Snow MŰSZAKI BRN EGYETEM F TECHNLGY Kar Kémia Tanszék Kémia PTRAVIN A BITECHNLGIÍ KAR F Kémiai Intézetében F FD TUDOMÁNY ÉS BITECHNLGY IZLACE BSAHVÝCH S Cannabis sativa ÉS ANTIFLGISTICKÝ HATÁS ISLATIN F CMPUNDS UDF Cannabis sativa és anti-INFLAMMATRY HATÁS DIPLMVÁ JOB MASTER S ÉRTEKEZÉS TÉZISEI AUTR PRÁCE Bc. BARANVÁ ZUZANA AUTHR FELÜGYELŐ PharmDr. Daniela VESELÁ FELÜGYELŐ BRN 2015

brno

Brünni Műszaki Egyetem Vegyészmérnöki Kar Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12 A diplomamunkám feladati űrlapja A diplomamunka száma: FCH-DIP0892/2014 Tanév: 2014/2015 Tanszék: Élelmiszerkémiai és Biotechnológiai Tanszék Hallgató: Bc. Zuzana Baranová Szak: Élelmiszerkémia és technológia (N2901) Tanulmányi terület: Élelmiszerkémia és biotechnológia (2901T010) Szakdolgozat témavezető PharmDr.Daniela Veselá Tanácsadók: doc. Ing. Jirina Melkova, CSc. Diplomamunka címe: A Cannabis sativa alkotórészeinek izolálása és antiphlogisztikus hatása Diplomamunka feladata: 1. Készítse el a kérdés irodalmi áttekintését 2. Írja le az alkalmazott értékelési módszereket 3. Feldolgozza a kísérletekben mért eredményeket 4. A kapott eredményeket értékelje a megbeszélés formája Diplomamunka benyújtásának dátuma: 2015.5.11. A diplomamunkát a dékán által meghatározott számban a tanszék titkárságára, elektronikus formában pedig a szakfelügyelőhöz nyújtják be. Ez a feladat a diplomamunka melléklete. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Időszámításunk előtt. Zuzana Baranová PharmDr. Daniela Veselá prof. RNDr. Ivana Marova, CSc. Hallgatói témavezető a brünni intézet igazgatója, 2015. január 30-án - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. A kar dékánja

BARANVÁ, Z. A Cannabis sativa alkotórészeinek izolálása és antiphlogisztikus hatása. Brno: Brünni Műszaki Egyetem, Kémiai Kar, 2015. 73 p. Témavezető PharmDr. Daniela Veselá. NYILATKOZAT Nyilatkozom, hogy a diplomamunkát önállóan készítettem el, és hogy az összes felhasznált irodalmi forrást helyesen és teljes mértékben megemlítettem. A diplomamunka a Brnoi Kémiai Kar tulajdonát képezi, és kereskedelmi célokra csak a szakfelügyelő és az FCH DE dékánjának beleegyezésével használható fel. hallgató aláírása Köszönetnyilvánítás: Szeretnék köszönetet mondani a PharmDr. Veselej Dániel a rám szánt időre és a diplomamunkám kidolgozásában megindító tanácsokra. Köszönet illeti az RNDr-t is. Jan Hošek, Ph.D., aki elkísért a gyulladáscsökkentő tevékenység mérésében és megismertetett a kérdéssel. 4

4.1.6 A frakciók elválasztása. 47 4.2 Azonosítás. 52 4.2.1 Az UV-spektrumok elemzése. 52 4.2.2 IR-spektrum elemzés. 53 4.2.3 Azonosítás NMR módszerrel. 54 4.2.4 Az izolált anyagok azonosításának eredményei. 55 4.3 THP1 sejtek előkészítése. 56 4.3.1 Módszerek. 56 5 Következtetés. 60 6 Idézett irodalom. 63 7 Rövidítések listája. 71 6

Flavon-apigenin-luteolin 5,7,4'-H 5,7,3 ', 4'-H Flavonol-kaempferol-morin-kvercetin-rutin 3,5,7,4'-H 3,7,2', 4 ', 5'- H 3,5,7,3 ', 4'-H 5,7,3', 4'-H; 3- R2 Flavanone (dihidroflavon) heszperidin-naringenin-taxifolin 5,7,3 ', 4'-H 5,7,4'-H 3,5,7,3', 4'-H izoflavongenisztin 5,4'-H; 7- R3 antocianin-apigenidin-cianidin 5,7,4'-H 3,5,7,4'-H; 3,5-CH3 * kalkon-trihidroxi-kalkon, 2,4,2'-H R1: gallát; R2: ramnoglükóz; R3: glükóz * A kalkonok a flavonoidok prekurzorai, de egyes szerzők a flavonoidok általános csoportokba sorolásába sorolják őket [10]. 2.4.1 A flavonoidok fő alcsoportjai 2.4.1.1 Halkonok A kalkonok a flavonoidok prekurzorai. Jellemzőjük, hogy a flavonoid csontváz alapszerkezetében nincs C-gyűrű. Ezért őket nyílt láncú flavonoidoknak is nevezik. A kalkonok közé tartoznak például a floridzin, a floretin és a kalkonarenin. Jelentős mennyiségben találhatók paradicsomban, körtében, eperben és bizonyos rosttermékekben. A kalkonok és származékaik sok táplálkozási és biológiai előnyük miatt figyelmet érdemelnek [11,12]. A bekezdés alatti ábra (lásd a 2. ábrát) azt az alapszerkezetet mutatja, amelyből az összes kalkon származik. Chalkón brázok č. 2: A chalkon 11 alapszerkezete

H H H H Quercetin H 2.8.1.9 Vitexin brázok č. 16. ábra: A quercetin Vitexin szerkezete (lásd a 17. ábrát) flavonoid C-glükozid kategóriába sorolva. A vitexin in vivo metabolizmusát patkányokban értékelték. A Vitexin apoptózist indukál és elnyomja a tumorsejtek növekedését, potenciálisan antioxidáns hatást fejt ki, és hatékonyan alkalmazható az UV-sugárzás által kiváltott káros bőrreakciók, például a szabad gyökök termelése és a bőrsejtek károsodásának megelőzésére [54,55]. A Vitexin potenciális hipotenzív hatást fejt ki a ganglion blokád miatt. Jelentős védőhatása van a szívizom sérüléseivel szemben. A gyulladáscsökkentő hatást antihisztamin, antibradikinin és antiszerotonin tulajdonságai alapján jelezték. Egyéb klinikai felhasználások közé tartozik a vírusellenes, pajzsmirigy-ellenes, antiszklerotikus és antihepatotoxikus aktivitás. A vitexin azon képessége, hogy gátolja a szuperoxid gyököket, öregedésgátló hatásának potenciális alkalmazásához vezet a kozmetikai iparban [54,55]. A vitexin és az orálisan beadott izovitexin együttesen jelentősen csökkenti az étkezés utáni vércukorszintet. serkentik az inzulin szekrécióját és gátolják az α-glükozidázt, ezáltal segítve a cukorbetegségben szenvedő betegeket [54,55]. H H H H H H H Hite Vitexin sz. 17: A vitexin szerkezete 29

Különböző oldószerekre rázva 4 részre osztottam az anyagokat. Az adagokat bepárlón elpárologtattuk, vagy víz esetén liofilizáltuk, és a kapott szárazanyagot lemértük. 3.2.1.2. Vegyszerek Acetonitril gradiens osztály (Scharlau) Benzol p.a. (Penta) kloroform p.a. (Penta) etil-acetát p.a. (Penta) ecetsav p.a. (Penta) metanol p.a. (Penta) Metanol-gradiens (Scharlau) Az alábbiakban ismertetett berendezéssel készített HPLC-víz. Körülbelül 10% víz, 10% metanol és 80% acetonitril keverékének újrahasznosítása 3.2.1.3 TLC HPLC-kromatográfiás anyag cm 20 cm, rétegvastagság 0,2 mm (Merck) analitikai oszlop: Acentis Express C8, 15 cm 2,1 mm, szemcseméret 2,7 μm előkészítő oszlop: Supelcosil TM LC-8 SEMI-PREP, 25 cm 10 mm, 5 µm-es részecskeméret: Sigma-Aldrich szilikagél 60 Å, részecskeméret 0,04 0,63 mm Rotavapor R-3 (Bűchi, Svájc) KRISTUS Alfa 1 2 LD (Krisztus, Németország) 31

Oszlopkromatográfia Helyhez kötött fázis: Mozgó fázis: szilikagél, szemcsemérete 0,040 0,063 mm kloroform, benzol, metanol 7: 2: 1 (v/v/v) arányban. Eljárás: A kloroform frakció frakcióit kb. 100,150 ml-es frakciók, a hexán frakciói körülbelül 40-50 ml-ben, majd TLC-vel és HPLC-vel analizáltuk. Az összetétel hasonlósága alapján ezeket egyesítettük, majd vákuumpárologtatón bepároltuk. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) analitikai eszköz: Agilent 1100, DAD UV detektor Helyhez kötött fázis: Acentis Express C8, 15 cm 2,1 mm, szemcseméret 2,7 μm Elúció: gradiens Mozgó fázis: 1. módszer: 0. perc: 50% MeCN, 50 % HCH (0,2%) 24. perc: 83% MeCN, 17% HCH (0,2%) 24,1. perc: 100% MeCN áramlás: 0,3 ml/perc injektálási térfogat: 1 μl Oszlop hőmérséklete: 40 C Detektálás: UV a λ 254 és 280 nm hullámhosszakon Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) félpreparatív eszköz: YL9100 HPLC rendszer Álló fázis: Acentis Express C8, 25 cm 10 mm, szemcseméret 5 µm Elúció: gradiens Mozgó fázis: 2. módszer: 0. perc: 90 perc újrahasznosított, 10% HCH (0,2%) 15. perc: 95% újrahasznosított, 5% HCH (0,2%) 15.01. perc: 100% ACN 25.01. perc: 100% MeH 40,01. perc: 90% újrahasznosított, 10% HCH (0,2%) Áramlás: 5 ml/perc injektálási térfogat: 25 μl Oszlop hőmérséklete: 40 C Detektálás: UV λ 254 és 280 nm hullámhosszon 33

3.2.2.2 Azonosítás UV-spektrofotometria Az izolált anyagok UV-spektrumát Agilent DAD UV/VIS készülékkel, HPLC-analízissel mértük. Ezeket a spektrumokat használtuk a vegyületek szerkezetének becslésére. Az eredményeket összehasonlítottuk a brünni VFU iskolai adatbázisában szereplő UV-spektrumokkal. IR-spektrofotometria Az IR-spektrumokat Nicolet Impact 400D FT-IR műszerrel mértük, mivel az áteresztőképesség függ a sugárzás hullámhosszától. A mintákat szilárd formában, ATR módszerrel mértük. A spektrum mérésére ATR korrekciót, H2 és C2 korrekciót, valamint automatikus spektrum simítást alkalmaztunk. A spektrumok kiértékelésével információt kaptunk a különböző funkcionális csoportok jelenlétéről az elemzett minta szerkezetében. Nukleáris mágneses rezonancia analízist nukleáris mágneses rezonanciával végeztek külföldön, a Mississippi Egyetemen. 34