 és 12 etetési sémához hasonló fázishoz.

Harmadszor, a késő vacsora fázishatásainak kiküszöbölése érdekében elosztottuk a ZT 4-nél felszolgált ételek mennyiségét a ZT 0 és ZT 4-en felszolgált mennyiségek felére. A perifériás órák ZT 12, 17 és 4 etetési ütemterv szerinti elemzését követően ugyanazon egerek táplálási rendjét ZT 12, 17, 0 és 4 táplálási ütemtervre változtattuk. Két héttel az új ütemterv módosítása után a A perifériás órák kissé hátrébb mozdultak a vesék és a máj számára, és jelentősen eltolódtak a submandibularis mirigy esetében az előző etetési ütemtervhez, azaz a ZT 12, 17 és 4-hez képest. Ez azt jelenti, hogy a késő este előtti tizedik képes megvédeni a a perifériás óra.

vita

Jelen tanulmányunkban megvizsgáltuk a perifériás órák in vivo funkcióját egerekben, akik több táplálkozási rendnek voltak kitéve, és amelyeket úgy terveztek, hogy utánozzák az emberi étkezési szokásokat. Először azt tapasztaltuk, hogy a perifériás óra előrehaladott fázis az ételfogyasztás csökkenése után (1. ábra), másodszor, hogy a hosszú böjt után kapott ételjel erős tényező a perifériás óra fázisának meghatározásában (2. ábra és 3).

Mendoza és mtsai. 25 korábban kimutatta, hogy a csökkentett teljes táplálékbevitel, beleértve a napi 6 étkezést, fáziseltolódást okozott nemcsak a mozgásszervi ritmusokban, hanem az SCN óragén expressziós mintáiban is. Ez a fázis-szekvenciális hatás az SCN-ben felelős lehet a fázis perifériás óráinak ebben a vizsgálatban megfigyelt változásáért (1. ábra). Azt is megállapítottuk, hogy a kalória-korlátozás a különböző szervekben eltérő módon befolyásolja a haladást. A vesék erősebb választ mutattak, mint a többi ellenőrzött szövet (1D., 2. és 3. ábra). A kalória-korlátozás ezen szakaszának hátterében álló mechanizmus még nem ismert. Az egyik lehetőség az, hogy a vércukorszint-függő AMPK-aktivitás változásai megváltoztathatják a perifériás óra periódust 9, és hogy az AMPK-aktivitás szövetspecifikus lehet. Mivel azonban számos jelátviteli út vesz részt a perifériás óra befogadásában 3, további kutatásokra van szükség az étel stimulálásának hatására a különféle szervekben.

A perifériás órafázisokat nem befolyásolták a különböző etetési gyakoriságok (napi 2, 3, 4 és 6 étkezés), ha az etetés azonos időközönként történt, míg egyértelmű fázisváltozásokat figyeltünk meg, amikor 3 ételt alkalmaztunk egyenlőtlen időközönként (ábra) . 2. és 3.). Ez az eredmény megmagyarázható az etetési időpontok közötti intervallum hosszának figyelembevételével az egyes etetési állapotokban. A hosszú éhgyomorra biztosított táplálék (amelyet a 3. ábra nyilai jeleznek) különösen erős a perifériás óra visszaállításakor. Korábban hasonló eredményeket mutattunk ki a máj PER2: LUC ritmusában napi 2 étkezés esetén, amelyet ex vivo értékeltünk a szövetkultúrával 22; Nyilvánvaló, hogy az étkezési intervallumok hatása erős még azoknál az egereknél is, akiket napi három étkezéssel etettek normál világos-sötét ciklus alatt.

Összefoglalva, a több adagolási rendből érkező jelek integrálása meghatározza a perifériás óra gén expressziós ritmusainak egyetlen napi csúcsát in vivo. A perifériás óra ilyen adaptációja az élelem mennyiségétől és az etetési idők közötti intervallumtól függ, még normál világos-sötét ciklus esetén is. Eredményeink arra utalnak, hogy az emberek étkezési szokásai a modern társadalomban megváltoztak, és a perifériás órák szabálytalan szakaszait okozták. Eredményeink azonban arra is utalnak, hogy a szabálytalan perifériás órák könnyen módosíthatók az étkezési szokások szabályozásával.

mód

Valamennyi állatot tenyésztették és a Waseda Egyetem Természettudományi és Technológiai Karának Állatkísérleti Bizottságának engedélyével (2011-A49 engedély), valamint az állatjogi törvénynek (105. sz.) És az értesítésnek (6. sz.) Összhangban tenyésztették és használták. Japán kormány. Ezeket a tanulmányokat a Waseda Egyetem Természettudományi és Műszaki Iskolája hagyta jóvá.

Homozigóta PER2: LUC knock-in egereket, vegyes C57/BL6J és ICR (albínó) háttérrel, ötször többször kereszteztük a PER2: LUC C57/BL6J 35 egerekkel (C57/BL6J egerek Dr. Joseph jóvoltából Takahashi, Northwestern University, Evanston, IL, USA) és ICR (Tokyo Laboratory Animals) egerek. Az egereket világos-sötét ciklusban tartottuk (12 órás világos és 12 órás sötét, a fény 8:00 órakor világított), szobahőmérsékleten 23 ° C ± 1 ° C, páratartalom 60% ± 5%, és a fényintenzitás 100 - 150 lux ketrec szintjén. A kísérletek előtt standard táplálékkal (MF; Oriental Yeast Co. Ltd., Tokió, Japán) és ad libitum vízzel látták el őket. Ebben a kísérletben egyedileg elhelyezett hím egereket (életkor: 10-12 hét) használtunk. Az egereket 3 csoportra osztottuk, amelyeket ezután különböző etetési ütemezésnek tettek ki, majd in vivo monitorozták a perifériás óraritmust.

In vivo monitorozási protokoll

Az in vivo monitorozást a fent leírtak szerint végeztük 23. Az IVIS kinetikai rendszert (Caliper Life Sciences, MA, USA és Summit Pharmaceuticals International Corporation, Tokió, Japán) alkalmaztuk az in vivo képalkotáshoz. Az egereket izofluránnal (Mylan Inc., Tokió, Japán) és tömény oxigénnel (SO-005B, Sanyo Electronic Industries Co. Ltd., Okayama, Japán) érzéstelenítettük gáz érzéstelenítő rendszer (XGI-8, Caliper Life Sciences) alkalmazásával. fekete doboz. Amikor az egereket altattuk, D-luciferin-káliumsóval (Promega, Madison, WI, USA) sc injekciót adtunk a háton, a nyak közelében, 15 mg/kg (30 mg/10 ml, 0,05) dózisban. ml/10 g testtömeg). A felvételeket ezután 6 perccel és 8 perccel készítettük a luciferin injekció után a háti helyzetben a vesék számára, valamint 10 perc és 12 perc múlva a ventrális helyzetben a máj és a submandibularis mirigy esetében; képek 1 perc expozíciós idővel készültek. Az adatokat 6 és 12 perc múlva kaptuk biztonsági adatokként a 8. és 10. perc után kapott adatokhoz. Az egyes időpontokban a biolumineszcens képet egyesítették a szürkeárnyalatos képpel.

A képeket naponta 6 alkalommal kaptuk (ZT 11, 15, 19, 23, 3 és 7). Az egerek minden képalkotó eljárás után visszatértek otthoni ketreceikbe, és gyorsan felépültek az izoflurán altatásból. Az izoflurán altatásban eltöltött teljes idő kísérletenként körülbelül 20 perc volt. Az anesztézia és a biolumineszcencia napi négyórás elemzése nem befolyásolta a luciferáz aktivitását a perifériás szövetekben vagy a viselkedést 23 .

Az in vivo monitoring adatok elemzése

Az in vivo monitorozási adatokat a korábban leírtak szerint elemeztük 23. Az egyes szervekből (vese, máj és submandibularis mirigy) kibocsátott biolumineszcenciát automatikusan kiszámoltuk a Living Image 3.2 szoftverrel (Caliper Life Sciences). Minden szerv esetében az érdeklődési területet (ROI) minden kísérlet során azonos formára és méretre állítottuk be. A vesék esetében az elemzés előtt kiszámolták a jobb és a bal vese adatait. Az egyes napokra vonatkozó 6 időpontról származó adatok átlagos foton/s értékét 100% -nak neveztük ki, és az egész napra vonatkozó biolumineszcens ritmust az egyes szervek 6 időpontos sorozatának százalékában fejeztük ki. Ezen normalizált% adatok csúcsfázisát és amplitúdóját egyszerű cosinor eljárás program (Acro.exe, 3.5 verzió; Dr. Refinetti tervezte 36) segítségével határoztuk meg.

Tervezett etetési protokoll

Az ütemezett etetési kísérlet esetében az összes egeret külön-külön ketrecekben helyezték el, amelyek élelmiszer-adagolókat (Pellet Dispenser 45 MG; Med-Associates, St. Albans, VT) tartalmaztak. SZOLGÁLTATÁS). ) a 22. időzítő által szabályozott; ezeknek az étkezéseknek ugyanaz volt az ételtérfogata.

Az egereket 3 csoportra osztottuk, és 20%, 25% vagy 40% -ban etettük a szabadon táplált egerek által elfogyasztott táplálék mennyiségének korlátozásával: 20%, 3, 24 g vagy 72 pellet; 25%, 2,7 g vagy 60 pellet; és 40%, 2, 43 g vagy 54 pellet naponta. 20% -os táplálékkorlátozás mellett, napi 6 étkezéskor az egerek minden héten legalább 3 percig ettek az étrend etetése után; ezt egy reprezentatív egér videomegfigyelésével állapítottuk meg. Az 1. ábrán bemutatott adatok azokra az eredményekre vonatkoznak, amelyeket akkor kaptunk, amikor az egereket napi 6 étkezéssel etették, ZT 0, 4, 8, 12, 16 és 20 hőmérsékleten. A későbbi kísérletek során napi 20% -os táplálékkorlátozást alkalmaztunk. Az emberi étkezési szokások utánzásához 0,9 g-ot (a teljes napi ételtérfogat 27% -a) biztosítottak reggelire a ZT 12-ben. A ZT 17-ben 1, 2 g (36%) ételt biztosítottunk ebédre, míg ZT 1, 3 vagy 4 ételt vacsorára (3B és C ábra). Minden kísérletben a perifériás órákat csak két héttel figyeltük meg az egyes etetési állapotok megkezdése után.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A statisztikai elemzéshez egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), Tukey-Kramer-tesztet vagy párosítatlan vagy párosított Student-féle t-tesztet használtunk. A statisztikai elemzést StatView szoftverrel (Windows 5.0, SAS Institute) végeztük.

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.