absztrakt
A fő
A maxillofaciális rostos elváltozások az arc és az állkapocs rendellenességeinek egy csoportját jellemzik, amelynek jellemzője a csont jóindulatú kötőszöveti mátrixszal történő felváltása változó mennyiségű mineralizált anyaggal. Az ozmotikus fibroma és a rostos dysplasia a leggyakoribb fibrózisos elváltozás, amely jelentős kozmetikai és funkcionális rendellenességekkel hozható összefüggésbe; mivel a betegség progressziójának különböző mintáit mutatják, fontos megkülönböztetni őket. A megismétlődés veszélye miatt a csontosodó fibromát teljesen ki kell magozni a környező csontból. 1., 2., 3. Ezzel szemben a rostos diszpláziában szenvedő betegeket a klinikai állapotnak megfelelően kell kezelni. A monosztotikus rostos diszplázia növekedése általában stabilizálódni kezd a csontváz érettségének elérésekor; a gyermekek és serdülők műtétjét ezért a lehető leghamarabb el kell halasztani. 1, 2, 3, 4 Biszfoszfonát terápiát alkalmaznak tüneti szálas diszpláziában szenvedő betegeknél. Az arc és az állkapocs mióma csontosodásának és rostos diszpláziájának tipikus eseteit radiológiai és szövettani megjelenés jellemzi. Ezek az elváltozások azonban gyakran diagnosztikai dilemmát vetnek fel a specifikus radiológiai és szövettani jellemzők diagnosztikai jelentőségének bizonytalansága miatt; ezen elváltozások pontos diagnosztizálása ezért nehéz lehet. 1, 2, 3
Szövettanilag a sztromális fibroblasztok csontmátrixot termelnek anélkül, hogy morfológiai bizonyítékot mutatnának az oszteoblasztos sejtekről a rostos diszplázia esetén a csontszépek perifériáján. 4 Ultrastrukturális és biokémiai vizsgálatok arra utalnak, hogy a rostos diszplázia fibroblasztikus komponense összefügg az oszteogén származással; 7., 8., de pontos molekuláris biológiai bizonyítékokat erre a célra még nem nyújtottak be. A közelmúltban a mesenchymális őssejtektől származó oszteogén differenciálódást a Runx2 transzkripciós faktor vezérli. 9, 10 Ezért a Runx2 és más osteogén markerek expressziójának különbségei lehetővé tehetik a szövettani megkülönböztetést a rostos dysplasia és az ozmotikus fibroma között.
A stimuláló G fehérje (GNAS) gén alfa-alegységének aktivációs pontjában mutációt mutattak ki az Arg201 kodonban a McCune-Albright-szindrómában szenvedő betegek elváltozási szöveteiben. Ezt követően a GNAS-mutációkat figyelték meg az extragnatikus rostos diszpláziában, McCune-Albright-szindróma nélkül, 12, 13, 14, 15, amelyek felismerték azt a rostos dysplasia markerként. A gataticus fibrózis diszpláziában azonban nem vizsgálták a GNAS-mutációk jelenlétét vagy hiányát.
Ebben a tanulmányban elemeztük az oszteogén markerek és a GNAS mutációk expresszióját gnat fibrosis dysplasia és fibroma csontosodás esetén tipikus radiológiai és szövettani jellemzőkkel, hogy meghatározzuk azokat a fontos markereket, amelyek lehetővé teszik a két betegség entitás közötti differenciálást.
Anyagok és metódusok
Kísérleti alanyok
Kilenc rostos diszplázia mintát, öt csontosodó miómából, kettőt osteofibrialis diszpláziából és hármat normál csontból meszesítettünk EDTA oldatban, formalinban rögzítve és paraffinba ágyazva. Az ebben a vizsgálatban felhasznált szövetmintákat az Oszakai Egyetem Fogorvostudományi és Orvostudományi Karának Klinikai Vizsgálata Közös Bizottságának irányelvei szerint nyertük. Kilenc rostos diszplázia öt monosztotikus gnatikus esetet, valamint három monosztotikus és egyszeri poliosztotikus extragnathiás esetet tartalmazott. A fibroma csontosodásának mind az öt esete a gnat régióból származik. Mindezeket az elváltozásokat tipikus esetekként diagnosztizálták klinikai, radiológiai és szövettani kritériumok alapján. Ezekkel az esetekkel kapcsolatos klinikai adatokat röviden összefoglaljuk az 1. táblázatban. E minták szövettani szakaszait 5 μm-re vágva hematoxilinnal és eozinnal festettük, és immunoperoxidáz eljárásnak vetettük alá.
Asztal teljes méretben
immunhisztokémia
Az immunhisztokémiai festést streptavidin-biotin komplex (sABC) peroxidáz módszerrel végeztük anti-egér vagy nyúl elleni sABC rendszerrel a Dako cégtől (Glostrup, Dánia). Az ebben a vizsgálatban alkalmazott elsődleges antitestek a következők voltak: egér anti-Runx2 monoklonális antitest (MBL Co., Ltd., Nagoya, Japán), 16 nyúl anti-dentin mátrix protein 1 (DMP1) poliklonális antitest, 17 egér szarvasmarha-ellenes osteocalcin monoklonális antitestek (klón; OC4-3) (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japán) és nyúl anti-egér poliklonális osteopontin antitestek (IBL Co., Ltd., Gunma, Japán). Az antigén visszanyerését tripszin emésztéssel végeztük az osteocalcin és a DMP1 immunfestésére, és citrát pufferrel hevítettük a Runx2 és az osteopontin immunfestésére. A metszetek kissé ellentétesek voltak a metilzölddel. Egér vagy nyúl IgG szérumot (Dako) használtunk primer antitestként negatív kontrollként, egyenletes negatív eredményt adva.
Polimeráz láncreakció polimorfizmus - korlátozási hossz (PCR-RFLP)
szekvenálás
A PNA primerrel ellátott, 88 bázispárral amplifikált, egymásba ágyazott PCR-termékeket 2% -os agarózgél-elektroforézissel tisztítottuk. A sávokat kivágtuk és izoláltuk a gélből DNS-extrakciós készletekkel (QIAGEN). Az izolált DNS-t szubklónoztuk a pGEM-T Easy vektorba (Promega Co, Madison, WI, USA). Tisztítás után a szekvenálást SP6 és T7 vektorindítókkal hajtottuk végre. Léziónként tíz klónt analizáltunk egy automatizált 373 DNS-szekvenáló modell alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Így az összes PCR-amplifikált terméket szekvenáltuk a mutáció jelenlétének megerősítésére.
az eredmény
A betegek klinikai-patológiai és radiológiai leletei
A rostos diszpláziában és a csontosodó fibromában szenvedő betegek klinikai adatait az 1. táblázat mutatja be. Kilenc rostos diszplázia és öt csontosodó fibroma, amelyek az érintett csontok megnagyobbodásaként, öt rostos fibrózissal és öt csontosodó fibromával diszpláziaként mutattak arc aszimmetriát. A gnat fibrózissal járó radiológiai diszplázia homogén radioaktív opacitásokat mutatott őrölt üveggel, amely a környező normális csontba keveredett (1a. Ábra), míg a csontosodó fibroma egyoldalas kevert radioaktív és radioaktív átlátszatlan elváltozásként, élesen meghatározott határokkal jelentkezett (1d. Ábra). ). Szövettanilag a gnat fibrózis dysplasia szabálytalan alakú szövetcsontból áll, amely egy változó cellulitisz vaszkularizált rostos stromájában van (1b. És c. Ábra). A szövött csontkövek egyenletesen oszlanak el az elváltozáson, és különböző formákat mutatnak (1b. És c. Ábra). Az ozmotikus fibromák kiemelkedő meszes szerkezeteket (kockákat és cementolokat) mutattak, amelyek eozinofil vagy bazofil osteoidként vagy csontgömbökként jelentek meg a sejt közepén, sűrű stromában (1e. És f. Ábra). Így ebben a vizsgálatban olyan elváltozásokat alkalmaztak, amelyek megfelelnek a tipikus klinikai, radiológiai és szövettani kritériumoknak.
Teljes méretű kép
A rostos dysplasia és az ozmotikus fibroma immunhisztokémiai eredményei
Az extragnatikus és a gnat fibrózisos dysplasia és az ozmotikus fibroma immunhisztokémiai eredményeit a 2. ábra mutatja. Mind a fibratív dysplasiákban, mind a csontosodó fibromákban Runx2 festést figyeltünk meg az orsósejt sejtmagjában a rostos kötőszövetekben, valamint az ásványosodott sejtek felszínén található sejtekben. szerkezetek (2a - c ábra). Hasonlóképpen oszteopontint detektáltak a meszes szerkezetek perifériája körül mindkét elváltozásban (2d - f ábra). Az oszteokalcin elleni erős immunreaktivitás eloszlott a meszes szerkezetekben a rostos dysplasiaban (2g. És h. Ábra), míg az ozmotikus fibromában csak gyenge immunreaktivitás volt látható (2i. Ábra). A DMP1 specifikusan jelen volt az oszteocita-szerű sejteket körülvevő meszelt mátrixban mind a rostos dysplasia, mind az ozmotikus fibroma esetében (2j-1. Ábra). Így nem volt szignifikáns különbség a rostos diszplázia és az ozmotikus fibroma között egyetlen tesztelt fehérje csontmátrix eloszlásában sem, kivéve az osteocalcin-t.
Teljes méretű kép
GNAS mutáció detektálása rostos diszpláziában és izolált fibromákban PCR-RFLP-vel
Negatív kontrollként normál csontból származó DNS-mintákat (3a. Ábra, 1-3., 7-9. Sávok) és osteofibrialis dysplasia-t (3a. Ábra, 4., 5., 10., 11. sáv) használtunk. 18 Amikor a PCR-t PNA nélkül végeztük, negatív kontrollokban 88 bp-os amplifikált fragmenst generáltunk. PNA hozzáadásával a PCR-hez az amplifikált sávok intenzitása körülbelül 40-60% -kal csökkent. Az Eag I kezelés után az amplifikált 88 bp-os fragmenseket teljesen felemésztettük két 74 és 14 bp-os fragmensre, függetlenül attól, hogy PNA volt-e jelen (3a. Ábra, 1-5, 7-11 sávok). A további szekvenciaelemzés nem mutatott ki GNAS mutációt ezekben a DNS mintákban (az adatokat nem mutatjuk be).
Teljes méretű kép
Az extragnatikus polyostoticus fibrosus dysplasia paraffinblokkjából származó DNS-mintát (3. beteg) használtunk pozitív kontrollként. PNA hiányában az Eag1 emésztés után mutáns és vad típusú alléleknek megfelelő hasítatlan 88 bp és 74 bp sávok láthatók (3a. Ábra, 12. sáv). PNA jelenlétében csak a hasítatlan 88 bp sáv volt látható az EagI hasítás után, és nem a hasított 74 bp sáv (3a. Ábra, 6. sáv). Ezek az eredmények mutáns allélek szelektív amplifikációját mutatják PNA jelenlétében. 20
PCR analízist végeztünk négy extragnatikus rostos diszplázia, öt rostos fibrózis diszplázia és öt ozmotikus fibroma esetében. Az extragnatikus vagy a gnat fibrózisos dysplasia mind a kilenc esetben az Eag I-gyel emésztett 88 bp-os fragmenseket nem amplifikálták (3b. Ábra, 1–4. Sáv: extragnatikus fibrózisos dysplasia; 5–9: gnat-fibrózisos dysplasia). Ezzel szemben az Eagle kezelése öt csontosodó fibroma mintával a 74 és 14 bp fragmensek teljes hasítását eredményezte (3b. Ábra, 10–14 sáv). A szekvenciaelemzés a GNAS mutációkat tárta fel az Arg201 kodonban mind a kilenc fibrosus dysplasia esetében, de a csontosodó fibroma minták egyikében sem (1. táblázat).
vita
A csontosodó fibroma és a rostos diszplázia radiológiai és szövettani hasonlóságuk miatt gyakran diagnosztikai dilemmát jelent mind az orvosok, mind a patológusok számára. Voytek és mtsai. 21 beszámolt arról, hogy a szignifikáns ozmotikus fibromák szövettani vizsgálataiktól teljesen nem különböztethetők meg a fibrosus dysplasia-tól. Ezek az elváltozások szintén jelentős radiográfiai átfedést mutattak. 21 Felvetették, hogy e hasonlóság miatt a csontosodó fibroma és a rostos diszplázia betegségnek tekinthető az egyik morfológiai spektrum mindkét végén. Egy másik jelentés szerint a csontosodó fibroma a rostos dysplasia egyik változata, nem pedig egy másik betegség. Ez a tanulmány egyértelműen bizonyítja, hogy az oszteokalcin immunhisztokémiai elemzése és a GNAS-mutációk PCR-analízise hasznos módszer a kettő megkülönböztetésére, és emellett arra utal, hogy valószínűleg különböző betegség-entitások.
A rostos diszpláziát szövettanilag a sztromális fibroblasztok termelik, amelyek csontmátrixot termelnek, anélkül, hogy morfológiai bizonyítékot mutatnának az oszteoblasztos sejtek a csontszépek perifériáján. Ezeknek a fibroblasztos sejteknek az oszteoblaszt jellegét elektronmikroszkópos elemzéssel javasolták, amely az abnormális oszteoblasztok bélését mutatja hasonló érett szövet körüli fibroblasztokkal, 7 és biokémiai elemzés, amely az alkalikus foszfatáz aktivitás növekedését mutatja a fibrotikus területeket kitöltő sejtekben. rostos dysplasia. Ebben a vizsgálatban a fibroblaszt sejtmagok, valamint a csontfelszíni sejtek a Runx2, az oszteogén vonal fontos transzkripciós faktorának erős expresszióját mutatták, ami arra utal, hogy ezek a sejtek osteogén prekurzorok. Hasonlóképpen, a csontosodó fibromában lévő fibroblaszt sejtek a Runx2 erős expresszióját mutatták ki a magban is. Így mindkét elváltozás sejtbetegségként értelmezhető az oszteogén vonalon.
Az osteogén markerek, például az osteopontin és a DMP1, immunhisztokémiai elemzése nem mutatott nagy különbséget a rostos dysplasia és az ozmotikus fibroma között; az osteocalcin immunhisztokémia azonban szignifikáns különbséget mutatott a kettő között. Az osteopontin, az osteocalcin és a DMP1 a normál csontmátrix bőséges, nem kollagén fehérjéi. 23., 24., 25. oszteokalcin, a leggyakoribb 24 nem kollagén fehérje, a normál 25 csontban oszlik el, és bebizonyosodott, hogy génkiütéses technológiával a csontképződés negatív szabályozója. Az oszteokalcin bősége a rostos diszpláziában és hiánya a csontosodó fibromában arra utal, hogy a meszes anyag a rostos diszpláziában jobban hasonlít a normál csonthoz, mint a csontosodó fibromához. Ez a jelentős különbség jelezheti a csontképződés és az oszteoblaszt-differenciáció különbségeit a két elváltozás között.
Az Arg201 kodonon végzett GNAS-mutációk elemzése hasznosnak bizonyult a csontosodó fibrózis és a rostos dysplasia megkülönböztetésében. A rostos dysplasia mutációinak szomatikus jellege megnehezíti azok azonosítását, mert a mutációk még az érintett szervekben sincsenek jelen az érintett betegek összes sejtjében. Ezért ebben a vizsgálatban a PNA-befogó módszert alkalmazták. 15, 20 A PCR-amplifikált fragmensek szekvenálása megerősítette a PNA alkalmazásával végzett PCR-elemzés pontosságát, ami arra utal, hogy az ebben a vizsgálatban használt PCR-analízis hasznos és könnyen elérhető módszer lehet a GNAS-mutációk kimutatására az Arg201 kodonban. .
A közelmúltban publikálták a tumor szuppresszor gén HPRT2 változását az ozmotikus fibromában. A HPRT2 közvetlen szekvenálása mutációkat mutatott ki a mióma csontosodásának négy esetéből kettőben. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a HPRT2 mutáció nem gyakori a csontosodó fibroma kialakulásában, ezért nem használható markerként a diagnózis felállításához.
Összegzésképpen elmondható, hogy a rostos diszplázia és a csontosodó fibroma hasonló betegség-entitás, mivel mindkettő olyan markert mutat, amely összhangban áll a sztrómás fibroblaszt-szerű sejtjeiben az oszteogén vonallal. Azonban különböznek a csontmátrix pontos összetételében, amit az osteocalcin immunhisztokémiája bizonyít. Végül az Arg201 kodon GNAS-mutációinak PNA-val történő PCR-analízise potenciálisan hasznos módszer a kettő megkülönböztetésére.