Összegzés:

A csontvelő T-sejt-kimerülése ellenáramú centrifugális elutrációval csökkenti a graft-versus-host betegség (GVHD) kockázatát. A graft meghibásodásának és relapszusának magas aránya miatt azonban az elutráció önmagában nem javította a túlélést. II. Fázisú klinikai vizsgálatot végeztünk 54 gyermekgyógyászati ​​betegen annak eldöntésére, hogy a CD34 + szelektálása a pluripotens őssejtek kissejt-frakcióból történő megmentésére javítja-e az adhéziót. A feldolgozott graftok átlagosan 5,5x107 sejt/kg IBW-t, 4,7x106 CD34 + sejtet/kg IBW-t és 6,3x105 CD3+ sejtet/kg IBW-t tartalmaztak. A betegek 16 napos mediánnál> 500-as ANC-t, 28 napos mediánnál pedig> 20 000-es vérlemezkeszámot értek el. A klinikailag szignifikáns GVHD előfordulása 19% volt. Összesen 10, ebbe a vizsgálatba bevont betegnél fordult elő graft meghibásodás, a 14 betegből nyolcat olyan jóindulatú indikációkra ültettek át, amelyeket nem lehetett stabilan megállapítani. A graft meghibásodása statisztikailag szignifikánsan összefüggött egy nem diagnosztizált diagnózissal (P 3, 4, 5, ez a megközelítés a transzplantációval összefüggő morbiditás és mortalitás fokozott kockázatát hordozza magában.

Az ellenáramú centrifugális elutráció (CCE) elválasztja a csontvelő sejteket az ülepedési tulajdonságok alapján, és bebizonyosodott, hogy szinte teljes sejt-helyreállítást biztosít több méretfrakcióban. 6 A limfocitákat kis és közepes sejtfrakciókra választják szét, míg a nagysejt-frakció a CFU-GM legnagyobb részét tartalmazza a csontvelő-gyűjteményben, és a limfociták 100-1000-szeresen kimerültek. Az intézményben végzett korai vizsgálatok kimutatták, hogy ha a graft egyedüli komponenseként egy nagy sejtfrakciót használnak, akkor a klinikailag jelentős GVHD előfordulása jelentősen csökkenthető. A graft meghibásodásának előfordulása azonban 10% -ra nőtt. Azok a betegek, akik alacsonyabb dózisú limfocitákat kaptak (5x105 versus 1x106 limfociták/kg ideális testtömeg), késleltetett granulociták és vérlemezkék tapadását tapasztalták, és a csontvelő RFLP elemzésével meghatározták a kevert hematopoetikus kiméra gyakoriságát. Bár más kutatók a graft meghibásodási arányáról számoltak be, csupán CCE mellett, 5, 10 ez az arány magasabb, mint a nem manipulált velőtranszplantációnál. 11, 12

1990-ben Jones és mtsai. A 13. ábra egérmodellben megmutatta, hogy a sikeres beültetéshez két sejtcsoportra van szükség: elkötelezett progenitorok, amelyek kezdeti, de nem karbantartott graftokat hoznak létre, és pluripotens hematológiai őssejtek (PHSC), amelyek késleltetett és tartós beültetést biztosítanak. Ezek a PHSC-k a kissejt-elúciós frakciókban a limfocitákkal kopulálnak, és így kiválasztódnak a TCD allograftból. Ennek alapján egy I. fázisú vizsgálatot dolgoztunk ki CD34 + szelekcióval, hogy az eluált kis limfociták frakciójából PHSC-t nyerjünk. 14 A kicsi CD34 + sejtek megmentése jelentősen lerövidítheti a beültetés idejét, miközben a standard TCD elutrációval megfigyelt alacsony GVHD incidencia megmarad.

A II. Fázisú klinikai vizsgálatokat ezután elvégezték a T-sejt-depléció, a CD34 + csontvelő szerepének egyeztetett testvérekben és a nem kapcsolódó transzplantációkban való további tisztázása érdekében. Egy 15, 16 éves felnőtteken végzett vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az akut és a krónikus GVHD egyaránt szignifikánsan csökkent, és hogy a CD34 + őssejt-szelekció gyors ojtással és rövidebb kórházi felvétellel társult. A graft meghibásodásának 3,6% -os előfordulási gyakorisága magasabb volt, mint a manipulálatlan csontvelő-transzplantációknál megfigyelteknél, 11, 12, de öt betegből négynél ismert rizikófaktorokkal magyarázható. Három AML-es beteg transzplantációt kapott egy csontvelő donortól a transzplantáció előtt, ezért specifikusan alloimmunizálták őket. A negyedik betegnél 3 éves anamnézis volt aplastikus vérszegénység, amely myelodysplasticus szindrómává (MDS) fejlődött. Ötödik betegnél késõbbi transzplantátum-elégtelenség tapasztalható> 155 nappal a BMT után ismert fertõzés vagy GVHD hiányában, és ennek a kudarcnak az okai nem ismertek.

A CD34 + őssejt-szelekciós elutráció technikáját mostanra tanulmányozták allogén BMT-n áteső gyermekgyógyászati ​​betegeknél, és ennek a II. Fázisú klinikai vizsgálatnak az eredményeit itt mutatjuk be. A felnőttekhez hasonlóan ezeknél a betegeknél is jelentősen csökkent a klinikailag jelentős GVHD és a transzplantációig eltelt idő. Azonban a graft meghibásodásának jóval magasabb előfordulási gyakoriságát figyelték meg ebben a populációban, különösen azoknál a gyermekeknél, akiknél jóindulatú örökletes rendellenességek miatt BMT-t végeztek.

Anyagok és metódusok

A beteg jogosultsága

1995. január 1. és 2000. augusztus 31. között a 6 hónap és 21 év közötti gyermekeket, akik megfeleltek a specifikus diagnosztikai és alkalmassági kritériumoknak, bekerülték a három intézményi protokoll egyikébe, ugyanezt a graft kezelést alkalmazva. Az ilyen kezelési protokollokba beiratkozott betegek megfeleltek a megállapított betegség- és alkalmassági kritériumoknak: 6 hónapnál idősebb életkor; megfelelő tüdőfunkciós teszt (az előre jelzett érték> 75% -a); ejekciós frakció> 50% echocardiogrammal vagy MUGA-val kimutatva; megfelelő májfunkció, amint azt a bilirubin-17-metilprednizolon 10 mg/kg dózisban jelöli a transzplantációt megelőző napokon −3, −2 és −1 a maradék gazda limfociták eltávolítására; metilprednizolon 0,5 mg/kg/nap iv dózisban 7-14 napig és 1,0 mg/kg/nap iv dózisban a 15-28. napig; orális prednizon 0,8 mg/kg/nap dózisban a 29. és 42. nap között, 0,5 mg/kg dózisban 43 és 56 nap között, 0,2 mg/kg/nap dózisban 57 és 71 nap között, és 0,2 mg/kg dózis minden nap másnaptól kezdve. 72-79. A szteroidokat 79 nap után abbahagyták, amikor az ACTH stimulációs teszt endogén szteroidtermelést mutatott.

CCE és CD34 + szelekció

A sejtek CCE általi elválasztását fentebb leírtuk. 18 Buffy-köpeny csontvelő sejtet készítettünk COBE Spectra aferézis rendszeren, amelyet csontvelő feldolgozására állítottunk fel (COBE BCT, Lakewood, CO, USA). A betakarított mononukleáris sejtek 96% -át tartalmazó sejteket ezután egy Beckman JE-10x elúciós rotorba és kamrába (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA) helyeztük 20 ° C-on, 50 ml/perc áramlási sebességgel és rotorsebességgel. 3000 fordulat/perc sebességgel. Három frakciót gyűjtöttünk: (1) egy kis sejtfrakció, amely vörösvértestekből és kicsi limfocitákból állt; (2) középső sejtfrakció, amely nagy limfocitákból, granulocitákból és monocitákból áll; és (3) nagy rotorfrakció, amely granulocitákból, monocitákból, blasztokból és 11-ből áll. Az elutrálás után a telítő frakciót, valamint a kis és közepes méretű frakciókat egyesítjük és inkubáljuk az egér anti-CD34 antitestjével. A sejteket ezután betöményítettük, mostuk és újraszuszpendáltuk, és a CD34 + sejteket összegyűjtöttük egy automatizált Ceprate SC őssejt-koncentrátor alkalmazásával (Cellpro, Bothell, WA, USA). A CD34 + sejtek tisztaságát áramlási citometriával ellenőriztük phycoerythrin-konjugált monoklonális antitesttel a CD34 (HPCA-2) és CD-3 ellen, valamint fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált monoklonális antitesttel, amely felismerte a CD45-et (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) .,

A donor graft értékelése

A kezdeti adherenciát a hematológiai paraméterek napi értékelésével és a csontvelő vizsgálatával határoztuk meg, ha azt a klinikai lefolyás diktálta. A neutrofil beültetési napot az egymást követő három nap közül az elsőként határoztuk meg, ANC> 500-nál. A graft tartósságát a transzplantáció után +30, +60, +90, +180, valamint 1 és 2 évvel értékeltük. A kimérizációs elemzést XY FISH-mal (nem szexuálisan egyező donor) vagy RFLP/DNS-próba-analízissel (azonos nemű donor) végeztük. A beültetést úgy határoztuk meg, mint 30 napon belüli gyógyulás,> 95% donor kiméra mellett. Minden beteget, aki nem felelt meg ennek a kritériumnak, grafthiányos betegként sorolták be. A másodlagos graft meghibásodást a donor kiméra elvesztésének vagy tartós csökkenésének definiálták az elsődleges beültetés után.

statisztikai módszerek

A sejtek száma megközelítőleg normálisan oszlott el a logaritmikus transzformáció után. Ezért megadjuk a sejtek geometriai átlagát, és az összes statisztikai elemzés során a log-transzformált sejtek számát használtuk. Az események idejét a halál időpontjában cenzúrázott betegek BMT dátumától vagy az utolsó követés időpontjától mértük. Az esemény időbeli eloszlását a Kaplan és Meier termékkorlát 19. módszerével, a konfidencia intervallumokat pedig Greenwood 20. képletével határoztuk meg. A GVHD dátumát és stádiumát a kezelőcsoport vagy a GVHD csoport határozta meg, és a közzétett kritériumok szerint rögzítették. 21 A pácienseket akut GVHD szempontjából értékelték, ha a BMT után a 30. nap után túléltek, vagy a 30. nap előtt GVHD alakult ki. A BMT után 90 nappal túlélő betegeket krónikus GVHD-ben értékelték. Fisher pontos tesztjét és Wilcoxon kiértékelési tesztjeit használtuk a heterogenitás meghatározásához. A két átlag összehasonlításához Student t-tesztjét használtuk. Az elemzést STATA statisztikai szoftver segítségével végeztük.

az eredmény

Klinikai jellemzők

1995 januárja és 2000 augusztusa között 79 gyermekgyógyászati ​​betegen esett át kezdeti allogén BMT a Johns Hopkins Gyermekközpontban. Ebből a 79 betegből 58-at vettek be a három intézményi protokoll egyikébe, azonos módszerekkel a TCD és CD34 + őssejtek kiválasztására. A beiratkozott betegek közül négyen végül nem megfelelő sejteket kaptak a nem megfelelő sejtszám miatt (

magas

A graft idő és a sejtdózis kapcsolata. a ) összefüggés a mononukleáris sejtek teljes dózisa és a vérlemezkék helyreállítása között; ( b ) összefüggés a CD34 + sejtdózis és a vérlemezkék helyreállítása között; ( c ) összefüggés a CD3 + sejtdózis és a vérlemezkék helyreállítása között; ( d ) összefüggés a mononukleáris sejtek teljes dózisa és a neutrofil regeneráció között; ( e ) összefüggés a CD34 + sejtdózis és a neutrofil regeneráció között; ( f ) Korreláció a CD3 + sejtdózis és a neutrofil regeneráció között.

Teljes méretű kép

elkapni

A CD34 + szelekcióval fokozott elutrált allograftok alkalmazása ebben a betegpopulációban a medián neutrofil beültetést (ANC> 500) eredményezte 16 napon (95% CI: 15-17 nap) és a vérlemezke tapadást 20 000 fölött 28 napon (95% CI: 22, 5–32 nap). Ebben az időszakban kontrollálatlan graftot kapó gyermekgyógyászati ​​betegeknél a neutrofilek helyreállításának medián ideje 19 nap volt (95% CI: 17–21,5), és a vérlemezkék helyreállításának medián ideje 24,5 nap (95% CI: 21–28). A neutrofilek helyreállításáig eltelt idő statisztikailag szignifikánsan gyorsabb volt az eluált graft befogadóknál (P = 0,009), de nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a vérlemezkék helyreállítási arányában (P = 0,37). Nem volt kapcsolat a transzplantációs idő és a sejtdózis között (1. ábra).

Előtolás meghibásodás

Az elutrált, tágult CD34 + allograftot kapó 54 gyermekbeteg közül 10 gyermek (18,5%) graftelégtelenségben szenvedett. A graftelégtelenségben szenvedő betegek transzplantációs jellemzőit a 3. táblázat részletezi. Ebben az időszakban kezeletlen velővel kezelt gyermekek egyike sem mutatott graftelégtelenséget. A transzplantátum kudarcát statisztikailag szignifikánsan összefüggésbe hozták egy nem diagnosztizáló alapdiagnózissal (P 15 jelentése szerint ezt a szövődményt nagyrészt legyőzte a CD34 + őssejtek általi allograft-fokozás. A vizsgálatban azonos felnőtt testvér-transzplantációval és graftszerű manipulációval kezelt 110 felnőtt beteg közül csak öt betegnél (4,5%) volt a graft meghibásodása, és öt betegből négyben a graft meghibásodását ismert rizikófaktor magyarázta, ideértve az aplastikus vérszegénységet, a transzplantáció előtti kiterjedt lemeztranszfúziókat vagy a donor hisztokompatibilitási antigének iránti korábbi érzékenységet. betegek.

Az itt leírt 10 gyermek transzplantációs elégtelenségben szenvedő beteg közül nyolcan végeztek BMT-t jóindulatú betegségek miatt. A korai graft meghibásodásának hét esetét nem lehet megmagyarázni a graft elégtelen sejtszámával. A mononukleáris sejtek átlagos száma ebben a betegcsoportban magasabb volt, mint az eluált graftok teljes csoportjában (6,38x107 vs 5,5x107), a legalacsonyabb dózis pedig 2,95x107 mononukleáris sejt/kg IBW volt. Hasonlóképpen, az átlagos CD34 + szám és az átlagos CD3 + sejtszám magasabb volt a graftelégtelenségben szenvedő betegeknél, mint az egész vizsgálati csoportban. A graft meghibásodásainak egyikét sem magyarázta korábbi HLA-szenzibilizáció. Bár mindkét thalassémiában szenvedő beteg számos transzfúziót kapott a vörösvérsejtekből az átültetés előtt, egyik sem csontvelő donorból származott. Ezenkívül a négy beteg közül senki sem kapott vérlemezke-transzfúziót a BMT előtt.

Mind a 10 beteg, akinél a graft meghibásodott, GSA-profilaxist kapott CSA-val, és négy, rokon vagy inkoherens családi HLA-donorral rendelkező beteg profilaktikus szteroidokat kapott. A terápiás CSA szintet minden betegnél fenntartották. Egy betegnél klinikailag jelentős GVHD alakult ki. A gazdaszervezet és a transzplantátum közötti alloreaktivitás egyensúlyhiánya elutasításra hajlamosít, míg a GVHD a donor transzplantátumot részesítené előnyben. Ennek a páciensnek csak limfoid kimérizmusa volt, és a refrakter GVHD mentő terápiája erősen limfotoxikus volt.

Vizsgálatunkban 12 donorpárból hat - férfi betegekkel és női donorokkal rendelkező recipiensek - graftelégtelenséget tapasztaltak. A nemek közötti eltérés és a nem beültetés közötti összefüggés megközelítette a statisztikai szignifikanciát, P értéke 0,07 volt. Más szerzők összefüggést találtak a graft meghibásodása és a nemek közötti eltérés között a TCD-transzplantációkban, 23, 24, de a kapcsolat kifejezettebb volt a donoros férfiaknál. Hasonlóképpen, az ebben az intézményben végzett BMT-vizsgálat súlyos aplastikus vérszegénységre vonatkozóan megnövekedett kilökődés kockázatát állapította meg, amikor a betegek férfi donoroktól kaptak csontvelőt. 25 A vér- és csontvelő-transzplantációval foglalkozó európai csoport jelentése a Fanconi-vérszegénység független donorátültetéseiről 26 a női donoroknál magasabb arányban mutatta az elsődleges graftelégtelenséget, de ezt a megállapítást a női csontgraftsejtek alacsony számának tulajdonították. Ez nem történt a graft meghibásodott betegeinknél és donorjainknál.

A vírusfertőzés összefüggésbe hozható a graft meghibásodásával, és egy SCID-ben szenvedő beteg dokumentálta az A influenzát a transzplantáció után 1 nappal kapott köpettenyészetből. A három transzplantáció előtti, nagy dózisú citoxán kondicionáláson átesett beteg közül kettőnél BK vírus-pozitív haematuria alakult ki, de nincs összefüggés a BK vírusfertőzés és a graft meghibásodása között. Korai CMV antigént detektáltak egy ALD-ben szenvedő betegnél 1 hónappal a graft kilökődése előtt, és megfelelően kezelték ganciklovirral, citopéniák vagy CMV-kór kialakulása nélkül.

A thalassemia esetén a graft meghibásodása jól leírt kockázat, az előfordulás gyakorisága az 1. és 2. osztályú betegek 7% -ától a 3. osztályú betegek 22% -áig terjed. 27, 28, 29, 30 Noha sorozatunkban a BMT-n átesett thalassemiás betegek száma túl kicsi a statisztikai szignifikancia eléréséhez, a graftelégtelenség incidenciája négyből háromnál klinikailag fontos és sokkal magasabb, mint azt a jelenlegi szakirodalomban korábban gondolták . Ezen túlmenően mind a három thalassemiás beteget, akiknél a graft meghibásodott, az 1. osztályba sorolták, és ezért a graft meghibásodásának várható kockázata csak 7% volt. Érdekesség, hogy sorozatunk egyik olyan beteget, aki állandó ragaszkodást ért el, a 3. osztályba sorolták.

Azáltal, hogy a CCE-t alkalmaztuk a T-sejt csontvelőtranszplantáció kimerüléséhez és az áramlási citometriához, hogy megmentsük a CD34 + őssejteket a limfocitában gazdag frakcióból, sikerült elérnünk a donor csontvelő gyors tapadását, miközben alacsony volt a klinikailag súlyos GVHD aránya. Ez a graftmanipulációs módszer a T-sejtek 200-szoros csökkenését eredményezte a kezelés előtti betakarításhoz képest, és a CD34 + őssejtek kétszeres növekedését eredményezte az eluált rotorfrakciókhoz képest. CD34 + őssejtek hozzáadása az allografthoz megakadályozta a késleltetett transzplantátumot egyetlen elutrált csontvelőben. Betegeink medián időt mutattak a neutrofilekig (ANC> 500) és a vérlemezkékig (> 20 000 transzfúzió nélkül 7 napig) 16 és 25 napon. Ezek az eredmények hasonlóak O'Donnell és munkatársai által leírtakhoz azoknál a felnőtt betegeknél, akik megfelelő testvér-transzplantáción estek át hasonlóan előkészített allograftokkal.

A klinikailag szignifikáns GVHD (19%) előfordulása ebben a vizsgálatban alacsony volt. HLA-val nem összefüggő BMT-n átesett betegeknél a klinikailag szignifikáns GVHD aránya meghaladta a 75% -ot kezeletlen graftokban és CSA/methotrexate profilaxisban. Bár bizonyos fokú GVHD kívánatos a vele járó graft-versus leukémia hatás miatt, a pontos GVHD-titrálás nehéz. A GVHD ezért továbbra is a morbiditás és a halálozás fő oka a nem rokon transzplantációkban. Ebben az intézményben egy egyszerű TCD alkalmazása 25% alá csökkentette a klinikailag jelentős GVHD előfordulását. Az egyszerű TCD azonban a graft meghibásodásának magasabb előfordulási gyakoriságával (10%) társult, ezért nem vezetett a túlélés általános javulásához. A CD34 + augmentáció együttes alkalmazása elutrációval lehetővé tette számunkra, hogy gyors és tartós tapadást érjünk el, miközben a súlyos GVHD alacsony arányát fenntartjuk. Egy párhuzamos vizsgálatban felnőtt testvéreken, akik megfelelő testvér-transzplantáción estek át, O'Donnell és mtsai. A klinikailag jelentős GVHD-k csupán 11% -áról számoltak be. Ezek az eredmények összhangban vannak a rokon és nem rokon transzplantáción átesett gyermekgyógyászati ​​betegeknél megfigyelt 19% -os rátával. Mindkét tapasztalat jelentős javulást jelent a manipulálatlan BMT-grafttal szemben.

Ebben a 54 gyermekgyógyászati ​​betegen végzett vizsgálatban a CD34 + augmentációval járó TCD gyors tapadást és alacsony klinikai jelentőségű GVHD-t eredményezett a hematológiai rosszindulatú daganatokban szenvedő betegeknél. Jóindulatú betegségben szenvedő betegeknél azonban azon betegek egy része, akiknél a GVHD megelőzése a legkívánatosabb, mivel a graft versus leukémiával nem jár együtt, ez a graft manipulációs technika a graft meghibásodásának jelentős kockázatával társult. Ennek a megállapításnak a lehetséges magyarázata több intakt immunitás lehet, mint az erősen előkezelt leukémiás betegek, és a több vörösvérsejt-transzfúzióból származó alloimmunizáció. Jóindulatú betegségben szenvedő gyermekeknél csökkenteni kell a graft kilökődésének kockázatát azáltal, hogy preparatív kezeléssel fokozzák az immunelvonást és/vagy javítják a transzplantáció utáni immunszuppressziót. Ezeknek a módosításoknak a célja a CD34 + augmentációs TCD előnyeinek fenntartása, ideértve a gyors transzplantációs időt és a GVHD alacsony előfordulási gyakoriságát, ugyanakkor csökkentve a graft meghibásodásának kockázatát.