absztrakt

A fő

A legtöbb publikált tanulmány csak egy vagy két gént vagy génterméket elemzett a máj steatosisában vagy a NASH-ban, és ezért nem mutatták be a máj ezen gyakran megfigyelt szövettani jellemzőinek potenciális molekuláris változatosságát. A mikroarray technológia és a bioinformatika legújabb fejleményei kimutatták a molekuláris heterogenitást a gén expressziós profiljai alapján az egész genomban. A közelmúltban közzétett mikrorajz adatok szignifikáns különbségeket mutattak a mitokondriális funkció fenntartása szempontjából fontos gének expressziójában a NASH betegek és az egészséges egyének között. 13 Itt összehasonlítottuk az mRNS szintjét a normális májban és a zsíros májban a gyulladás szövettani jele nélkül, hogy jobban megértsük a steatosis fiziopatogenezisét önmagában. .

Anyagok és metódusok

Beteg- és szövetminták

Asztal teljes méretben

Az emberi májbiopsziák szövettani elemzését két független patológus végezte. A steatosis mértékét 1-nek definiáltuk, amikor a hepatociták kevesebb, mint 30% -a mutatott lipid vakuolát, és 2, amikor a hepatocyták 30–60% -a mutatott lipid vakuolákat. A májbiopsziák két csoportját vették figyelembe: az első csoport kilenc májbiopsziából állt, steatosis vagy gyulladás szövettani bizonyítékai nélkül; a második csoport kilenc májbiopsziából állt, amelyek steatosis 1 (n = 5) és 2. fokozatúak (n = 4) voltak. A felhasznált májok egyike sem mutatott fibrózist, sejteket vagy cirrhosist. Az átlagos BMI 26,5 ± 4,3 kg/m2 volt a steatosis csoportban és 22,7 ± 3,0 kg/m2 a steatosis nélküli betegeknél (P 16, 17, 18). Ez az eljárás figyelembe veszi a tesztstatisztikák közös megoszlását. pl. Bootstrap vagy permutáció) ennek az eloszlásnak a becsléséhez.

Az adatelemzést nyílt forráskódú R szoftverrel, 1.9.0 verzióval hajtottuk végre. (CRAN, www.cran.r-project.org). A hierarchikus fürtözéshez a statisztikai csomag hclust függvényét használták. A következő Bioconductor projektcsomagokat (www.bioconductor.org 19) használtuk: affy 20 az adatfeldolgozáshoz, 21 multtest a differenciálisan expresszált szekvenciák azonosításához és anaphy a gén annotációhoz.

Kvantitatív RT-PCR

Asztal teljes méretben

Az MtDNS mennyiségi meghatározása

Az egyes májbiopsziákból (n = 20) és (n = 20) steatosis nélkül kivont teljes DNS-ben a mitokondriális DNS-t (mtDNS) mennyiségileg meghatároztuk a fent leírt módszerrel. Röviden: a nukleáris gént (TaqMan® β-aktin reagens, Perkin Elmer, Courtaboeuf, Franciaország) és a mitokondriális MT-CYB gént (citokróm b vagy cyt b) külön-külön valós idejű kvantitatív PCR-rel számszerűsítettük. A mitokondriális gén citokiójának egy részét specifikus primerekkel amplifikáltuk (2. táblázat). A PCR-keverékek 7 μl vizet, 12,5 μl qPCR Mastermix Plus® reagenst (Eurogentec, Angers, Franciaország), 0,4 pmol/μl minden primert és 0,2 pmol/μl minden próbát tartalmaztak. Minden mintát valós időben PCR-nek vetettünk alá három példányban. Az amplifikációs körülmények megegyeznek a fent leírtakkal. A fluoreszcenciát az egyes hőkezelési lépések végén mértük. Minden ciklusban standard, 10, 100, 1000, 10 000 és 100 000 ekvivalensű nukleáris genom görbét vontunk be, és a β-aktin és a cyt b gének számszerűsítéséhez a nukleáris genom azonos értékeit használtuk. Az adatokat a három párhuzamos mérés mitokondriális DNS (cyt b) átlagértékének és egy adott kivonat (mtDNS/β-aktin) három ismétléses mérésének nukleáris DNS (β-aktin) átlagértékének arányában fejeztük ki.

immunhisztokémia

A műtéti patológiák készleteiből összesen 34 formalinnal fixált májszövet nyert, amelyeket számítógépes adatbázis segítségével azonosítottunk immunhisztokémiai elemzések elvégzésére. 11 steatosisos májmintát, 11 steatosis nélküli májmintát, négy HCV-fertőzött májban steatosisos máj és nyolc steatohepatitis mintát mutattak a túlzott alkoholfogyasztás (n = 4) vagy az elhízás (n = 4) miatt. A szöveti mikroarray konstrukciót Kononen és mtsai. Mindegyik esetben a májszövet triplettje volt 0,6 mm átmérőjű foltokként. Az immunfestést standard avidin-biotin-peroxidáz technikával hajtottuk végre, antigéngyűjtéssel a vizsgált antitestnek megfelelően. Az elsődleges antitestek a mitokondriális antigén elleni monoklonális antitestek voltak (1:50 hígítás, 113-1. Klón; Biogenex, San Ramon, Kalifornia, USA), anti-TGFB1 poliklonális antitestek (sc-82) (1: 100 hígítás, Santa Cruz, CA)., CA, USA), anti-IL1-R1 (1: 400 hígítás; AB-269-NA, R&D System, Lille, Franciaország) és anti-IGF2 (1: 800 hígítás; AF-292-NA, R&D System, Lille, Franciaország). A kromogénként a diaminobenzidint, a mag kontrasztanyagaként pedig a hematoxilint használták. Negatív kontrollok esetén az elsődleges antitestet vagy kihagytuk, vagy ugyanazon faj normál IgG megfelelő koncentrációjával helyettesítettük. Az elemzés szintén leíró és félkvantitatív volt, figyelembe véve a jel sejtjének elhelyezkedését a 0 (festés nélkül), 1 (a sejtek kevesebb mint 25% -a), 2 (a A sejtek 25 és 75% -a). ) és 3 (több mint 75%). Az immunfestés intenzitását szintén 1-re (gyenge), 2-re (közepes) és 3-ra (erős) értékeltük. A mintánkénti három mag elemzése hasonló volt, és az összes antitest egyenletes színeződését mutatta az összes antitest esetében, kivéve a mitokondriális antigén elleni monoklonális antitestet; átlagos pontszámot határoztak meg. Az összes szakaszt két patológus függetlenül értékelte.

Statisztikai analízis

A nem zsíros májcsoportban és a zsírmáj csoportban kiszámítottuk az átlagot és a szórást, és az eredményeket összehasonlítottuk a Student t-tesztjével (a = 0,05). Az immunokémiai eredményeket összehasonlítottuk a χ 2 teszttel (α = 0,05).

az eredmény

Gén expresszió

A májbiopsziákat a máj steatosisának jelenléte vagy hiánya, valamint a gyulladás mikroszkopikus jeleinek hiánya alapján választottuk ki. Egyik minta sem mutatott fibrózis, test vagy cirrhosis jeleit. RNS-t nyertünk az emberi máj 18 biopsziájából (kilenc és kilenc máj steatosis nélkül); a két csoport nem különbözött attól, hogy a BMI szignifikánsan magasabb volt a máj steatosisban szenvedő betegek csoportjában.

Az egyes májbiopsziák RNS-jét körülbelül 22 300 humán transzkriptumot tartalmazó Affymetrix HG-U133A GeneChipszel hibridizáltuk. A májminták hierarchikus csoportosulásának génszelekció nélküli agglomerálásával kapott dendrogramot az 1. ábra mutatja. Kilenc steatotikus májminta csoportosult, míg kilenc normál májminta heterogénebb génexpressziós profilú volt.

humán

Normál és steatotikus májminták hierarchikus összesítése. Az agglomerációs hierarchikus klaszterezést gének előzetes kiválasztása nélkül hajtották végre, euklideszi távolságot használva a minták közötti különbség és az átlagos asszociáció mérésére a két klaszter közötti különbség mérésére. "N" jelentése normál májminta és "S" jelentése szteatotikus májminta.

Teljes méretű kép

Összhangban a lépcsőzetes maxT többcsaládos hibakontroll vizsgálati eljárásokkal (Wise Error Wise Error 5%, azaz 5% valószínűséggel legalább egy I. típusú hiba van), 110 szekvenciát találtak differenciálisan expresszálva normál és steatotikus májmintákban . Ezek közül 100 szekvenciát túlexpresszáltak és 10-et nem expresszáltak szteatotikus májmintákban. A túlexpresszált és nem expresszált szekvenciák listáját a 3. táblázat tartalmazza. A 2. ábra mutatja ennek a 110 szekvenciának az expressziós profilját 18 májmintában.

Asztal teljes méretben

110 differenciálisan expresszált szekvencia (FWER = 0,05) expressziós profilja kilenc normál és kilenc steatotikus májmintában. Minden sor a próba szekvenciát, minden oszlop pedig egy májmintát képvisel. Az expressziós mértékeket az egyes próba-szekvenciákra (azaz a standardizált sorokra) standardizáltuk. A zöldtől a pirosig paletta az expressziós szintek kifejezésére szolgál, a zöld az alul-, a piros pedig a túlexpressziót jelöli. A génneveket a 2. táblázat sorolja fel. "N" jelentése normál májminta és "S" jelentése szteatotikus májminta.

Teljes méretű kép

A géneket funkciójuk szerint kilenc családba sorolták (3. táblázat). Ezen családok egyike tartalmazta a mitokondriális légzési lánc fehérjéit kódoló géneket, valamint a lipidanyagcserében és a kreatinszintézisben részt vevő enzimeket. Egy másik családba tartoztak az ion transzportereket, a lipid transzportereket kódoló gének (az apolipoprotein C-IV részt vesz a nagyon kis sűrűségű lipoproteinek termelésében, míg az apolipoprotein E és az 1 típusú scavenger B receptorok részt vesznek a szelektív koleszterinfelvételben). A legtöbb differenciálisan expresszált gén a transzkripciós faktorok (mag- és mitokondriális transzkripciós faktorok) vagy kódolt fehérjék családjába tartozott, amelyek részt vesznek a sejtciklus-szabályozásban (szignáltranszdukció, apoptózis és a sejtciklus), a fehérje-módosításokban és az extracelluláris mátrix átalakításában. Két géncsoport kapcsolódik a DNS károsodásának helyreállításához vagy a gyulladásos utakhoz; ezek a TOLLIP, az egyetlen Ig-rel kapcsolatos IL-1R molekula (SIGIRR) és a TGFB1 .

Mitokondriumok és mitokondriális DNS tartalma normál és zsíros májban

Valós idejű kvantitatív PCR-t használtunk az mtDNS és a DNS arányának meghatározására 40 májbiopsziában, beleértve 18 génprofiláló biopsziát és 22 további mintát. Az mtDNS és a DNS-tartalom átlagos aránya 0,67 ± 0, 10 és 1, 12 ± 0, 14 volt a steatosis nélküli és biológiai májbiopsziák csoportjában (P = 0,011, 4. táblázat). Ezt az eredményt alátámasztották a mitokondriumok immunfestésével szöveti mikroarray elemzéssel (3. ábra). Valójában a zsírcseppek hepatocitáiban (makrovesicularis steatosis) a mitokondriumok számának növekedését figyelték meg mély festéssel és a barna foltok számának számlálásával (3c. És d. Ábra). Normál májban a festék átterjedt a májszövetre (3a. És b. Ábra). A festés félkvantitatív értékelése szignifikáns különbséget mutatott a két csoport között (11 pozitív májból két pozitív minta, szemben 11 zsíros máj kilenc pozitív mintájával; χ 2; P

Példák a mitokondrium (barna) immunfestésére specifikus anti-mitokondriális antitesttel normál májban ( a, b ) és a makrovesicularis steatous májban ( c, d ) egy szöveti mikrochipből. A magot hematoxilinnel (kék) festették. a ) Az immunfestés a normál májszövetben (× 20) terjed, a portális vénát elhagyva. ( b ) (× 40) a négyzet nagyítását jelenti a ( a ) és megmutatja a hepatocitákban eloszlott foltot. c ) Az immunfestés a steatosis májszövetére összpontosul (× 20). ( d ) (x 40) a négyzet nagyítását jelenti ( c ), és egy foltot mutat a mag és a vakuola körül, erős festési intenzitással.

Teljes méretű kép

A sztearózissal kapcsolatos génexpresszió validálása más májmintákban

A TaqMan® eljárás segítségével három gént számszerűsítettünk a gyulladásos válaszban, amelyek normális és zsíros májban nagyon szignifikáns differenciál expressziót mutattak (2. táblázat). Feltehetően az egér szignál közbenső ortológusai az evolúcióban konzervált Toll útvonalban (SITPEC), a mítoszokkal interakciós fehérjében (TOLLIP) és a SIGIRR mRNS-ben voltak. Megerősítettük ezen gének mRNS-expressziójának növekedését a zsírmájban a normális májhoz képest (1, 71 ± 1, 03 vs 0, 90 ± 0, 19; 3, 28 ± 2, 24 vs. 1, 41 ± 0, 54; 0, 74 ± 0,30 vs. 0,48 ± 0,24, 4. táblázat). Elemeztük a gének fokozott expressziója és a BMI közötti összefüggést. Csak a TOLLIP mRNS szintek és a BMI közötti összefüggés trendjét figyeltük meg (P = 0,0555). Érdekes volt a mitokondriális antigén, az IL-1R1, IGF2 és TGFB1 expressziójának növekedése a legtöbb HCV-vel kapcsolatos steatosisban és steatohepatitisben. Az IL1-R1 mindig erősen expresszálódott alkohollal társult steatohepatitisben vagy elhízásban és a HCV-vel kapcsolatos steatosis felében (5. táblázat). A 4. ábra az IL1-R1 festés egyenletes elterjedését mutatja a májszövetben. Ezzel szemben az IGF2 normális májban expresszálódott, és csak az immunjelölő intenzitás növekedését figyelték meg.

Asztal teljes méretben

Az IL1-R1 a hepatociták citoplazmájában expresszálódik normális körülmények között ( a ) zsírmájban is ( b ). Az immunreaktivitás intenzívebb a szteatotikus mintákban. ( a, b ) × 20.

Teljes méretű kép

vita

Eredményeink azt is sugallják, hogy az extracelluláris mátrix megváltoztatható az FLD kezdeti lépéseihez képest. Ennek oka lehet az intracelluláris zsírsavak megnövekedett koncentrációja a máj parenchymájában, amelyekről már kimutatták, hogy közvetlenül toxikusak a hepatocitákra, ami oxidatív stresszhez, gyulladáshoz és fibrogenezishez vezet, de nem a mitokondriális toxicitáshoz. Ennek oka lehet olyan gének, mint az IGF2, az IGFB4 és az IGFBP savas labilis egysége, vagy a Claudin 3 vagy a hepsin túlzott expressziója is, amely a TGFB1 Kupffer-sejtek/makrofágok vagy a sztellát sejtek aktivációján keresztül hat, ami az extracelluláris mátrix átalakításához vagy a sejtek aktiválásához vezet, mint a máj regenerációjában. vagy apoptózis aktiválása a májsejtekben a hepatocita súlyának szabályozása érdekében. A 35, 36, 37, 38 TGFB1 és IGF2 fehérje expressziója megnőtt a legtöbb steatosis vagy steatohepatitis mutató mintában, és megerősíti a génexpresszió profilozásának eredményeinket. Az IGF2 nem expresszáló májban történő expressziója azonban nehézségeket okozott az eredmények értelmezésében.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a mitokondriumok a steatosis korai szakaszától kezdve fontos szerepet játszanak, valószínűleg a máj lipid katabolizmusának biztosítása érdekében, fokozott mitokondriális foszforilációval és oxidatív anyagcserével. Bár a májbiopsziákon nem figyeltek meg gyulladás mikroszkópos jeleit, a zsírmájban a gyulladásos utakban részt vevő gének vagy fehérjék fokozott expresszióját és/vagy az extracelluláris mátrix, például a TGFB1, az IL1-R1 és az IGF2 átalakulását figyelték meg. Úgy tűnik, hogy az IL1-R1 szerepet játszik mind a steatosis, mind a steatohepatitis kialakulásában, és korai és pontos markernek tekinthető a NASH kialakulásának kockázatában szenvedő betegeknél.