elemeket

absztrakt

A bél mikrobiózisa sok feltételezett anyagcsere és szabályozási útvonalon keresztül lép kölcsönhatásba a gazdaszervezet fiziológiájával, amelyek befolyásolják az egészséget és a betegségeket 1, 2. A mikrobiózis részt vesz az étrend által kiváltott elhízás kialakulásában, de a mögöttes mechanizmusok nincsenek teljesen tisztázva 3, 4 .

A rost védett az 5., 6., 7. étrend okozta elhízás kialakulása ellen. A rostok hatásait nagyrészt a bélbaktériumok fermentációjának és a metabolitok, például a rövid láncú zsírsavak (SCFA), a vastagbél hámjának, a splanchnicus szöveteknek és a perifériás szerveknek a felvételének tulajdonítják. Például a butirát stimulálja a bél glükoneogenezisét a propionát és az SCFA metabolizmus révén a májban, szabályozza a glükóz és lipid anyagcserét, valamint az energia homeosztázisát 8, 9. Az étkezési rostok és az SCFA-k beszámoltak arról, hogy korlátozzák a súlygyarapodást a 10., 11., 12. rágcsálók csökkent táplálékfogyasztása következtében, és közvetetten összefüggenek a testtömeg-növekedéssel az embereknél .

Az étkezési rost különféle növényi eredetű poliszacharid és oligoszacharid. A bélbaktériumok abban különböznek egymástól, hogy lebontják és felhasználják az élelmi rostokat, következésképpen a különféle élelmi rostok jelentősen megváltoztatják a bél mikroflóra összetételét Vizsgálatunk célja elsőként annak meghatározása volt, hogy hét különféle étrendi rost (árpa béta-glükán, alma pektin, inulin, inulin sav észter, inulin propionát észter, inulin butirát észter vagy inulin propionát észter és inulin butirát észter kombinációja) az in vitro fermentációs vizsgálat. 17 mind egyformán védettek az étrend okozta elhízás megelőzésében egerekben, és hogy ez összefüggésben volt-e specifikus vakbaktériumos profilokkal. Mivel a rostok egyik lehetséges hatásmechanizmusa az SCFA előállítása, az egyes inzulin-észter-észtereket is bevontuk az egyes SCFA-k szerepének felmérésére 18, 19. A második cél az volt, hogy meghatározzuk a gélrost expressziójának összefüggését a vakbélben, az első olyan szervben, amelyet a cecalis baktériumok és a máj különbségei, a belek közötti portális szerv és a szisztémás keringés befolyásol, és hogy ez összefüggésbe hozható-e a bakteriális profilokkal.

Erre a célra az étrend okozta elhízás jól meghatározott modelljét alkalmaztuk. Korábban kimutattuk, hogy a hím C57B1/6J egerek 12 hetes korban (24-25 gramm) gyorsan és kiszámíthatóan híznak a testtömegben, az adipozitásban és a máj lipidtartalmában, ha HFD 20-at etetnek. Ezt a modellt használva a jelenlegi tanulmányhoz az étrendi szénhidrátokat manipuláltuk, hogy a kukoricakeményítő és a cellulóz arányát a HFD-ben különböző fermentálható rostokkal helyettesítsük (árpa béta-glükán, almas pektin, inulin, inulin sav észter, inulin propionát észter, inulin butirát észter) . vagy inulin-propionát-észter és inulin-butirát-észter kombinációja). A vakbél tartalmából gyűjtött baktériumok intervenciós utáni profiljának elemzésével egyidejűleg mértük a táplálékfelvételt és az adipozitást az Illumina MiSeq szekvenálással és a kapcsolódó gazdasejt génexpresszióval a vakbélben és a májban.

az eredmény

Testösszetétel és táplálékfelvétel

gátolják

Plazma leptin, inzulin, rezisztin és PYY válaszok magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplált egerekben (HFD), ahol 10 tömeg% szénhidrátot (5 tömeg% kukoricakeményítő, 5 tömeg% cellulóz) béta-glükán (HFD + bglukán) váltott fel, alma-pektin (HFD + inulin P), inulin (HFD + inulin), inulinsav-észter (HFD + inulin A), inulin-propionát-észter (HFD + inulin P), inulin-butirát-észter (HFD + inulin B), inulin-propionát és butirát észter, egyenként 5% (HFD + inul PB) és alacsony zsírtartalmú étrend (LFD). Átlagos ( A ) Leptin ( B ) Inzulin, ( C ) Rezisztin (n = 5-7) és ( D ) PYY (n = 3–7). Jelentős (p

Teljes méretű kép

A vakbél baktériumprofilokat a legtöbb állat étrendje alapján külön csoportosítottuk. A hozzáadott rost nélküli LFD-t és HFD-t csoportosítottuk, jelezve, hogy a rost jelenléte a közösségi teljes összetétel fő mozgatórugója. A metasztata és az LEfSe elemzések (a lineáris diszkrimináns elemzés hatásának nagysága) megerősítették, hogy a komponens taxonokban nagyszámú jelentős különbség van a két csoport és az összes rostot tartalmazó csoport között (S4 kiegészítő készlet). Ezzel szemben a hozzáadott rost nélküli két étrendi csoport (LFD és HFD) kevésbé szignifikáns különbségeket mutatott közöttük (S5 kiegészítő készlet). Megfigyeltük azt is, hogy a négy inulinészter két egyértelmű csoportra oszlott, a HFD + inul A/HFD + inul P és a HFD + inul B/HFD + inul PB csoportosulva (3B. Ábra, S3 kiegészítő készlet). Két különböző klaszterezési módszer (Jaccard, amely csak az OTU jelenlétét/hiányát tartalmazza, és Bray Curtis, amely az egyes OTU-k arányos bőségét is tartalmazza a különbségek összehasonlításakor) feltárta az étrend rendkívül jelentős hatását (P 1,5-szeres különbség (P 1,5 -szeres különbség (P

A mikroarray és a válaszadatok validálása magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben, ahol 10 tömeg% szénhidrátot (5% kukoricakeményítő, 5% cellulóz) béta-glükán (HFD + bglucan), alma-pektin (HFD) váltott fel . + pektin), inulin (HFD + inulin), inulinsav-észter (HFD + inulin A), inulin-propionát-észter (HFD + inulin P), inulin-butirát-észter (HFD + inulin B), inulin-propionát és butirát-észter, mindegyik 5% (HFD + PB) és alacsony zsírtartalmú étrend (LFD). ( A ) RT Profiler PCR Kiválasztott célgének tömbje, amelyek megváltoztatott génszabályozást mutatnak a cecum microarray elemzésből származó HFD + inul és HFD + PB válaszként. Az összetétel változását a HFD-vel táplált egerekhez viszonyítva az UBE2D2-re normalizált átlagos géncél felhasználásával számítottuk (n = 6). ( B ) Az Enho gén expressziója a HFD + DF vagy LFD táplált egerek májában a HFD-hez viszonyítva. Az összetétel változását a HFD-vel táplált egerekhez viszonyítva az UBE2D2-re normalizált átlagos Enho-érték felhasználásával számítottuk (n = 6). ( C ) A máj adropinszintje. A HFD-vel táplált egerekkel végzett vizsgálatok összehasonlításához a delta CT értékeken alapuló Student-féle t-tesztet használtuk. * P ** P *** P 1, ötszörös különbség P

Az ismert génekhez kapcsolódó megváltozott ontológiák és utak 1,5-szeres különbségeket mutatnak (P

Az SAA1 és az SAA2 génexpressziója a magas zsírtartalmú (HFD) étrenddel táplált egerekhez képest a HFD-vel táplált egerek vakbéljében és májában, ahol 10 tömeg% szénhidrátot (5% kukoricakeményítő, 5% cellulóz) béta-glükán váltott fel (HFD + bglucan), alma-pektin (HFD + inulin P), inulin (HFD + inulin), inulinsav-észter (HFD + inulin A), inulin-propionát-észter (HFD + inulin P), inulin-butirát-észter (HFD + inulin B ), inulin-propionát és butirát-észter, egyenként 5% (HFD + PB) és alacsony zsírtartalmú étrend (LFD). A génexpressziót a HFD-vel táplált egerekhez viszonyítva az UBE2D2-re normalizált átlagos géncél felhasználásával számítottuk (n = 5-6). A hallgatói tesztet alkalmazták a HFD-vel táplált egerekkel történő összehasonlítás tesztelésére. * P ** P *** P 21. Az étrendbe beépített cellulóz (International Fiber Corporation) nem rendelkezik fűtőértékkel a gazda számára, és a HFD + DF étrendben élelmi rostokkal helyettesítették. Mivel a HFD és az élelmi rostot tartalmazó HFD diéta (1D. Ábra), valamint az étrend okozta elhízás elleni védelem (1A-C. Ábra) között nem volt kimutatható változás a táplálékfelvételben, eredményeink szerint a tiszta kalória alacsonyabb lehet.

Az SAA1 és az SAA2, az A szérum amiloid akut fázisának fő izoformái, a vastagbéllel bélelt lumenális felületes hám expresszálja, és úgy gondolják, hogy antibakteriális szerepet játszanak, amely segít fenntartani a hám immunháztartását 32. A kódolt fehérjék kiválasztódnak a lumenbe, szerepet játszanak a gram-negatív baktériumok természetes felismerésében, csökkentik a 32, 33 baktériumok életképességét, és csökkent gyulladásos bélbetegség kockázatával járnak 32. Az SAA1 és az SAA2 a HFD + DF hatására csökkent volt a májban. A HFD növeli a máj gyulladásos válaszát a keringő SAA 20 növekedésével. A máj csökkent gyulladásos válaszát az alacsonyabb SAA1 és SAA2 szint bizonyítja. Tanulmányok kimutatták, hogy a sérült bélhám a keringő SAA megnövekedett szintjét eredményezi, valószínűleg a májból 34. Így a rost SAA1-re és SAA2-re gyakorolt ​​ellentétes hatása a vakbélben és a májban összefüggésbe hozható (5E. Ábra).

Az élelmi rostok szabályozzák a Tex19-et. 1. ábra, amelynek expressziója a pluripotens 35 őssejtekben korlátozott, és gátolja a 36 retrotranszpozonokat. Tex19. Az 1. ábra potenciálisan stabilizálja a bél őssejt genomját a bélhám replikációja és regenerációja során, összekapcsolva a rostbevitelt rákellenes hatásokkal.

mód

Állatok és étrendi beavatkozás

Vakbaktériumok elemzése

A genomi DNS-t (gDNS) a vakbél tartalmából extraháltuk a FastDNA® SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, Illkirch, Franciaország) segítségével. Az étrendi beavatkozások után kvantitatív PCR-rel becsültük a teljes cecalis baktérium-bőséget, és a baktériumok 16S rRNS-génjeinek V3-V4 régióját szekvenáltuk az Illumina MiSeq-en egy v3 áramlási sejt segítségével, 2 × 300 bp páros végállással (a későbbi elemzés teljes részletei) az alkalmazott lépések az S2 kiegészítő fájlban találhatók). A tanulmány során generált szekvenálási adatok elérhetők az SRA adatbázisban az SRA csatlakozás SRP117745 alatt (elérhető: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP117745).

Plazma hormonok

A hormonokat a szívpunkcióból (CP) vagy a májkapu vénájából (HPV) (n = 4–8) mértük az általános felhasználásra szánt proteázinhibitor koktél beépítésével (Sigma cat # P2714), Millipore MILLIPLEX MAP egér metabolikus hormon mágneses plazmájából. Gyöngypanel (Merck Millipore, Feltham, Egyesült Királyság).

Májzsír

Az összes zsírt kivontuk a bal máj lebenyéből Folch és mtsai. 43 és a zsír tömege mikrogramm májszövetben számítva.

A teljes genom mikroarray elemzése

A májból és a vakbélből RNeasy Mini Kit (Qiagen, Crawley, Egyesült Királyság) segítségével kivont összes RNS-t mikroszkóposan festettük SurePrint G3 egér GE 8 × 60 K Microarray G4852A (Agilent Technologies, UK) (Supplementary File S2) segítségével. Az adatokat az NCBI Gene Expression Omnibus 44-je tárolja, és a GEO sorozat GSE106375 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE106375) hozzáférési számán keresztül érhetők el. A mikrorajz adatok statisztikai elemzésének részleteit az S2 kiegészítő fájl tartalmazza.

A mikroarray megerősítette a génexpressziós különbségeket egyedi tervezésű RT Profiler PCR tömbök alkalmazásával

A vakbélben lévő HFD + inulin vagy HFD + inul PB észterekre megváltozott reakciót mutató géneket mikroarray elemzés alapján azonosítottuk, és egyedi tervezésű RT Profiler PCR Array (Qiagen) alkalmazásával validáltuk (S2 kiegészítő fájl).

Valós idejű PCR

A valós idejű PCR-vizsgálatokhoz kiegészítő cDNS-sablonokat készítettünk Superscript II (Invitrogen) reverz transzkripcióval írt teljes RNS-ből, és Taqman-vizsgálatokat végeztünk duplex cél és UBE2D2 referenciagénnel. (S2 kiegészítő fájl).

Máj adropin (Enho)

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) kitet (Cusabio USA) használtunk az adropin mérésére a gyártó utasításainak megfelelően. (S2 kiegészítő fájl).

Statisztikai analízis

A vakbél mikrobiota szekvenálásának statisztikai elemzéséről, a vakbél és a máj mikroarray adatainak részleteiről az S2 kiegészítő fájlban találhatók. Egyéb adatokat átlag ± SEM-ként adunk meg, és a GenStat (Gen Stat®13th Edition (VSN International, Ltd., Hemel Hempstead, UK) alkalmazásával elemezzük), kivéve az RT-PCR adatokat, amelyeket logaritmikus (delta CT) skálán elemeztek, de bemutattak mint hajtásváltozás (anti-logged különbségek), standard hibák nélkül. Az étrendcsoport összehasonlítását a magas zsírtartalmú csoporttal t tesztek segítségével végeztük. Egyetlen faktor hatását és az étrendcsoportok összehasonlítását egyirányú ANOVA segítségével Több összehasonlítást teszteltünk vagy Fisher védett, vagy nem védett LSD-teszt alkalmazásával. A ferde adatokat statisztikai elemzés előtt log transzformáltuk.

köszönöm

Ezt a munkát a skót kormány vidéki és környezettudományi és elemző szolgáltatási részlegének stratégiai partnersége támogatta. Elismerjük továbbá az Aberdeen Egyetem által finanszírozott Maxwell számítási klaszter támogatását. Köszönjük Gill Campbellnek a mikroarray elemzés elvégzését, Donna Hendersonnak a májzsír-elemzést (Rowett Intézet, Aberdeeni Egyetem) és Pete Hedley-nek (James Hutton Intézet, Dundee) az Agilent tömbök beolvasásáért.

Elektronikus kiegészítő anyag

További információ

Kiegészítő adatkészlet

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.