- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- A szója peptid elnyomta a DMBA által kiváltott emlő tumorgenezist
- A szójapeptid elnyomta a HSP90 és NF-kB fehérjék expresszióját in vivo
- Szója peptid által kiváltott apoptózis az emberi emlőrák sejtjeiben
- vita
- mód
- vadállat
- Fogyókúra és szójapeptid készítése
- Mell tumorogenezis modell
- Mikrochip elemzés
- Immunblot analízis és a kaszpáz-3 aktivitás kolorimetriás vizsgálata
- immunhisztokémia
- Sejtkultúra és MTT vizsgálat
- Apoptózis tesztek
- Statisztikai analízis
- szójegyzék
absztrakt
A karcinogenezis során az NF-κB a proliferáció, az angiogenezis és az áttétek normális kontrolljának deregulációjával járó folyamatokat közvetíti. Így az NF-κB szuppressziója összefügg a rák kemoprevenciójával. A kollektív eredmények azt mutatják, hogy a 90-es hősokk-fehérje (HSP90) molekuláris chaperone és része az IκB kináz (IKK) komplexnek, amelynek központi szerepe van az NF-κB aktiválásában. A HSP90 stabilizálja a sejtciklus-szabályozásban és az apoptózis szignálozásában részt vevő kulcsfontosságú fehérjéket is. Megvizsgáltuk, hogy az izoflavonhiányos szójapeptid exogén beadása megakadályozta-e a 7,12-dimetilbenz [a] antracén (DMBA) által kiváltott patkány tumorgenezist patkányban, és megvizsgáltuk a hatásmechanizmust. A szójapeptid étrendi adagolása (3,3 g/patkány/nap) jelentősen csökkentette a duktális karcinómák előfordulását (50%), a daganatok számát egy több daganatot hordozó patkányonként (49%; P
Patkány emlőmirigy DMBA által kiváltott tumorgenezisének kísérleti tervezése. A 4 hetes Sprague Dawley nőstény patkányok három csoportját 4 hétig kontroll étrenddel vagy szójapeptid diétával etették a DMBA beadása előtt. Minden étrend a 9. héttől a kísérlet végéig folytatódott. Minden csoport 12 patkányból állt. Kontroll étrend + szezámolaj adagolása; Kontroll étrend + DMBA beadás; Szója peptid diéta + DMBA beadás.
Teljes méretű kép
Asztal teljes méretben
Asztal teljes méretben
A szójapeptid in vivo elnyomja az NF-KB és HSP90 fehérjék expresszióját. (A) A melldaganat szövetének reprezentatív immunhisztokémiai festése kontroll étrendből + DMBA és szójapeptid + DMBA csoportból. A HSP90 és az NF-kB fehérjék immunhisztokémiai festése (p65) erős pozitív festődést mutatott a kontroll étrend + DMBA csoport (bal oldali panel) ductalis carcinomában, míg a szójapeptid + DMBA csoportban az egyes fehérjék nagyon gyengén festődtek (jobb oldali panel), kezdeti nagyítás, 400 ×. (B) A szójapeptid hatása az apoptózis-asszociált fehérje expressziójára. Az egyes csoportok állataiból nyert mellszövetből előállított teljes szövetkivonatot Western-blot-analízissel elemeztük a jelzett antitesttel, az eljárások szerint. A Β-aktint használtuk terhelés kontrollként. (C) A szójapeptid + DMBA csoport növeli a kaszpáz-3 aktivitást. A kaszpáz-3 aktivitást DEVD szubsztrát alkalmazásával kontrollált étrendből előállított teljes szöveti lizátumokkal + DMBA daganatok vagy szójapeptid + DMBA alkalmazásával vizsgáltuk.
Teljes méretű kép
Szója peptid által kiváltott apoptózis az emberi emlőrák sejtjeiben
Annak megvizsgálására, hogy a szójapeptid elnyomta-e az emberi emlőrák sejtjeinek növekedését, az MCF-7 sejteket 72 órán át inkubáltuk különböző koncentrációjú szójapeptid jelenlétében, és a sejtek növekedését MTT vizsgálattal értékeltük. A szójapeptid dózisfüggő módon gátolta az MCF-7 sejtek növekedését, a sejtek életképességének majdnem 50% -os elnyomásával 500 μM koncentráció mellett (4A. Ábra). A szójapeptid kezelése 1 mM nyomáson 24 órán át jelentős nukleáris fragmentációt váltott ki, amit a DAPI magfestés, valamint a sejt morfológiai változásai bizonyítanak (4B. Ábra). Az apoptózis indukcióját az anneksin V-PI kettős festése is megerősítette (4C. Ábra). Megfigyeltük az apoptózis> 7-szeres növekedését a szójapeptiddel kezelt sejtekben.
Az NF-κB és HSP90 szójapeptiddel való szuppressziója az emberi emlő MCF-7 sejtjeinek apoptózisát indukálja. (A) Az MCF-7 sejteket 96 lyukú lemezre szélesztettük 5x103 sejten, és 37 ° C-on inkubáltuk. Egynapos inkubálás után a sejteket friss kontroll táptalajban vagy a szója jelzett koncentrációját tartalmazó friss táptalajban tenyésztettük. peptidet 72 órán át. A sejtek növekedését az átlagos abszorbancia alapján határoztuk meg. Mindegyik kísérletet három példányban hajtottuk végre. (B) A szójapeptid nukleáris fragmentációt indukál. A 4-kamrás tárgylemezre borított MCF-7 sejteket 24 órán át 1 mM szójapeptiddel kezeltük, majd etanolban rögzítettük, majd DAPI festést végeztünk. A sejtmorfológiát fénymikroszkóppal figyelték meg, a magokat pedig fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálták. (C) Apoptotikus sejthalál indukálása szójapeptiddel. A táptalajjal vagy 1 mM szójapeptiddel 24 órán át kezelt MCF-7 sejteket FITC-vel jelölt annexin V-vel és PI-vel inkubáltuk, majd FACS-mal elemeztük. (D) Összefoglaló a mell tumorigenesisének izoflavonmentes szójapeptiddel történő szuppressziójára.
Teljes méretű kép
vita
A szójapeptid kemopreventív és tumorszuppresszív hatásának mechanizmusának további vizsgálatához kerestük a célmolekulákat, és a HSP90-et találtuk az egyik szabályozott génnek. Ezenkívül a cDNS-mikroszkóppal a ciklinfüggő kináz 4 (cdk4) és a VEGF mRNS drámai szuppresszióját mutattuk ki szójapeptidetett táplált patkányok szöveteiben (3. táblázat). Összességében a szójapeptid kemopreventív és tumorszuppresszív hatást fejthet ki az NF-κB által közvetített jelátvitel gátlásával.
A HSP90 olyan molekuláris chaperone, amely a rákos sejtek vagy mindkettő növekedésének vagy túlélésének elősegítésében szerepet játszó számos jelzőfehérje stabilitásához és működéséhez szükséges. Fontos fehérjéket, például Akt, Raf, Cdk4, Her2 és HIF-1α HSP kliensekként azonosítottak, akik gyakran részt vesznek a rákos sejtek túlélési útjainak átfedésében (Maloney és Workman, 2002; Neckers és Ivy 2003; Takayama et al. Et al.)., 2003). A HSP90 tagokra szükség van az IKK komplex és az NF-KB indukálható és konstitutív aktivitásához is (Broemer és mtsai, 2004). A cDNS mikroarray elemzésünk arra is utal, hogy a szójapeptid részt vehet más fontos folyamatokban, például a tumor inváziójában és az angiogenezisében, a kulcsgén expressziójának szabályozásában és aktivitásában. A szójapeptid együttesen számos fontos biológiai folyamatot gátolhat, amelyek szerepet játszanak az apoptózisban, a sejtciklus progressziójában, az angiogenezisben és a tumor inváziójában, ami kemovevenciós és szuppresszív hatást eredményez a mell tumorigenesisére in vivo. .
Röviden, a vizsgálat egyik fő megállapítása az volt, hogy az izoflavonmentes szójapeptid kemopreventív és szuppresszív hatásait fejtheti ki a tumorra, gátolva a tumorgenezis számos aspektusában részt vevő NF-κB jelátviteli utat. A fő angiogén faktor, a VEGF szójapeptid általi elnyomása arra utal, hogy az emlőrák kialakulásában az NF-κB szuppresszió közvetíti az antiangiogén hatását. A szójapeptidnek az angiogenezisben és metasztázisban részt vevő egyéb folyamatokra, valamint a gyógyszerrezisztenciára gyakorolt hatásait vizsgáló tanulmányok további betekintést nyújtanak az izoflavonhiányos szójapeptid mechanizmusába az emlőrák megelőzésében és/vagy szuppressziójában, minimális mellékhatások mellett. .
mód
A nőstény Sprague-Dawley patkányokat a Daehan Biolink Co., LTD-től (Chungbuk, Korea) szereztük be. Három hetes korban a patkányokat 1 hétig AIN-76 növekedési étrenddel (American Institute of Nutrition 76) etették. Az állatokat állandó hőmérsékleten (22 ± 2 ° C) és páratartalomban (55 ± 5%) tartott helyiségben tartottuk napi 12 óra fény és 12 óra sötétség alatt. Négy hetes korban a patkányokat a három csoport egyikébe osztották: 1) kontroll étrend + szezámolaj csoport (n = 12) kontroll étrendet kapott és negatív kontrollként szolgált; 2) kontroll étrend + DMBA csoportot (n = 12) jelöltek pozitív kontrollként, és kontroll étrendet kaptak; és 3) a szójapeptid + DMBA csoport (n = 12) szójapeptidet tartalmazó kísérleti étrendet kapott (lásd alább). Az étrendeket por formában, a csapvizet pedig szükség szerint biztosítottuk mindhárom csoport számára.
Fogyókúra és szójapeptid készítése
Az AIN-76 diéta az American Institute of Nutrition 76 módosított étrendje volt, amely 18% fehérjét, 10% zsírt, 15% kukoricakeményítőt, 5% cellulózot, 3,5% AIN-76 ásványi anyag keveréket, 1% AIN vitamin keveréket, 0,2, 2% kolin-bitartarát és 47,3% szacharóz. A kontroll étrend kazeinfehérjét biztosított, izokaloros és izoprotein volt. A szójapeptid étrend is biztosított
Mell tumorogenezis modell
Mikrochip elemzés
A kivágott emlődaganatokból származó teljes RNS-t TRIzol extraktor (Gibco BRL, Rockville, MD) alkalmazásával izoláltuk a gyártó ajánlása szerint. Az MRNS integritását 1% -os agarózgél-elektroforézissel denaturáljuk. A patkány cDNS mikrotömbje a GenomicTree Inc. Patkánygén-indexéből kiválasztott 5K cDNS-klónokat tartalmazott. (Dajejun, Korea).
Immunoblot analízis és a kaszpáz-3 aktivitás kolorimetriás vizsgálata
A normál patkány emlőmirigyeket és emlődaganatokat (egyenként 100 mg) 800 μl jéghideg homogenizációs pufferben (20 mM HEPES [pH 7,4), 75 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,2 05% Triton X homogenizáltuk). -100, 20 mM β-glicerin-foszfát, 1 mM Na 3 VO 4, 0,5 mM DTT, 10 mM NaF és proteáz inhibitor koktél (Roche, Mannheim, Németország) a korábban leírtak szerint (Lee és mtsai, 2002) Szöveti lizátumok (50 μg ) SDS-PAGE-val elválasztottuk és immunblotoltuk az NF-κB (p65, 1: 500), HSP90 (1: 1000), p53 (1: 1000), p21 (1: 500) és kaszpáz- 3 (1: 1 000), majd inkubálás megfelelő HRP-konjugált másodlagos antitestekkel 1 órán át, majd ECL reagenssel detektáljuk (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL), a korábban leírtak szerint (Park és mtsai, 2005). a kaszpáz-3 aktivitás meghatározásához az egyes szövetlizáták 40 μg-ját inkubáltuk i c DEVD szubsztrátot (Calbiochem) 30 ° C-on 3 órán át, majd az abszorbanciát 405 nm-en (OD 405) mértük Xfluor 4 spektrometriás leolvasóval (TECAN, Ausztria).
immunhisztokémia
Az immunoperoxidáz festést a gyártó által rendelkezésre bocsátott protokollok szerint (Dako LSAB kit; Dako, Carpinteria, CA) végeztük, amint azt korábban leírtuk (Nam és mtsai., 2001). Röviden, a tárgylemezekre rögzített 5 μm vastag metszeteket a jelzett primer antitestekkel (anti-NF-KB [p65], 1: 500; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia) vagy anti-HSP90 antitestekkel (1) kezeltük.: 1000; Stressgen Biotechnologies, Victoria, Kanada), majd inkubálás biotinilezett szekunder antitestekkel. A kötött peroxidázt szubsztrát-DAB oldat hozzáadásával vizualizáltuk, és a tárgylemezeket Mayer hematoxylinnel (DAKO) ellenfestettük a magok festésére. A pozitívan festett sejtek barnának, míg a negatív sejtek kéknek tűntek.
Sejtkultúra és MTT vizsgálat
Az emberi emlő adenokarcinómából származó MCF-7 sejteket az American Type Culture Collection-ből (ATCC, Rockville, MD) szereztük be. A sejteket 10% FBS-sel, 1% penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített RPMI 1640-ben tenyésztettük 5% CO 2 atmoszférában 37 ° C-on. Az MTT kolorimetriás vizsgálatot a fent leírtak szerint hajtottuk végre (Park és mtsai., 2001). A növekedés gátlását átlagos abszorbanciával mértük lemezolvasóval (Termomax, Molecular Device) 540 nm-en. Mindegyik kísérletet három példányban hajtottuk végre.
Apoptózis tesztek
Az apoptózis által közvetített sejtpusztulást a leírtak szerint vizsgáltuk (Lee és mtsai, 2008), kisebb módosításokkal. Röviden: az MCF-7 sejteket kamra tárgylemezekre oltottuk 5x104 sejt/lyuk sűrűségben, majd 24 órán át 1 mM szójapeptiddel kezeltük RPMI 1640 táptalajban. A sejteket inkubáltuk V-val és fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt propídium-jodiddal (PI) 15 percig, majd elemeztük egy FACS Vantage-on (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia). A sejtmag morfológiájának értékeléséhez a sejteket tárgylemezre helyeztük, metanolban rögzítettük, és DAPI-val (1 μg/ml metanolban) 15 percig festettük, háromszor mostuk 1 x PBS-sel, majd VectaShield-szel (Vector Laboratories) kezeltük ( Burlingame, USA), CA) és fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk.
Statisztikai analízis
Meghatároztuk a testsúlyt és a táplálékfelvételt, és az adatok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját egyirányú ANOVA-val értékeltük. A tumor súlyát, a látenciát, a tumor térfogatát és a tumor multiplicitását független t-teszttel számoltuk minden időpontban. A COX-2 valószínűségi értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük